Untersuchung der Seren im IFAT auf Neospora-Antikörper

3.2.2.1. Serumgewinnung und Serumlagerung

Es wurden Vollblutproben von 299 Hunden aus der Vena cephalica antebrachii oder der Vena saphena lateralis entnommen. Die Blutproben wurden in Eppendorf-Reaktionsgefäße¹ aufgefangen. Nach etwa einer Stunde war das Blut geronnen und wurde zweimal 95 Sekunden bei 12000 g zentrifugiert². Das Serum wurde abpipettiert und bei -22 ˚C in Eppendorf-Reaktionsgefäßen gelagert.

3.2.2.2. Referenzseren

Als Referenzseren dienten kommerziell erhältliche negative und positive Hundeseren³. Außerdem wurde ein positives Serum eines Hundes, der an klinischer Neosporose erkrankt war, verwendet. Die Neospora-Infektion wurde durch Immunhistochemie und Parasitenisolation bestätigt.

3.2.2.3. Antigengewinnung für den IFAT

Für die Untersuchung aller Seren in dieser Studie wurde eine Charge Antigen produziert und verwendet. Parasitenkulturen des NC-1-Isolates N. caninum wurden auf Verozellen in Zellkulturflaschen⁴ gezüchtet. Zur Gewinnung von Tachyzoiten als Material für die IFAT-Objektträger⁵ wurden Flaschen gewählt, in denen sich ein Verozell-Monolayer gebildet hatte, der viele Zellen mit Parasitenclustern und ersten Plaques aufwies. Die Zellkulturflasche wurde auf die Seite mit dem Monolayer gelegt, und die Parasiten mitsamt den restlichen Zellen wurden mit dem Zellscraper⁶ abgekratzt. Die Parasitensuspension wurde in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen⁷ überführt, dabei wurde die Suspension in der Pipette mehrmals hoch- und herunterpipettiert, um Zellcluster zu lösen. Danach wurde die Zellkulturflasche mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, H) gespült und die Spülflüssigkeit ebenfalls in das Zentrifugenröhrchen überführt. Die Parasitensuspension wurde

1 Safe-Lock 1,5 ml Reaktionsgefäße, EPPENDORF-NETHELER-HINZ-GmbH, Hamburg

2 Stat Spin^®-Mehrzweckzentrifuge, Modell SSMP, STATSPIN TECHNOLOGIES, Massachusetts (USA)

3 VMRD,INC., Pullman, Washington (USA)

4 Easyflask, 75 cm², mit Filterkappen, NUNC, Wiesbaden

5 teflonbeschichtete Diagnostik-Objektträger mit 24 4-mm-Vertiefungen, Teflonbeschichtung schwarz, RENNER, Dannstadt

6 24 cm, Klingenbreite 12 mm, RENNER, Dannstadt

7 NUNC, Wiesbaden

80 3. Material und Methoden

dreimal durch eine Kanüle⁸ gezogen, um die Zellen zu zerstören. Es folgte eine 10-minütige Zentrifugation⁹ bei 1000 g. Der Überstand wurde abgegossen und das Sediment in PBS (H) resuspendiert. Es wurde noch mindestens dreimal mit PBS (H) gewaschen, wobei jedes Mal gründlich resuspendiert wurde und eine 10-minütige Zentrifugation bei 1000 g erfolgte. Nach dem letzten Waschschritt wurde erneut gründlich resuspendiert. Die Tachyzoiten wurden in einer Thoma-Zählkammer¹⁰ gezählt und die Suspension auf 10⁶ Tachyzoiten pro ml eingestellt.

Zehn µl dieser Suspension wurden in jede Vertiefung der Objektträger für den Neospora-IFAT pipettiert. Die Objektträger wurden über Nacht in einem Umluft-Trockenschrank¹¹ bei 27 °C und leichtem Umluftstrom getrocknet. Am nächsten Tag wurden sie luftdicht und feuchtigkeitsabweisend verpackt. Die Lagerung der Objektträger erfolgte bei -80 °C.

3.2.2.4. Konjugat

Als Konjugat diente FITC (Fluoreszeinisothiocyanat)-konjugiertes Kaninchen-Anti-Hund-IgG¹², das in einer Verdünnung von 1:60 verwendet wurde.

3.2.2.5. Testdurchführung 1. Auftauen der Objektträger

Zur Durchführung des IFATs wurden die mit NC-1-Tachyzoiten beschichteten Objektträger etwa 30 Minuten bei Zimmertemperatur aufgetaut.

2. Fixierung des Antigens

Es erfolgte eine 10-minütige Fixierung in Methanol* in einer Färbeküvette.

3. Spülen, Waschen und Trocknen der Objektträger

Die Objektträger wurden mit PBS aus einer Spritzflasche abgespült und dann 10 Minuten in PBS gewaschen. Dazu stellte ich sie 10 Minuten in eine Färbeküvette mit

8 0,4 mm, BRAUN, Melsungen

9 Sigma 3 K-1 für 50-ml-Zentrifugenröhrchen, SIGMA Laborzentrifugen, Osterode

10 LANDGRAF, Hannover

11 HERAEUS, Hanau

12 FITC-konjugiertes Kaninchen Anti-Hund IgG (H + L) , Code 304-095-003, JACKSON IMMUNO RESEARCH LABORATORIES INC., Baltimore (USA)

PBS und bewegte die Küvette nach etwa 5 Minuten vorsichtig. Nach dem Waschen wurden die Objektträger entnommen und die Flüssigkeit auf den Objektträgern auf einer saugfähigen Unterlage vorsichtig abgeklopft. Anschließend wurden die Objektträger am Rand und zwischen den Vertiefungen mit einem fusselfreien Papier¹³ getrocknet.

