Methodenentwicklung

In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl von funktionellen Assays zur Bestimmung estrogen wirksamer Substanzen entwickelt (ZACHAREWSKI 1997; BALAGUER et al. 1999; KORNER et al. 1999). In der vorliegenden Arbeit wurde ein Reportergenassay verwendet, der sich durch eine

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hohe Sensitivität (1 pM E2 in den alpha HEK Zellen und 5 pM E2 in den beta HEK Zellen) und Selektivität auszeichnet (KLUCZKA 2003). Der Assay basiert auf der Induktion eines Luciferasegens als Reaktion auf die Bindung estrogen aktiver Substanzen an den Estrogenrezeptor.

Vorteile des Assays waren die Möglichkeit eine größere Anzahl von Proben in einer kurzen Analysendauer zu untersuchen und differenzierte Aussagen zu agonistischen und antagonistischen Wirkungen zu machen. Als Nachteil stellten sich in den Untersuchungen von KLUCZKA (2003) sehr hohe Standardabweichungen in einzelnen Verdünnungsstufen sowie Wiederholungsmessungen heraus. Die Interassay Varianz in Testsystemen der funktionellen Analytik ist bekanntermaßen generell sehr hoch. In den Leitsätzen zur Qualitätssicherung von Bioassays für den Nachweis von Dioxinen und Furanen wird empfohlen, nur solche Untersuchungsergebnisse aus Zellkulturassays zu verwerten, die einen Variationskoeffizienten bis 10 % (innerhalb einer Verdünnungsstufe) bzw.

bis 50 % bei Wiederholungsexperimenten aufweisen (BEHNISCH et al. 2002). Der Bioassay zum Nachweis von Dioxinen und dioxinähnlichen Polychlorierten Biphenylen ist eines der wenigen Screeningverfahren auf Zellkulturbasis, das in der Europäischen Gemeinschaft zugelassen ist. In den EG-Richtlinien 2002/69 und 70 sind die Variationskoeffizienten für die Untersuchung von Lebensmitteln und Futtermitteln auf < 15 % bei einer dreifachen Bestimmung einer Probenlösung bzw. < 30 % zwischen drei unabhängigen Versuchen festgelegt (ANONYM 2002). In der Praxis wird die Standardabweichung innerhalb eines Probenansatzes (i. d. R. Tripletts) häufig bis zu einer Grenze von 20 % Streuung heraufgesetzt (SCHOETERS et al. 2004). Die von KLUCZKA (2003) beobachteten, zum Teil weitaus höheren Standardabweichungen in dem Luciferaseassay, waren die entscheidenen Gründe für die durchgeführten Optimierungsmaßnahmen. In Anlehnung an die oben genannten Richtwerte für den Nachweis von Dioxinen wurde eine Standardabweichung von < 20 % (innerhalb einer Verdünnungsstufe) und < 30 % bei Wiederholungsmessungen angestrebt (laborinterne Regelung). Als wesentliche Verbesserungsmaßnahmen stellten sich die Beschichtung der Well-Platten mit Kollagen, die geringere Konzentration der Probenextrakte sowie besonders die Berücksichtigung der Proteingehalte (~ Zellzahl) heraus. Die Modifikation des Extraktions-verfahrens durch den Enzymeinsatz führte indirekt zu einer Optimierung des Reportergenassays und soll mit oben genannten Verbesserungsmaßnahmen erörtert werden.

