Bestimmung der Peroxidase-Aktivität

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Nummer 78 November 1971

Aus der Eidgenössischen Anstalt für das forstliche Versuchswesen, Birmensdorf

Der Nachweis unsichtbarer (,,physiologischer") Fluor-Immissions- schädigungen an Waldbäumen durch eine einfache kolorimetrische

Bestimmung der Peroxidase-Aktivität

Von TH. KELLER und H. ScHw AGER

Eingang des Ms. 27. 5. 1971

The detection of hidden F-injury of forest trees by a simple colorimetric determination of peroxidase activity. The paper describes a simple routine method for determining colorimetric- ally peroxidase activity (p. a.) in foliage of forest tree species, including conifers. The effect of factors such as foliage age, F content, external F dust, necrosis etc. on p. a. is investigated.

Analyses of plants exposed at different distances to F exhalates of an aluminum plant show that with decreasing distance F content and p. a. increase. P. a. thus is an indicator of air pol- lution effects on tree physiology even in the range where no visible symptoms of injury occur.

1. Einleitung

Die Kategorie der „unsichtbaren Schädigungen" gehört wohl zu den umstrittensten Kapiteln der Immissionsschadenkunde und hat im Laufe der Zeit auch gewisse Ab- wandlungen der Definition erfahren. Es ist dies nicht verwunderlich, ist doch der Nach- weis von etwas Unsichtbarem mit wesentlichen Schwierigkeiten behaftet. Es ist auch zu- zugeben, daß dort, wo man Rauchschäden nur mit Maßstäben wie Wertminderungen und Zuwachsverlusten messen will, vermutlich die Kategorien „akute" und „chroni- sche" Schädigungen genügen dürften. In diesem Falle geht man aber an einem eminenten forstlichen Problem vorbei und verkennt einen Aspekt, der in zunehmendem Maße weiteren Kreisen bewußt wird: den Aspekt der Qualität des Lebens.

Den Forstleuten, die mit beobachtenden Augen durch ihre immissionsgeschädigten Waldungen gingen, war es seit jeher bewußt, daß die Bäume auch jenseits der Grenze der „chronischen" Schäden schädigenden Einflüssen ausgesetzt waren, welche z. B.

die Vitalität schwächten und die Bäume damit anfälliger machten für sekundäre oder Schwächeparasiten sowie für klimatische Extremeinflüsse; es sei nur an das überhand- nehmen von Borkenkäfern oder die auffallend weite Verbreitung von „Frostschäden"

in Rauchschadengebieten erinnert. Diese Erscheinungen ergaben seit jeher willkommene Alibis für die primären Schadensverursacher, nämlich für die Emittenten, und können zu grotesken Fehlinterpretationen führen, wie z. B. durch BERGE (1970, S. 12), der von „die Immissionsschäden auslösenden ... Umweltfaktoren" schreibt.

In den letzten Jahren ist es stiller geworden um die unsichtbaren Schädigungen, obwohl die Chancen für deren Nachweis dank der Fortschritte der Pflanzenphysiologie größer geworden sind. Noch 1949 glaubte KATZ, ein für allemal die Nichtexistenz un- sichtbarer SO2-Schädigungen bewiesen zu haben, weil er sie mit seiner Methodik nicht zu erfassen vermochte. Auch THOMAS (1956) folgerte aus seinen Untersuchungen der Photosynthese ( die leider keine Waldbaumarten einschlossen), daß es dort keine un- sichtbaren Schädigungen gebe, wo sichtbare Symptome fehlten. BREDEMANN (1956) zweifelte ebenfalls an der Existenz dieser umstrittenen Schadenskategorie.

MrnDLETON et al. (1965) sowie McCuNE et al. (1967?) wiesen darauf hin, daß biochemische Veränderungen des Stoffwechsels in der Zelle zum Nachweis unsichtbarer Schädigungen führen könnten, doch lehnten McCuNE et al. diesen Nachweis gleich- zeitig als zu wenig spezifisch ab, die praktische Bedeutung verkennend.

In Europa sind KocH (1957), H. KELLER (1958), BöRTITZ (1964), VoGL (1964) und andere mit Gaswechselmessungen an Baumarten in den Bereich der unsichtbaren Schä- digungen vorgestoßen und haben letztere auf den URAS-Registrierstreifen sichtbar gemacht. Demzufolge wurden sie als „physiologische" Schädigungen deklariert (V OGL, BöRTITZ und POLSTER, 1965). Im Gegensatz dazu schlossen GunERIAN, VAN HAUT und STRATMANN (1960) nur Beeinträchtigungen des Nutzungswertes der Pflanze in ihre Definitionen der Schädigungen ein, womit die waldbaulich bedeutsame Schwächung der Vitalität mit all ihren Folgen unberücksichtigt bleibt, mindestens in frühen Stadien.

