Indirekte Nachweismethoden

Eine Infektion mit N. caninum verursacht häufig eine Antikörperproduktion, die durch verschiedene Tests nachgewiesen werden kann. Die Anwesenheit von N.-caninum-spezifischen Antikörpern in einem Tier zeigt an, dass es mit dem Parasiten infiziert ist oder kürzlich exponiert war (BJÖRKMAN u. UGGLA 1999). Die indirekte Diagnostik

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kann nicht beweisen, dass N. caninum tatsächlich die Ursache der entsprechenden Symptome ist, dies kann nur durch den direkten Nachweis von N. caninum in Zusammenhang mit entsprechenden Läsionen in den betroffenen Geweben geschehen. Trotzdem sind serologische Untersuchungen wichtig, um den Kontakt mit dem Parasiten nachzuweisen und das Risiko, an einer Neosporose zu erkranken, einzuschätzen (HEMPHILL 1999).

2.5.1.1. IFAT

Der IFAT war der erste serologische Test, den DUBEY et al. (1988b) entwickelten, um bei Hunden Antikörper gegen N. caninum nachzuweisen. Er beruht auf dem Prinzip, dass intakte N.-caninum-Tachyzoiten auf Objektträgern fixiert werden. Diese werden zunächst mit verdünntem Testserum und in einem zweiten Schritt mit fluoreszeinmarkierten Sekundärantikörpern (Konjugat) inkubiert, die gegen Immunglobuline der zu untersuchenden Tierspezies gerichtet sind. Die Reaktion wird unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Ein positives Ergebnis wird durch eine helle, ununterbrochene periphere Fluoreszenz der Parasiten angezeigt. Eine alleinige Fluoreszenz des apikalen Teils der Tachyzoiten (Kappen- oder Polfluoreszenz) wird als nicht spezifische Reaktion beurteilt, die durch Infektion mit kreuzreaktiven apicomplexen Arten verursacht wird (CONRAD et al. 1993b, PARÉ et al. 1995b). Die Durchführung des IFATs erfordert Übung und Erfahrung sowie eine individuelle Interpretation der Reaktionen, weil es sich um einen visuellen Test handelt. Die Ergebnisse des IFATs sind zu einem gewissen Grad subjektiv. Es ist unbedingt erforderlich, dass die optimale Verdünnung des fluoreszeinmarkierten sekundären Antikörpers sorgfältig mit bekannten positiven und negativen Kontrollseren ermittelt wird. Die Reagenzien für den IFAT zur Untersuchung auf Antikörper gegen N. caninum sind kommerziell erhältlich (VMRD, Pullman, WA), jedoch werden in vielen Labors eigene Antigenpräparationen verwendet.

Weil im IFAT intakte Tachyzoiten als Antigen benutzt werden, werden mit diesem Test hauptsächlich Antigene erfasst, die sich auf der Zelloberfläche des Parasiten befinden (BJÖRKMAN u. UGGLA 1999). Solche Antigene sind oftmals parasitenspezifisch im Gegensatz zu einigen nicht spezifischen Antigenen, die sich im Zellinnern befinden und mit anderen verwandten Parasiten kreuzreagieren (WILLIAMS et al. 1997, PACKHAM et al. 1998).

Es gibt viele Untersuchungen zur Kreuzreaktivität von N. caninum mit anderen Kokzidien im IFAT. So konnten bei Hunden ab einem Titer von 1:100 keine Kreuzreaktionen zwischen N. caninum und T. gondii beobachtet werden (DUBEY et al. 1988b). Ebenso fanden TREES et al. (1993) keinen Zusammenhang zwischen dem Vorkommen von Neospora-Antikörpern bei Hunden in einer Serumverdünnung

von 1:50 oder 1:200 im IFAT und dem Vorkommen von Toxoplasma-Antikörpern im Sabin-Feldman-Test (SFT) in einer Verdünnung von 1:32. YAMANE et al. (1993) untersuchten die serologische Kreuzreaktivität zwischen Babesia gibsoni, Babesia canis, T. gondii und N. caninum im IFAT. Seren von zwei experimentell mit B. gibsoni infizierten Hunden reagierten mit N.-caninum-Antigenen bis zu einer Serumverdünnung von 1:10240, aber Seren von experimentell mit N. caninum infizierten Hunden zeigten keine serologische Reaktivität mit B.-gibsoni-Antigen.