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5.1.2 Beschichtung von Well-Platten

Die Zelladhäsion ist ein wichtiger Aspekt in der Standardisierung des Luciferaseassays. Die verwendeten stabil transfizierten HEK Zellen sind kontaktabhängig und erwiesen sich bereits in den Untersuchungen von KLUCZKA (2003) als schlecht adhäsierend auf dem verwendeten Zellkulturmaterial. Eine ebenfalls von KLUCZKA (2003) eingesetzte Beschichtung der Wells mit Gelatine zeigte eine verbesserte Zelladhäsion, konnte aber unter den aktuellen Kultivierungsbedingungen nur teilweise reproduziert werden (siehe Tabelle 4.3: nach 24 h Aussaat der Zellen geringes Wachstum). Grundsätzlich spielen die Ladungen an der Zelloberfläche eine entscheidende Rolle bei der Zelladhäsion. Bei physiologischem pH-Wert (7,2) sind an der Zelloberfläche negative Ladungen vorherrschend, die unregelmäßig über die ganze Zelle verteilt sind. Dabei scheint die Ladungsdichte mehr als die Qualität der Ladung entscheidend für das Anheften der Zellen an die jeweilige Oberfläche zu sein (LINDL 2002). Für die Adhäsion der Zellen sind zwei Ladungsträger entscheidend: bivalente Kationen und/oder bestimmte Proteine, die sich an die Oberfläche des Kulturgefäßes heften können. Während als bivalente Kationen v. a.

Calcium– und Magnesiumionen infrage kommen, gibt es eine größere Zahl von Zellproteinen, die dazu beitragen, dass Zellen nicht nur aneinander haften, sondern in spezifischer Weise mithilfe von extrazellulären Proteinen in Verbindung treten. In den Untersuchungen wurden daher Kollagen (in getrockneter und frischer Form) sowie Bovines Serum Albumin vergleichend mit der bereits verwendeten Gelatine getestet. Eine unbeschichtete Well-Platte diente als Negativkontrolle. Die mikroskopische Beurteilung der Zellen sowie die Lebendzellzahlbestimmung zeigte, dass die Verwendung von getrocknetem Kollagen einen sehr guten Adhäsionseffekt bei den alpha und beta HEK Zellen auslöste (signifikant höhere Lebendzellzahl bei alpha HEK Zellen; p<0,05). Die in dem Luciferaseassay gemessenen höchsten Induktionsraten (bei 1 pM E2 bis 1000 pM E2) waren dabei ein Resultat des verbesserten Wachstums der Zellen in Well-Platten mit getrocknetem Kollagen.

Bei einer Konzentration von 10.000 pM E2 zeigte sich ein sehr inhomogenes Bild; Zellen auf unbeschichteten bzw. mit BSA beschichteten Platten erreichten die höchsten Induktionsraten. Diese Beobachtung ließ sich jedoch statistisch nicht absichern, und hohe Standardabweichungen erschwerten zudem die Beurteilung. Durch hohe Dosierungen (ab 1000 pM E2) verursachte zytotoxische Effekte können die Streuungen zum Teil erklären. Grundsätzlich scheint die schlechte Zelladhäsion bei unbeschichteten, mit Gelatine oder BSA beschichteten Platten ein Ablösen des

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Zellrasens zu bewirken, was durch mikroskopische Prüfung bestätigt werden konnte. Die Folge war eine inhomogene Zellzahl in verschiedenen Wells einer Platte, die letztlich Streuungen in den Induktionsraten verursachte.

Die Verwendung von frischem Kollagen in den Well-Platten wirkte sich durchgehend negativ auf das Zellwachstum und damit die Lebendzellzahl der alpha und beta HEK Zellen aus. Hier waren vermutlich zytotoxische Effekte ebenfalls dafür verantwortlich. Ursache könnte der schwach saure pH-Wert einer frischen Kollagenlösung sein, da das Kollagen in verdünnter Essigsäure angesetzt wurde. Wie in einer Studie zur Optimierung von embryonalen Hepatozyten beschrieben, ist es eventuell notwendig, die frisch mit Kollagen benetzte Oberfläche mit sterilem Wasser zur Säurebeseitigung zu waschen (SCHMELZER 2002). Nach der Trocknung zeigte das Kollagen diese Säureeigenschaften nicht mehr und wurde aufgrund der positiven Effekte auf das Zellwachstum für die weiteren Messungen verwendet.