Auch wenn sich BERGE (1970) gegen allgemeingültige MIK-Werte stemmt, mit der Begründung, die pflanzliche Reaktion sei allzu vielen, die Schädigung modifizierenden Umweltsfaktoren ausgesetzt, so sucht man doch allenthalben in den Industriestaaten nach Normen, die auch der Pflanzenwelt zuträglich sein sollten. Die Nichtbeachtung des Bereiches der „ unsichtbaren Schädigungen" führt aber leider dazu, daß man in re- lativ kurzfristigen Begasungsversuchen Schadensymptome zu erzeugen versucht und jene Konzentrationen oft fälschlicherweise als unschädlich betrachtet, welche innerhalb einer gesetzten Frist keine Symptome erzeugen.

Aus der Überlegung heraus, daß möglicherweise vor einer meßbaren Beeinträchti- gung der Photosynthese bereits enzymatische Störungen auftreten können, richtete sich unser Interesse auf einfach zu messende Enzymaktivitäten. Die zusammenfassende Darstellung von TRESHOW (1970) bestärkte uns in dieser Auffassung. Die vorliegende Arbeit wurde besonders stimuliert durch die Untersuchungen von BAR-AKIVA (1961, 1967), dem es gelang, durch Messungen der Peroxidase-Aktivität Spurenelementmängel in Citrusblättern zu diagnostizieren. Ferner ist bekannt, daß Gewebeverwundungen zu erhöhter Peroxidase-Aktivität führen (SHANNON, 1971, mündl. Mitteilung). Nach HEWITT und NICHOLAS (1963, zitiert nach TRESHOW, 1970) soll Peroxidase durch F in vitro gehemmt werden.

Versuche bezüglich der Peroxidase-Aktivität (P.A.) sind schon früher im Zusam- menhang mit SO2-Einwirkungen gemacht worden. Beim Eintauchen von Holz in eine 0,0010/oige SO2-Lösung fand DÄSSLER (1962) eine deutliche Reduktion dieser Enzym- aktivität. Begasungen von Acer negundo- und Betula verrucosa-Pflanzen mit SO2

durch NrKOLAEVSKIJ (1968) zeitigten eine gesteigerte P. A. in Acer-, nicht jedoch in Betula-Blättern.

Die P. A.-Messung beruht auf dem Prinzip, daß Peroxidasen Wasserstoff von einem Donor auf Peroxid als Akzeptor übertragen (AEBI, 1965):

AH2

+

(farblos)

H202 - - - + A

+

2H20 (farbig)

Ist A ein Chromogen, so läßt es sich kolorimetrisch leicht bestimmen.

2. Fragestellung

Verändert sich die Peroxidase-Aktivität (P.A.) in den Assimilationsorganen von Waldbäumen unter dem Einfluß von F-Immissionen?

Verändert sie sich möglicherweise, bevor oder ohne daß sichtbare Symptome (Hy- ponastie, Nekrosen) auftreten?

Eignet sich die P. A. eventuell als Indikator einer Auswirkung von F-Immissionen auf den pflanzlichen Stoffwechsel?

Unterliegt der allfällige Indikatorwert jahreszeitlichen Schwankungen?

Wie beeinflussen andere Faktoren (Gewebealter, Wassergehalt, Nekrosen) die P. A.?

Beeinflußt allenfalls oberflächlich anhaftender F-Staub, der durch die Homogenisa- tion mit dem Zellinhalt vermischt wird, die P. A.?

Vermag die P.A. die herkömmliche Blattanalyse auf F zu ergänzen? Diese Frage stellt sich insbesondere, weil zwischen dem Ausmaß der Schadensymptome und dem F-Gehalt der Pflanzen nicht immer eine eindeutige Beziehung besteht (DÄss- LER, 1969). Dies ist darauf zurückzuführen, daß man die wasserlöslichen, ,,aktiven"

kaum von den oberflächlich haftenden, inerten F-Verbindungen trennen kann.

Wäscht man den Staub ab, so verliert man auch einen Teil der wasserlöslichen F- Verbindungen; wäscht man dagegen das Laub nicht, so erfaßt man unter Umständen relativ große F-Mengen, welche als unlöslicher, inerter F-Staub die Pflanze nicht schädigen!

3. Material

Vertopfte Jungpflanzen wurden in verschiedener Entfernung (500-1500 m) von einer Aluminiumhütte exponiert. Alle diese Pflanzen standen in einem Gebiet, in dem vor- gängige, stichprobenartige Luftanalysen durch andere Institute ergeben hatten, daß der F-Gehalt der bodennahen Atmosphäre im Jahresdurchschnitt mindestens 1 µgF/m³ (als HF) betrug. Die Kontrollpflanzen befanden sich in sauberer Luft im Versuchs- garten unserer Anstalt in Birmensdorf.