Seren von experimentell mit T. gondii infizierten Hunden reagierten nicht mit N.

caninum im IFAT. Diese beobachtete Kreuzreaktion mit B. gibsoni im Neospora-IFAT ist für N.-caninum-Studien in Europa von untergeordneter Bedeutung, da es sich bei B. gibsoni um einen Parasiten handelt, der in Asien, Nordafrika und Nordamerika vorkommt (ROMMEL et al. 2000).

Eine weitere Studie zur Kreuzreaktivität zwischen N. caninum und eng verwandten Apicomplexa führten DUBEY et al. (1996a) durch. Dazu infizierten sie Rinder, Schafe, Ziegen, Schweine, Katzen, Kaninchen, Ratten und Mäuse mit N. caninum und untersuchten deren Seren im IFAT auf Antikörper gegen N. caninum und im modifizierten Agglutinationstest (MAT), SFT oder IFAT auf Antikörper gegen T.

gondii. Zusätzlich wurden Rinder experimentell mit den ebenfalls gewebezystenbildenden Protozoen T. gondii und Sarcocystis-Arten sowie Kälber mit den intestinalen Kokzidien Eimeria bovis und Cryptosporidium parvum oral infiziert, und es erfolgte eine experimentelle Immunisierung von Kaninchen mit T. gondii, H.

hammondi und Sarcocystis-Arten. Auch die von diesen Tieren erhaltenen Seren wurden auf Kreuzreaktivität mit N. caninum untersucht. Rinder, die mit Sarcocystis-Arten oder T. gondii infiziert wurden, entwickelten keine messbaren N.-caninum-Antikörpertiter. Eine Infektion von Kälbern mit E. bovis oder C. parvum hatte keinen Einfluss auf den Neospora-Titer im IFAT. Kaninchen, die mit Sarcocystis neurona, Sarcocystis muris, Sarcocystis cruzi, H. hammondi oder T. gondii immunisiert wurden, entwickelten keine positiven Titer gegen N. caninum im IFAT. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass es im Neospora-IFAT keine Kreuzreaktionen mit T. gondii, H. hammondi, Sarcocystis-Arten, E. bovis oder C. parvum gibt und der Neospora-IFAT somit weitgehend spezifisch für die Diagnose der Neospora-Infektion bei Tieren ist. Insgesamt kann man sagen, dass der N.-caninum-IFAT sehr wenig Kreuzreaktivität mit anderen Protozoen aufweist (BJÖRKMAN u. UGGLA 1999). Zu beachten ist, dass Hunde gleichzeitig mit N. caninum, T. gondii und anderen Apicomplexa infiziert sein können (DUBEY et al. 1995).

Die Serologie ist eine wichtige diagnostische Maßnahme bei der Identifikation von Infektionen mit N. caninum bei Hunden, aber das Vorkommen von Antikörpern ist nicht diagnostisch für eine Erkrankung, weil die meisten seropositiven Hunde klinisch gesund bleiben. Die Höhe des Titers kann jedoch ein nützlicher diagnostischer

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Indikator sein (BARBER u. TREES 1996). Obwohl auch einige klinisch unauffällige Tiere Titer ≥1:800 haben können, zeigen epidemiologische Studien, dass solche Titer meist indikativ für eine durch N. caninum bedingte klinische Erkrankung sind (TREES et al. 1993, BARBER u. TREES 1996). So wurden in einer Studie bei nur 1,2 % von 1603 neosporoseunverdächtigen Tieren IFAT-Titer ≥1:800 gefunden, während alle 20 untersuchten klinischen Neosporosefälle Titer ≥1:800 im N.-caninum-IFAT hatten (BARBER und TREES 1996). In einer anderen Studie hatten alle parasitologisch bestätigten Neosporosefälle Titer ≥1:200 im IFAT (DUBEY u. LINDSAY 1996).

Der Cut-off-Titer für die Differenzierung zwischen negativen und positiven Reaktionen variiert zwischen verschiedenen Labors, hauptsächlich aufgrund von Unterschieden bei Puffern, Inkubationsbedingungen und Konjugaten. Auch der Typ und die Qualität des Fluoreszenzmikroskops können die Nachweisgrenzen beeinflussen (HEMPHILL 1999).