5.1.3 Bedeutung unterschiedlicher Konzentrationen der Probenextrakte

In der Arbeit von KLUCZKA (2003) wurde die Vermutung geäußert, dass zu hoch konzentrierte Probenextrakte für die breite Streuung der Messwerte verantwortlich sein könnten. In der Probenvorbereitung nach KLUCZKA (2003) wurden 10 g Futter extrahiert und abschließend in 1 ml Ethanol überführt. Von diesen hoch konzentrierten Probenextrakten wurden (1:10 verdünnt mit Assaymedium) 2 µl zu den Zellen in den Luciferaseassay gegeben. In diesem Verfahren traten gleichzeitig zwei kritische Punkte auf: erstens hatte sich die Einwaage von 10 g Futter aufgrund der hohen Sensitivität des Assays weder als erforderlich noch als sinnvoll herausgestellt, da diese Konzentrationen häufig schon zytotoxische Effekte hatten. Zweitens war es problematisch, eine Volumenmenge von 2 µl einer konzentrierten Probenlösung homogen in einem Well mit 200 µl Assaymedium zu verteilen, ohne die Zellen zu beschädigen. In einer Studie von MURK et al.

(2002) kam es bei Verwendung zu hoch konzentrierter Extrakte durch die ungleiche Verteilung von nicht gelösten Komponenten zu unterschiedlichen Konzentrationen in den Probenverdünnungen. Es konnten dabei Unterschiede von 36 % bis zu 95 %, ausgehend von einer initialen Estradiol-Equivalenzkonzentration, beobachtet werden. Eine geringere Probeneinwaage von nur 100 mg Futter und die Verdünnung des Extraktes in 200 µl Assaymedium (mit der Möglichkeit einer homogenen Vermischung außerhalb des Wells) führte in einigen E2 Konzentrationen (1000 pM und

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10.000 pM) zu signifikant höheren Induktionsraten sowie geringeren Streuungen der Messwerte. So konnte z. B. der Variationskoeffizient bei einer E2 Konzentration von 1000 pM in den alpha HEK Zellen von 25,8 % auf 11,5 % reduziert werden. Der positive Effekt auf die Standardabweichung trug maßgeblich zu der Entscheidung bei, die modifizierte Substanzzugabe einer verdünnten Probenlösung für die weiteren Messungen zu verwenden.

5.1.4 Berücksichtigung unterschiedlicher Zellzahlen pro Well

In verschiedenen Studien wurde das Aussparen der Randwells bei der Durchführung von Luciferaseassay beschrieben; diese Tatsache war Anlass, auch bei dem in der vorliegenden Arbeit eingesetzten Luciferaseassay die äußeren Wells für die Verwendung zu prüfen (JONAS et al. 2002;

GUST et al. 2003). Hintergrund war der mögliche Effekt einer lokal unterschiedlichen CO₂ -Konzentration auf das Zellwachstum. Tatsächlich konnte in den äußeren Wells gegenüber den inneren Wells ein deutlich unterschiedliches Zellwachstum (unerwünscht hohe Wachstumsrate) festgestellt werden (p<0,05). Auf die Verwendung der äußeren Wells wurde daraufhin in den weiteren Messungen verzichtet. Im Rahmen der oben genannten Prüfung (Zellwachstum äußere Wells/innere Wells) wurde jedoch eine weitere Beobachtung gemacht: Das Zellwachstum der alpha und beta HEK Zellen unterschied sich z. T. auch in den inneren Wells einer 96-Well-Platte. Durch das unterschiedliche Zellwachstum herrschten von Well zu Well stark variierende Analysebedingungen, die letztlich unterschiedliche Induktionsraten und hohe Standard-abweichungen von Well zu Well erklärten. Um eine Standardisierung des Assays zu erreichen, wurden die unterschiedlichen Zellzahlen von Well zu Well innerhalb einer Platte durch Bestimmung der Proteingehalte berücksichtigt und in die Berechnung der EEQ-Gehalte einbezogen.