Zu drei verschiedenen Zeitpunkten (Ende Juni/anfangs Juli; zweite Augusthälfte;

September/Oktober) wurden Gewebeproben (Assimilationsorgane) gewonnen und analysiert. Bei Laubbaumarten wurden jeweils die sechstäußersten Blätter einiger Neu- triebe, bei den Nadelarten die im Untersuchungsjahr gebildeten Nadeln vom obersten Astquirl geerntet. Dies gewährleistete einigermaßen eine Standardisierung des Ge- webealters.

4.

Methodik

4.1. Analysenvorsduift

In Anlehnung an LücK (1963) und AEBI (1965) wurde folgendermaßen vorgegangen:

0,3 g frisch geerntetes Gewebe (Frischgewicht) werden in 25 ml Phosphatpuffer mit einem Polytron-OD 20-Homogenisator (Fa. Kinematica AG, Luzern) 40 Sekunden bei stärkster Umdrehungszahl im Eisbad homogenisiert. Der Homogenisator wird mit 25

ml

destilliertem Wasser gereinigt, Homogenat und Waschwasser vereinigt und vaku- umfiltriert (Schleicher und Schuell 5892). Bei Koniferennadeln wird 1 ml dieses Ex- traktes direkt in ein Kolorimeterröhrchen pipettiert und mit 4 ml destilliertem Wasser verdünnt. Bei Laubblättern werden 2 ml Extrakt mit 5 ml Puffer und destilliertem Wasser auf 50 ml verdünnt, davon 5 ml ins Kolorimeterröhrchen gefüllt.

1 ml p-Phenylendiamin werden ins Kolorimeterröhrchen pipettiert und durch kräftiges Schütteln gut mit dem Extrakt vermischt. Am Kolorimeter (Bausch & Lomb, Spectronic 20) wird mit eingesetzter Probe Extinktion 0,00 bei 2=485 mµ eingestellt.

Es werden 2 Tropfen H2O2 zugegeben, das Röhrchen kurz kräftig geschüttelt und gleichzeitig eine Stoppuhr in Gang gesetzt. Das Röhrchen wird sofort wieder ins Kolo- rimeter eingesetzt und die Extinktion alle 20-30 Sekunden notiert. Die Messung er- folgt bei Raumtemperatur, wobei alle Reagenzien im Kühlschrank bei 2

°c

aufbewahrt werden. Da sich das Kolorimeter langsam erwärmt, wird es nach spätestens 30 Min.

wieder ausgeschaltet und ausgekühlt.

Im folgenden wird die P.A. angegeben als Extinktion nach 2 bzw. 5 Minuten (Na- del- bzw. Laubbaumarten). Die Extinktion erweist sich gegenüber der Lichtdurch- lässigkeit als überlegen, da sie eine stärkere Differenzierung ergibt und, soweit ge- wünscht, auch quantitative Vergleiche erlaubt.

4.2. Reagenzien

Phosphatpuffer: 3,522 g KH2PÜ4

+

7,268 g Na2HPO4 · 2H2O werden in dest.

Wasser zu 1 lt Lösung gebracht.

P-Phenylendiamin (Fisher Scientific Chemicals): 0,5 g pPD werden in 30 ml hei- ßem Wasser gelöst, vakuumfiltriert (Schleicher & Schuell 5893) und im Eisbad ge- kühlt. Mit dest. Wasser auf 50 ml verdünnen. (Wird jeden Tag frisch angesetzt.) Wasserstoffperoxid: 2 ml H2O2 300/o (Perhydrol Merck) mit dest. Wasser auf 100 ml verdünnen.

4.3. Verschiedenes

Nach LücK (1963) und AEBI (1965) können gewisse organische Substanzen durch H2O2 oxidiert werden, auch wenn Peroxidase fehlt, sofern Metallspuren (vor allem Fe, Cu, Mn) vorhanden sind. Da besonders auf sauren Böden die Assimilationsorgane relativ viel metallische Elemente speichern können, war zu überprüfen, ob nicht auch in unserem Material eine Schein-Peroxidase-Aktivität vorliege. Wurde der Extrakt jedoch kurz aufgekocht, so konnte keinerlei Aktivität festgestellt werden, so daß eine Scheinperoxidase ausgeschlossen werden kann.

Verschiedene Autoren verwenden Polyvinylpyrrolidon (PVP) als Stabilisator zum Binden polyphenolischer Substanzen (SCHNEIDER und HALLIER, 1970; STAIRS, 1970, briefliche Mitteilung). Nachdem es sich jedoch zeigte, daß das uns zur Verfügung ste-

hende PVP (0,1 0/o) mit pPD und H2O2 eine Eigenfärbung hervorrief, wurde von der Verwendung von PVP Abstand genommen.

5. Resultate methodischer Untersuchungen

5.1. Einfluß von Jahreszeit bzw. Blattalter

Es ist bereits seit längerer Zeit bekannt, daß sich die P. A. mit dem Gewebealter ändert (GALSTON et al., 1968; PARISH, 1969), doch lagen bisher keine Untersuchungen an

Extinktion ( P. A.)