Der IFAT wird vor allem benutzt, um Antikörper im peripheren Blut und in der Zerebrospinalflüssigkeit infizierter Hunde sowie in maternalen und fötalen Seren infizierter Rinder nachzuweisen (HEMPHILL 1999).

Nachteile des IFATs liegen in der Zeitaufwendigkeit des Tests (BJÖRKMAN et al.

1994a) und der Notwendigkeit geschulten Personals zum Ablesen des Tests (LALLY et al. 1996a).

2.5.1.2. ELISA

Zur Durchführung des indirekten ELISAs wird zunächst die Oberfläche einer Mikrotiterplatte mit einer Antigenpräparation beschichtet. Nach Inkubation mit den Testseren wird ein enzymmarkierter, tierartspezifischer Sekundärantikörper (Konjugat) zugegeben. Im letzten Schritt wird ein Substrat zugefügt, das in Gegenwart des Konjugats in ein farbiges Produkt umgewandelt wird. Nach einer bestimmten Zeit wird die Enzym-Substrat-Reaktion gestoppt und die Absorption oder die optische Dichte mit einem Spektralphotometer gemessen (HARLOW u. LANE 1988).

Alternativ entwickelten PARÉ et al. (1995a) einen kinetischen ELISA, bei dem die Veränderung der Absorption gemessen und als Maximalgefälle der optischen Dichte über der Zeit (Vmax) berechnet wird.

Ferner wurde ein kompetitiver ELISA, der zum Nachweis von N.-caninum-Antikörpern bei Rindern benutzt wird, beschrieben (BASZLER et al. 1996, 2001, DUBEY et al. 1997). Kompetitive ELISAs sind indirekte Tests, die einen

monoklonalen Antikörper beinhalten, der mit den Antikörpern im Testserum um Epitope des Testantigens konkurriert. Der sekundäre Antikörper ist gegen Mäuse-Immunglobuline gerichtet, die mit dem monoklonalen Antikörper reagieren. Wenn das Testserum Antikörper enthält, die gegen dieselben Epitope gerichtet sind wie der monoklonale Antikörper, ist die Absorption in den Vertiefungen, die monoklonale Antikörper und Testserum enthalten, geringer als in Vertiefungen, die nur monoklonale Antikörper enthalten. Das Ergebnis wird meistens als prozentuale Hemmung durch das Testserum angegeben. Ein Vorteil des kompetitiven ELISAs liegt darin, dass er die Höhe der Antikörper misst, die gegen ein einziges oder wenige Epitope gerichtet sind, und somit meist spezifischer ist als konventionelle ELISAs. Außerdem wird neben dem Anti-Maus-Sekundärantikörper kein weiteres Konjugat benötigt, was den kompetitiven ELISA sehr vielseitig macht (HARLOW u.

LANE 1988, BJÖRKMAN u. UGGLA 1999).

Traditionelle indirekte N.-caninum-ELISAs benutzen Antigenpräparationen aus zerstörten nativen Tachyzoiten. Diese enthalten viele Antigene, die wahrscheinlich überwiegend zytoplasmatischen Ursprungs sind (BJÖRKMAN u. UGGLA 1999). Es wird von Sensitivitäten von 88,6-98 % und Spezifitäten von 87-100 % bei diesen ELISAs berichtet (PARÉ et al. 1995a, OSAWA et al. 1998, WOUDA et al. 1998a).

Aber die Spezifität und Sensitivität von ELISAs, die auf intrazellulären Antigenen beruhen, wurden in Frage gestellt und es wird angenommen, dass serologische Untersuchungen, die auf Antigenen der Oberflächenmembran beruhen, parasitenspezifischer sind (HULDT 1981, UGGLA u. BUXTON 1990). Um die Reaktion mit intrazellulärem Antigen zu begrenzen, können die Vertiefungen der Mikrotiterplatte z. B. mit chemisch fixierten ganzen Tachyzoiten beschichtet werden (WILLIAMS et al. 1997).