Dieses Vorgehen erwies sich bereits in einer Screeningmethode für Dioxine und dioxinähnliche Substanzen als vorteilhaft (THIEM et al. 2005). In diesem Bioassay wurde die Zellaktivität anhand einer Fluoreszenzbildung gemessen und in Relation zum Proteingehalt pro Well gesetzt. Dies führte zu Variationskoeffizienten einer Probenlösung von unter 15 %; innerhalb verschiedener Testreihen wurde ein Variationskoeffizient von 30 % nicht überschritten. Die Berücksichtigung der unterschiedlichen Zellzahlen (~ Proteingehalt) in dem in der vorliegenden Arbeit verwendeten Luciferaseassay führte ebenfalls zu deutlich geringeren Streuungen in den Messergebnissen (p<0,05). Der durchschnittliche Variationskoeffizient konnte von 27,2 % auf 6,9 % (alpha HEK

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Zellen) bzw. von 23,1 % auf 7,0 % (beta HEK Zellen) reduziert werden. Die geforderten Qualitätskriterien (laborinterne Regelung) für den Luciferaseassay wurden somit erfüllt; das Verfahren erwies sich als geeignet für die weiteren Messungen zum Nachweis estrogen aktiver Substanzen. Die Firma BioDetectionSystems (BDS), die ein ER-CALUX^® Assay zur Bestimmung von Estrogenen und estrogenähnlichen Stoffen vertreibt, verzichtet auf die Proteinkorrektur zugunsten des einfachen und schnellen Screenings. Durch die Weiterentwicklung zu genetisch modifizierten Zellen und die Verwendung der TD47D Zelllinie (humane Brustkrebszellen) scheint die Berücksichtigung der unterschiedlichen Proteingehalte nicht notwendig zu sein (persönliche Mitteilung, BDS CALUX Exchange Workshop 2006). Für die eigenen Untersuchungen wurde die Proteinkorrektur trotz zusätzlicher Arbeitsschritte dennoch durchgeführt, um die geringen Variationen der Messergebnisse zu gewährleisten.

5.1.5 Extraktionsverfahren für Futtermittel und Sauenmilch

Im Hinblick auf die Messungen von Probenextrakten mittels HPLC-UV Verfahren ist die Umwandlung der gebundenen Isoflavone nicht zwingend notwendig. Unter der Voraussetzung, dass geeignete Referenzsubstanzen vorhanden sind, können die gebundenen sowie die freien Isoflavone gleichzeitig mit der HPLC qualifiziert und quantifiziert werden. Dennoch wurde das Extraktionsverfahrens modifiziert, um die gebundenen Isoflavone in Aglykone umzuwandeln: Für die Bestimmung der estrogenen Aktivität der Probenextrakte war es notwendig, die Isoflavone in die aktive freie Form umzuwandeln. Darüber hinaus erleichterte die Umwandlung in Aglykone den qualitativen und quantitativen Nachweis der Isoflavone mittels HPLC, denn anstatt der acht benötigten Referenzsubstanzen (glykosidierte, glukuronidierte und sulfatierte Isoflavone sowie Aglykone) brauchten nur zwei Referenzsubstanzen für freies Genistein und Daidzein eingesetzt zu werden. Referenzsubstanzen für glukuronidiertes und sulfatiertes Genistein und Daidzein standen zudem nicht zur Verfügung. In einer Studie zur Bestimmung der Gesamtisoflavongehalte in Konzentraten auf Soja- und Rotkleebasis konnte ein aufwendiges Verfahren mit zwölf Referenzsubstanzen durch die Spaltung der Glykoside derart vereinfacht werden, dass nur noch drei Substanzen notwendig waren (SCHWARTZ u. SONTAG 2005). In diesem Zusammenhang wurden Ergebnisse einer Vergleichsstudie von 24 Laboratorien angeführt, die als Hauptgrund für hohe

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Diskrepanzen in der Isoflavonbestimmung die Verwendung unterschiedlicher Referenzstandards für die Glykoside sahen (SOYLIFE NETHERLAND 2001).