Acer pseudoplatanus 0,8

0,6

0,4

5

0,2 3

2 3 4 5 Min.

Abb. 1. Peroxidase-Aktivität (ausgedrückt als Extinktion bei 485 mµ) von Bergahorn-Blättern, 4 Wochen nach Knospenaustrieb - 3: 3. Blattpaar (ab Vegetationskegel gezählt), normal, 5: 5. Blatt- paar, normal, 3F: 3.Blattpaar, starke F-Nekrosen

E 485 ( noch 2') 0,500

0,400

0,300

0,200

0,100

Forstpflanzen vor, welche das Ausmaß der Änderung erkennen ließen. Insbe- sondere stellte sich die Frage, ob im Herbst die durch die normale Alterung hervorgerufene P. A. allenfalls die durch die F-Einwirkung induzierte P. A. maskiere.

Über den Einfluß von Blatt- bzw.

Nadelalter auf die P. A. orientieren die Abbildungen 1 und 2. Aus Abb. 1 geht hervor, daß anfangs Juni die Al- terung (Unterschied zwischen dem 3.

und 5. Blatt) einen viel geringeren Ein- fluß auf die P. A. ausübt als starke F- Immissionen, die zu Nekrosen führen (Unterschied zwischen 3 und 3F). Ab- bildung 2 zeigt einen steten Anstieg der P. A. in (nicht F-beeinflußten) Ko- niferennadeln bis zum Winteranfang;

während des Winters verändert sich die Aktivität kaum mehr. Aus diesen Resultaten ist zu schließen, daß die

o-'---.----.----.---1

Juli Aug. Sept. Okt. Nov. Dez. Jon. Febr. März

Abb. 2. Jahreszeitliche Unterschiede der P.A. in Koniferennadeln (des im Untersuchungsjahr gebildeten Nadeljahrgangs) ohne Einfluß von F-Immissionen (normale Alterung)

P.A. vermutlich in der ersten Hälfte der Vegetationsperiode den stärksten Indikator- wert besitzt, weil zu diesem Zeitpunkt die P. A. normalerweise noch gering ist.

5.2. Die Beziehung zwischen F-Gehalt (Blattanalyse) und P.A.

Soll die P. A. als Indikator eines F-Einflusses dienen, so ist vorerst nachzuweisen, daß eine Beziehung besteht zwischen dem F-Gehalt der Assimilationsorgane (Blattanalyse) einerseits und der P. A. anderseits.

Abb. 3 zeigt das Bestehen einer der- artigen Beziehung in Douglasien- nadeln, die zu drei verschiedenen Zeitpunkten in verschiedener Ent- fernung von der Aluminiumhütte geerntet wurden. Mit zunehmen- dem F-Gehalt steigt die P. A. sehr deutlich an und dokumentiert da- mit eine vorzeitige Alterung der Nadeln. Dabei handelte es sich stets um normalgrüne, nicht nekrotisierte Nadeln, wenn auch z. T. von Bäum- chen, die im Oktober sehr viele Na- deln des laufenden Jahres unter dem Immissionseinfluß verloren hatten (vgl. Abb. 5). Man beachte, daß bereits im Bereich unter 25 ppm (der oft noch als „normaler"

F-Gehalt gilt) die F-Immissionen einen stimulierenden Einfluß auf die P. A. ausüben.

Diese Resultate sind insofern überraschend, als F-Verbindungen in der Regel als Enzyminhibitoren verwendet werden. Möglicherweise

E 485 (nach 2') 1,2

Ps menziesii 1,0

0,8

0,6

0

25 50 75 100 ppm F

Abb. 3. Beziehung zwischen F-Geha!t in Trocken- substanz und P. A. von Douglasiennadeln (des im Untersuchungsjahr gebildeten Jahrgangs) anfangs Juli (VII), Mitte August (VIII) und Ende Oktober (X). (Nadeln ohne äußerliche Symptome; jeder Wert entspricht dem Mittel von 5 Bäumen; die senkrechten

Striche verbinden die jeweiligen Extremwerte)

werden durch das F gewisse Enzyme gehemmt, die der Peroxidase entgegenwirken, so daß die P. A. indirekt gefördert wird.

5.3. Einfluß anhaftenden F-Staubes

Da F-Verbindungen den Biochemikern seit langem als Enzyminhibitoren bekannt sind und da auch in 5.2. ein Einfluß auf die P. A. aufgezeigt wurde, stellte sich die Frage, ob nicht der auf der Blattoberfläche haftende F-haltige Staub, der beim Homogenisie- ren mit dem Zellinhalt in Berührung kommt, die P. A. beeinflußt und möglicherweise Artefakte schafft. Zur Beantwortung dieser Frage wurden große Mengen Extrakt aus

„F-freien" Fichtennadeln (natürlicher F-Gehalt ca. 4 ppm) hergestellt. Dieser Extrakt wurde auf Aliquote aufgeteilt und diesen wurden in vitro zunehmende Mengen NaF bzw. CaF2 zugegeben. Die P. A. wurde darauf in Zeitintervallen gemessen. Die Re- sultate finden sich in Tab. 1.