4. Verdünnung der Testseren und Beschichtung der Objektträger

Die Testseren und das negative Kontrollserum¹⁴ wurden in Zweierschritten ab einer Verdünnung von 1:25 (1:25, 1:50, 1:100 und 1:200) mit PBS in einer Mikrotiterplatte¹⁵ verdünnt. Die Verdünnung der Testseren erfolgte zunächst bis zur Verdünnungsstufe 1:200. War aus vorhergehenden Untersuchungen bekannt, dass das Testserum bei 1:200 positiv reagierte, wurde es soweit weiterverdünnt, dass es in der Endverdünnung negativ war. Das positive Kontrollserum¹⁶ wurde in Zweierschritten ab einer Verdünnung von 1:40 verdünnt (1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280, 1:2560 und 1:5120). In jedem Test wurden eine Konjugatkontrolle, eine PBS-Kontrolle und eine Negativkontrolle in vier Verdünnungsstufen sowie eine Positivkontrolle in acht Verdünnungsstufen mitgeführt.

Auf die Objektträgerfelder der Konjugat- und der PBS-Kontrolle wurden je 7 µl PBS aufgetragen. Auf die übrigen Objektträgerfelder wurden je 7 µl Serumverdünnung aufgetragen. Die Seruminkubation erfolgte 30 Minuten in einer feuchten Kammer bei 37 ˚C im Brutschrank¹⁷.

5. Spülen, Waschen und Trocknen der Objektträger Siehe Punkt 3.

6. Inkubation mit Konjugat

Die Konjugatgebrauchslösung (1:60) wurde mit PBS hergestellt und Evans Blau* zur Gegenfärbung verwendet (20 µl Konjugat wurden mit 1,12 ml PBS und 60 µl Evans-Blau-Lösung vermischt). Je 7 µl der Konjugatverdünnung wurden auf jedes Objektträgerfeld gegeben (außer in die der PBS-Kontrolle, hier wurden 7 µl PBS zugegeben), worauf eine erneute Inkubation für 30 Minuten bei 37 °C in der feuchten Kammer erfolgte.

13 KIMWIPES^®, KIMBERLY-CLARK, Roswell, Georgia (USA)

14 VMRD,INC., Pullman, Washington (USA)

15 PS-Microplatte, 96 K, U-Form, GREINER BIO-ONE, Frickenhausen

16 VMRD,INC., Pullman, Washington (USA)

17 MEMMERT, Schwabach

82 3. Material und Methoden

7. Spülen, Waschen und Trocknen der Objektträger

Siehe Punkt 3. Allerdings wurde die Färbeküvette so in Alufolie eingepackt, dass kein Licht auf die Objektträger fallen konnte.

8. Eindecken der Objektträger

Nachdem die Objektträger am Rand trockengewischt waren, wurden drei bis vier Tropfen des Eindeckmediums aufgetropft und der Objektträger mit einem großen Deckgläschen¹⁸ abgedeckt. Die Objektträger wurden bis zur Auswertung dunkel aufbewahrt.

9. Auswertung

Die Auswertung erfolgte mit dem Fluoreszenzmikroskop¹⁹ bei 400facher Vergrößerung, wobei folgende Einteilung vorgenommen wurde:

Abb. 3.5. Beurteilung der Fluoreszenz im Neospora-IFAT.

Bei der Polkappenfluoreszenz (apikale Fluoreszenz) handelt es sich meistens um eine unspezifische Reaktion, die wahrscheinlich durch Reaktion mit anderen Apicomplexa hervorgerufen wird.

18 Deckgläser für Mikroskopie, 24 x 60 mm, KNITTEL GLÄSER, Braunschweig

19 Laborlux D, LEICA, Solms

Die Ergebnisse wurden in dem im Anhang 9.6. aufgeführten Ergebnisbogen dokumentiert. Es wurde die Fluoreszenz für jede einzelne Verdünnungsstufe beurteilt. Als Titer wurde die Verdünnungsstufe des Serums angegeben, in der die Fluoreszenz des Parasiten noch mit 1+ beurteilt wurde.

Die Endbewertung eines Serums erfolgte anhand mindestens zwei unabhängig voneinander durchgeführter IFATs. Wich das Ergebnis der einzelnen IFATs um eine Titerstufe voneinander ab, wurde das Serum endgültig mit der niedrigeren Titerstufe bewertet oder es wurde ein weiterer IFAT durchgeführt. Bei drei durchgeführten IFATs wurde das Serum endgültig mit der Titerstufe bewertet, die bei zwei der drei IFATs noch zu einer Fluoreszenz führte. Fielen alle drei IFATs unterschiedlich aus, wurde ein vierter IFAT durchgeführt und der Titer endgültig durch das Mittel zwischen dem höchsten und niedrigsten Einzel-IFAT-Ergebnis beurteilt. Die Einzel- und Endbewertungen der Seren sind im Anhang 9.7. aufgeführt. Die Seren wurden in zwei Kategorien eingeteilt:

Tab. 3.2. Einteilung der Seren in die Kategorien positiv und negativ Kategorie Endbewertung des Serums

Negativ Keine Fluoreszenz, trace bis zu 1:100 oder Titer <1:50 Positiv Titer ≥1:50