Für die Spaltung der glykosidisch gebundenen Isoflavone Genistin und Daidzin in Futtermitteln standen die saure Hydrolyse oder eine Enzymbehandlung zur Auswahl. In einer Untersuchung zu Säuglingsnahrung auf Sojabasis wurde die Hydrolyse mit Salzsäure einer enzymatischen Spaltung der Glykoside durch Cellulase gegenübergestellt (GARRETT et al. 1999). Die anschließende Messung im Rezeptorassay zeigte eine nahezu 100 % ige Wiederfindung von zugesetztem Genisteinstandard bei der enzymatischen Behandlung der Proben. Dieses Ergebnis stimmte mit Untersuchungen von LIGGINS überein, der bei einer enzymatischen Hydrolyse von einer Wiederfindungsrate über 83 % berichtete (LIGGINS et al. 1998). In den eigenen Untersuchungen wurde daher ebenfalls das Verfahren der enzymatischen Spaltung verwendet. Anstatt der Cellulase wurden jedoch ß-Glucosidase und Glucuronidase eingesetzt, wie es in aktuellerer Literatur empfohlen wird (NURMI et al. 2002). Das so durchgeführte Extraktionsverfahren für Futtermittel zeigte eine sehr gute Reproduzierbarkeit (Variationskoeffizient 7 %) und eine effektive Konversion der gebundenen Isoflavone in Aglykone (93,8 %). Die Matrixeffekte durch das Futtermittel verringerten die Wiederfindungsrate auf durchschnittlich 93 %. Insgesamt handelte es sich bei dem Extraktionsverfahren jedoch um eine geeignete Methode; sie wurde deshalb für die weiteren Messungen verwendet.

Die Isoflavone Genistein und Daidzein liegen in der Sauenmilch (Kolostrum) glukuronidiert bzw.

sulfatiert vor. Die enzymatische Spaltung erfolgte daher mit ß-Glucuronidase und Arylsulfatase. In einer Studie von FRANKE und CUSTER wurden Milchproben von stillenden Müttern untersucht, die mit ihrer täglichen Nahrung 5, 10 und 50 g Sojabohnen aufnahmen (FRANKE u. CUSTER 1996). Nach der enzymatischen Hydrolyse und Extraktion konnten keine gebundenen Isoflavone mittels HPLC gemessen werden; die Spaltung der Gklykoside war demnach sehr effektiv. Die Wiederfindungsrate von zugesetzten freien Isoflavonen variierte zwischen 87,9 % und 98,5 %.

Aufgrund der gleichen Versuchsdurchführung (enzymatische Hydrolyse und Probenextraktion) wurde in den eigenen Untersuchungen ebenfalls von einer effektiven Konversion ausgegangen; sie ließ sich wie im Falle der Futtermittel aufgrund fehlender „natürlich“ belasteter Proben jedoch nicht nachweisen. Die Wiederfindungsrate von zugesetzten freien Isoflavonen verringerte sich aufgrund der Matrixeffekte auf 89 % und lag damit unter den von FRANKE und CUSTER (1996) erreichten Höchstwerten. Die Extraktion des Kolostrums der Sau erwies sich zunächst als schwierig. Hohe

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Konzentrationen an Proteinen (v. a. in Form von Immunglobulinen) verursachten eine gelartige Konsistenz der Proben während der Extraktion, die z. T. sehr geringe Wiederfindungraten (65 %) zur Folge hatten. Eine deshalb durchgeführte Proteinfällung mit Acetonitril verhinderte diese großen Substanzverluste, so dass das Extraktionsverfahren schließlich für die weiteren Messungen eingesetzt werden konnte.