Der Tab. 1 ist zu entnehmen, daß selbst hohe F-Zugaben innerhalb von 4 Std. kei- nen Einfluß auf die P. A. ausüben. Da die Homogenate jedoch normalerweise inner- halb einer Stunde gemessen werden, ist ein Einfluß äußerlichen F-Staubes auf die in

Tabelle 1

Einfluß von zunehmenden Mengen F (als NaF bzw. CaF, zum Nadelextrakt zugegeben) auf die P.A. (nach 2 Min.) von Fichtennadeln (Picea abies)

Extrakt!agerung bei 2 °C. Extinktion x10

F als NaF (ppm) F als CaF, (ppm)

Lagerungszeit

1 1 1 1

0 50 500 0 501 500¹

Fichte (junger Klon)

o

Std. 66 66 61 66 66 76

2 Std. 66 76 66 66 81 86

4 Std. 71 71 66 71 81 91

24 Std. 86 97 86 86 125 137

48 Std. 97 119 102 119 97 108

Fichte (alter Klon)

o

Std. 275 284 275 259 267 275

2 Std. 259 284 267 275 284 301

4 Std. 275 275 301 275 275 309

24 Std. 267 284 275 267 275 301

48 Std. 259 292 292 259 275 275

1 da schwer löslich, sedimentierte der größte Teil der Zugabe.

5) und 6) dargelegten Resultate mit Sicherheit auszuschließen. Eine gewisse „Alterung"

macht sich beim jungen Klon erst nach 1- bis 2tägiger Lagerung bemerkbar, aber dies trifft auch für die unbehandelten Proben zu.

5.4. Einfluß des Wassergehaltes im Gewebe

Die P. A. wurde stets an frischem Gewebe ermittelt. Da bekannt ist, daß unter dem Einfluß von F-Immissionen der pflanzliche Wasserhaushalt gestört wird (THOMAS und ALTHER, 1966; TRESHOW, 1970; HALBWACHS, 1970), war zu prüfen, in welchem Maße der Wasser- bzw. Trockensubstanzgehalt der Assimilationsorgane durch die F-Im- missionen beeinflußt wird und sich über unterschiedliche Probengrößen (verschiedenes Trockengewicht bei gleichem Frischgewicht) auf die P. A. auswirkt. Tabelle 2 stellt die prozentualen Trockensubstanzgehalte der Assimilationsorgane verschiedener Baum- arten zu verschiedenen Zeitpunkten der Vegetationsperiode zusammen. Es handelt sich jeweils um Mittelwerte von je 10 Pflanzen. ,, - F" bedeutet, daß der F-Gehalt unter 20 ppm lag (ausgenommen bei Buche und Weißerle), wogegen ,,+F" Pflanzen mit hohem F-Gehalt bezeichnet, wobei oft schon Ende Juni akute Schadensymptome auf- traten.

Aus Tabelle 2 geht deutlich hervor, daß bei allen Arten mit vorrückender Vege- tationsperiode der Trockensubstanzgehalt der Assimilationsorgane zunimmt, eine bereits seit langem bekannte Erscheinung, die mit den Immissionen nichts zu tun hat.

Es fällt jedoch auf, daß innerhalb der Arten die Unterschiede zwischen ,, +F" und ,, -F" bei jenen Arten am größten sind, bei welchen starke Nadelnekrosen auftraten (Pinus-Arten). Dies ist darauf zurückzuführen, daß der nekrotische Nadelteil nur mehr einen geringen Wassergehalt besitzt. An nicht nekrotisierten Nadeln (Fichte, Douglasie) dagegen, also im Bereich „unsichtbarer" Schädigungen, traten praktisch keine Wassergehaltsunterschiede auf; somit ist nicht zu befürchten, daß unterschied- liche Wassergehalte die P. A.-Bestimmung beeinträchtigten, obwohl sie sicher zur Streu- ung der Werte beitrugen. Es ist auch zuzugeben, daß am Ende der Vegetationsperiode

Tabelle 2

Trockensubstanzgehalte (°lo) einiger Blatt- und Nadelarten

Juni/Juli August Sept/Okt

Art

1 +F

1 1

-F - F +F -F +F

Fichte¹ 34 36 39 39 43 43

Douglasie ¹ 38 38 40 40 42 44

Föhre² 26 29 31 42 38 48

Schwarzföhre ² 27 33 32 50 38 50

Strohe ² 29 28 37 46 41 45

Buche² 45 46 48 50 54 57

Roteiche 38 38 40 40 41 42

Weißerle 26 26 28 29 31 32

1 Bei diesen Arten trat bei +F-Pflanzen teilweiser Nadelfall auf. Die Bestimmungen wur- den an den übrigbleibenden, grünen Nadeln vorgenommen. - ² starke Nekrosen bei ,,+F".

die Proben etwas mehr Trockensubstanz (mehr Zellen) enthalten, doch ist die daraus resultierende Erhöhung der P. A. wohl sehr bescheiden im Vergleich zum Einfluß der normalen Alterungsprozesse. Im übrigen fällt auf, daß jene Arten am nekroseanfällig- sten waren, bei welchen der Trockensubstanzgehalt der ,, - F"-Pflanzen im Laufe der Vegetationsperiode am stärksten zunahm.

5.5. Einfluß allfälliger Nekrosen

Um die Anwendbarkeit der Methode im Bereich akuter Schädigungen, d. h. bei Vor- liegen eindeutiger Symptome wie Nekrosen, Blattspreitenwölbungen etc. zu über- prüfen, wurde auch der Einfluß allfälliger Nadelspitzennekrosen untersucht. Wie be- reits oben ausgeführt, sind Nekrosen mit einer Verminderung des Wassergehaltes ver- bunden, so daß auf der Basis des Frischgewichtes nekrotische Proben wesentlich mehr Zellmaterial enthalten können, als normale, grüne Proben. Andererseits ist zu erwar- ten, daß im nekrotischen Teil die Enzymaktivitäten erheblich reduziert, wenn nicht gar erloschen, sind.

Aus diesem Grunde wurden im Oktober von einigen Stroben und Schwarzföhren mit Spitzennekrosen (ca. 80, bzw. 60 ppm F in Trockensubstanz) die nekrotischen Spitzen von der grünen Nadelbasis getrennt und gesondert auf P. A. analysiert. Die Resultate sind in Tab. 3 zusammengestellt und zeigen, daß im nekrotischen Teil noch immer eine reduzierte Enzymaktivität vorhanden ist. Trotz des erheblichen Anteils der Nekrose bezüglich der Nadellänge ist ihr Einfluß auf die Aktivität der ganzen

Tabelle 3

P.A. (nach 2 Minuten) nekrotischer und grüner Nadelteile, sowie ganzer Nadeln von Stroben und Schwarzföhren

(Mittelwerte von je 4 Pflanzen, im Oktober)

Nekrose in Aktivitäten (Ex 103) in

Art 0/o der Nadellänge

1 1

nekrot. grünen ganzen Nadeln

Pinus strobus 32 51 91 86

Pinus nigra 57 131 318 356

Nadel gering. Die Aktivitätsunterschiede zwischen ganzer Nadel und grünem Nadel- teil liegen innerhalb der Fehlergrenze der Methode. Immerhin können unterschied- liche Anteile an nekrotischem Gewebe in verschiedenen Proben zur Streuung der Werte beitragen.

Zur Überprüfung der P. A. in verschiedenen Zonen ausgewachsener Pinus-Nadeln wurden im Spätherbst Nadeln der Pinus canariensis in fünf 4 cm lange Zonen zerteilt und gesondert analysiert. Es ergab sich nur eine geringfügige, nicht gesicherte Erhö- hung der P. A. von der Spitze zur Basis. In früheren Entwicklungsstadien dürften die Verhältnisse allerdings etwas anders liegen.

6. Resultate eines Feldversuchs im Bereiche einer Aluminiumhütte

Abb. 4A zeigt die Resultate an Douglasien, welche in verschiedener Entfernung von der F-Quelle exponiert wurden, wobei stets nur grüne, normal aussehende Nadeln analysiert wurden. Immerhin ist zu bemerken, daß bei F-Gehalten >30 ppm (Distanz

~1000 m) die Pflanzen im Juli und August auch nekrotische Nadeln (des neugebildeten

E 485 ( noch 2') 1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

500 1000 1500 m NP

E 485 (noch 2') 0,6

b. Pinus nigra 0 P. si lvestris

0,4

*

P. strobus

6 0 ~

...,_o~

0,2

C

*, ^g:---_

*

^{i < ~}

500 1000 1500m NP

Picea abies

B

500 1000 1500m NP

E 485 ( noch 5')

o Ainus incana 0 6 Quercus bar.

' o ~ o -

6 -

6 - - - -

D ^{6 - - -}

500 1000 1500m NP

Abb. 4. P. A. einiger Nadel- und Laubbaumarten in verschiedener Entfernung von einer Alu- miniumhütte und von Nullproben (NP) zu verschiedenen Jahreszeiten (VII: Juli; VIII: Au-

gust; X: Oktober)

Jahrgangs) aufwiesen. Im Oktober waren diese Nadeln abgefallen (vgl. Abb. 5). Es fand sich aber schon unter dem oben genannten F-Schwellenwert eine deutlich gestei- gerte Aktivität (vgl. Abb. 3).

In Abb. 4B sind die Resultate für Fichte dargestellt. Während im Juli die Nadeln des jungen und des alten Klons praktisch identische P.A.-Werte aufwiesen (daher nur der Mittelwert beider Klone angegeben), zeigte im Oktober der empfindlichere, junge Klon gegenüber dem alten Klon deutlich

erhöhte Aktivitäten. Es fällt auf, daß die P. A.-Differenz zwischen Nullproben und

„1500 m" im Oktober geringer ist als im Juli. Unter dem Einfluß der normalen Ge- webealterung und möglicherweise einer gewissen Erholung (obwohl die F-Gehalte ja ständig zunahmen) glich sich die P. A.

der Nullproben und der in 1500 m Ent- fernung exponierten Pflanzen an.

Abb. 4C enthält die Oktoberresultate einiger Kiefernarten. Alle 3 Arten zeig- ten schwerste Schädigungen des jüngsten Nadeljahrganges auf den werknahen Standorten, blieben dagegen in 1500 m Distanz völlig symptomfrei. Die erhöhte P. A. in dieser Distanz deutet jedoch Stoff- wechselstörungen an.

Dies gilt auch z. T. für Abb. 4D. Buche und Roteiche zeigen im Hochsommer (Au- gust) auch in 1500 m Distanz vom Werk erhöhte P. A. (die Kurven für Buche und Roteiche liegen so nahe beisammen, daß nur jene der Roteiche abgebildet wurde).

Die Weißerlen-P. A. ist dagegen unverän- dert (im Vergleich zu den Nullproben). Die P. A. dokumentiert damit eine gerin- gere F-Toleranz von Buche und Roteiche als von Weißerle. Dies stimmt mit den Er- fahrungen KISSERs in einem österreichi-

' l

¹

Abb. 5. Douglasie nach 6monatiger F-Exposi- tion in 500 m Entfernung vom Werk. Man beachte die schüttere (oft fehlende) Benade- lung der jüngsten Triebe, da die nekrotischen

Nadeln abgefallen sind.

schen F-Schadensgebiet überein (zitiert nach GARBER, 1967, p.126). Die Laubbaumarten zeigten anfangs Juli auch in Werksnähe noch keine Randnekrosen; die erhöhte P. A.

eilte also den sichtbaren Symptomen voraus. Im übrigen ergab die P. A. bei den Laub- baumarten eine größere Streuung als bei den Koniferen, da vermutlich das Blattalter trotz der angestrebten Standardisierung stärker variierte.

7. Schlußfolgerungen

1. Die Messung der P. A. läßt sich auch an Assimilationsorganen von Waldbaumarten mit relativ geringem Aufwand routinemäßig bewerkstelligen.

2. Unter dem Einfluß von F-Immissionen steigt die P. A. an und indiziert damit eine vorzeitige Alterung des Gewebes.

3. Diese pflanzliche Reaktion ist jedoch nicht F-spezifisch und ersetzt die herkömm- liche Blattanalyse auf F nicht.

4. Bei vergleichenden Messungen ist der Vergleichbarkeit der Gewebeproben (Alter) volle Beachtung zu schenken.

5. Die P. A. scheint aufgrund der bisherigen Erfahrungen im Hochsommer die stärkste Aussagekraft zu haben, da zu jenem Zeitpunkt die F-induzierte Alterung der na- türlichen Alterung wohl am stärksten vorauseilt.

6. Außerlich anhaftender F-Staub beeinflußt die P. A. des Gewebeextraktes nicht, sofern der Extrakt sofort aufgearbeitet wird. Die P. A. dürfte sich somit z. B. zur Testung der Phytotoxizität verschiedener Stäube eignen.

7. Die P. A. kann als Indikator dienen, ob die Pflanze, bzw. ihr Stoffwechsel, von den F-Immissionen beeinflußt wurde und zwar lange bevor, bzw. ohne daß Schad- symptome auftreten. Dieser Test vermag somit nachzuweisen, ob unsichtbare Schä- digungen vorliegen, welche gerade in der Forstwirtschaft eine besondere Rolle spielen.

8. Es bleibt zu untersuchen, welchen Schwankungen die P. A. innerhalb der Krone ein- und desselben Baumes unterworfen ist, sowie, wie stark Baumalter und Genotyp die P. A. beeinflussen. Den besten Indikatorwert besitzt dieser Test möglicherweise dann, wenn er an klonisierten Fangpflanzen angewendet werden kann. Weitere Untersuchungen in dieser Richtung sind angelaufen.

Zusammenfassung

Die vorliegende Arbeit verweist einleitend auf die Problematik der „ unsichtbaren Rauchschä- digungen". Eine für Routineuntersuchungen (auch an Koniferennadeln) geeignete kolorime- trische Methode zur Bestimmung der Peroxidase-Aktivität (P. A.) in homogenisiertem Gewebe wird beschrieben (Homogenisation von frisch gepflücktem Gewebe in Phosphatpuffer, Zugabe von p-Phenylendiamin und H202; Messung der Extinktion innerhalb weniger Minuten bei J., = 485 mµ).

Die P. A. nimmt mit zunehmender Gewebealterung zu (Abb. 1 und 2). F-Immissionen ver- stärken diese natürliche Tendenz, führen also zu einer vorzeitigen Alterung. Erhöhte F-Gehalte der Assimilationsorgane sind mit einer erhöhten P. A. gekoppelt (Abb. 3).

Kußerlich anhaftender F-Staub, der bei der Homogenisation des Gewebes mit dem Zell- inhalt in Berührung kommt, stört die P. A. erst nach mehrstündiger Einwirkungszeit (Tab. 1).

Schwankungen des Gewebewassergehaltes beeinflussen den P.A.-Wert nur relativ geringfügig.

Untersuchungen an vertopften Jungpflanzen, welche in verschiedener Entfernung von einer Aluminiumhütte F-Immissionen ausgesetzt wurden, ergaben mit abnehmender Entfernung vom Werk zunehmende P. A. (Abb. 4) und F-Gehalte. Eine erhöhte P. A. kann auch ohne die Aus- bildung von Schadsymptomen auftreten oder diesen zeitlich vorauseilen. Die P. A. ist somit ein Indikator für Einflüsse von F-Immissionen auf den pflanzlichen Stoffwechsel und vermag ,,unsichtbare Schädigungen", d. h. physiologische Reaktionen der Pflanze, nachzuweisen.

Abschließend danken wir all jenen, die uns bei dieser Arbeit mit Ratschlägen unterstützt haben, insbesondere Prof. Dr. P. MATILE und Dr. R. W. PARISH vom Institut für Allg. Botanik, ETH Zürich, sowie Frau I. BucHER-WALLIN, Birmensdorf; wir danken auch der Eidg. For- schungsanstalt für Agrikulturchemie, Liebefeld (Dr. E. BovAY, Dr. R. ZuBER) für die Durch- führung der F-Analysen.

Summary

The paper quickly discusses the problem of "hidden smoke injury" and describes a colorimetric method for determining peroxidase activity (p. a.) in homogenized tissue, suitable also for routine measurements in conifers (homogenization of fresh foliage in phosphate buffer, ad- dition of p-phenylenediamine and H202; extinction at J., = 485 mµ).

P. a. increases with ageing of tissue (fig. 1 and 2). Air-borne F adds to this natural tendency, thus leading to premature senescence. Increased F-contents of foliage are coupled with in- creased p. a. (fig. 3).

External F dust (mixed with cell contents when homogenized) does influence p. a. only after several hours (table 1). P. a. is relatively !itt!e affected by variations in hydration of tissue.

Analyses of potted plants exposed at different distances from an aluminum plant to its F-exhalates show that with decreasing distance p. a. and F-content of foliage increase. In- creased p. a. may occur without or before visible F-injury svmptoms develop. This test therefore is a sensitive indicator for the tree's physiological (metabolic) reaction to air-borne F.

Resume

La detection de dommages invisibles (physiologiques) resultant d'emissions de F chez les arbres forestiers, par une simple determination colorimhrique de l' activite du peroxydase L'article presente une courte introduction sur le probleme des «dommages invisibles» dßs a la pollution de l'air. II decrit une methode colorimetrique appropriee aux recherches routinieres permettant (egalement pour les coniferes) la determination de l'activite du peroxydase (P. A.) dans un tissu homogeneise (homogeneisation du tissu de feuilles fra1chement coupees dans une solution tampon phosphatique, addition de p-phenylendiamine et de H202; mesurage de l'ex- tinction pendant quelques minutes a}. = 485 mµ).

La P. A. s'accroh avec le vieillissement des tissus (fig. 1 et 2). Les emissions de F renforcent cette tendance naturelle, conduisant donc

a

un vieillissement premature. Une teneur en F elevee des organes de l'assimilation est coordonnee avec une P. A. elevee (fig. 3).

Une poussiere de F couvrant la partie exterieure de la feuille (melangee au contenu des cellules lors de l'homogeneisation) influence la P. A. seulement apres plusieurs heures d'action (tab. 1). Des fluctuations de la teneur en eau des tissus ont une influence relativement insigni- fiante sur la valeur P. A.

Des experiences faites a vec de jeunes plantes en pot, exposees aux emissions de F a diffe- rents eloignements d'une fabrique d'aluminium, montrerent une augmentation de la P. A. et de la teneur en F plus la distance etait reduite (fig. 4). Une P. A. elevee peut egalement ap- parahre avant ou m~me sans symptomes visibles des dommages. La P. A. est de ce fait un indicateur de l'influence des emissions de F sur le metabolisme des plantes et permet d'etablir des «dommages invisibles», c.-a-d. des reactions physiologiques des plantes.

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Anschrift der Verfasser: Dr. THEO KELLER und H. SCHWAGER, Eidgenössische Anstalt für das forstliche Versuchswesen, CH-8903 Birmensdorf