Die Parasitenmembranantigene können auch angereichert und in so genannte immunstimulierende Komplexe (Iscoms) eingeschlossen werden, die dann als Antigen im Test verwendet werden (BJÖRKMAN et al. 1994a). Das Iscom-Konzept wird also als Mittel benutzt, um amphiphatische Antigene wie die Tachyzoiten-membranproteine auszuwählen und somit die Anzahl innerer Proteine, die Probleme mit nicht spezifischer Bindung und Kreuzreaktivität verursachen können, zu verringern (BJÖRKMAN u. LUNDÉN 1998). Der erste veröffentlichte ELISA zum Nachweis von N.-caninum-Antikörpern war ein Iscom-ELISA. Dieser wurde zur Untersuchung von Hundeseren entwickelt und besaß im Vergleich zum IFAT als Referenzmethode eine Sensitivität und Spezifität von 97,6 % bzw. 95,6 % (BJÖRKMAN et al. 1994a).

Bei epidemiologischen Untersuchungen zur Neosporose ist es wichtig, zwischen akuter und chronischer Infektion unterscheiden zu können. Dazu können jedoch

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weder die Höhe der N.-caninum-IgG-Antikörper noch die Antikörperdynamik verwendet werden, weil diese Antikörper einerseits lange Zeit auf hohen Leveln persistieren und andererseits während der Trächtigkeit schwanken können (PARÉ et al. 1997). Daher wurde der Iscom-ELISA modifiziert, um die Analyse der IgG-Avidität zu ermöglichen. In dem Aviditäts-ELISA werden Antikörper mit einer niedrigen Avidität zum Antigen durch einen Inkubationsschritt mit Harnstoff nach der Seruminkubation wieder abgelöst. Die Antikörpertiter, die mit und ohne Harnstoffinkubation gemessen werden, werden benutzt, um den IgG-Aviditäts-Wert zu kalkulieren (BJÖRKMAN et al. 1999). Aviditätsuntersuchungen beruhen auf dem Phänomen, dass die ersten Antikörper, die nach Antigenkontakt bei einer Primärinfektion gebildet werden, eine geringere Avidität für das Antigen besitzen als die Antikörper, die später produziert werden. Der N.-caninum-IgG-Aviditäts-ELISA ist noch nicht vollständig evaluiert, aber die bisherigen Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, zwischen akuter und chronischer Infektion zu unterscheiden (BJÖRKMAN u. UGGLA 1999).

Es wurden auch andere Techniken versucht, um die Spezifität von ELISAs zu verbessern. Dazu gehört die Verwendung definierter rekombinanter Proteine als Antigen (LALLY et al. 1996a, LOUIE et al. 1997) oder das Einfangen eines spezifischen Antigens durch einen monoklonalen Antikörper (DUBEY et al. 1997).

Alle diese verschiedenen Antigenzubereitungen werden in verschiedenen Labors für den N.-caninum-ELISA benutzt (BJÖRKMAN u. UGGLA 1999). Die allgemein in ELISAs am meisten benutzten sekundären Antikörper sind polyklonale Antiseren, die gegen Immunglobuline der untersuchten Tierart gerichtet sind (BJÖRKMAN u.

UGGLA 1999). In einigen der veröffentlichten N.-caninum-ELISAs werden monoklonale Antikörper als Sekundärantikörper gegen spezifische Immunglobuline benutzt, um die Sensitivität und Spezifität des Tests zu steigern (BJÖRKMAN et al.

1994a, 1997, WILLIAMS et al. 1997).

Der ELISA erwies sich als nützliche Technik zum Nachweis von Antikörpern gegen verschiedene Antigene. Er ermöglicht eine schnelle Bestimmung und Titration der Antikörper (BJÖRKMAN u. LUNDÉN 1998). Gegenüber dem IFAT besitzt der ELISA den Vorteil, dass die Erfassung der Ergebnisse objektiv geschieht und der Test leicht automatisierbar ist. Deswegen ist der ELISA gut geeignet für Screening-Untersuchungen großer Probenzahlen, z. B. serologische Reihenuntersuchungen (BJÖRKMAN u. UGGLA 1999). Die Benutzung des ELISAs zum Nachweis von Antikörpern gegen N. caninum kann jedoch problematisch sein, wenn hohe Hintergrundabsorptionen und nicht spezifische Reaktionen, die am wahrscheinlichsten durch Kreuzreaktivität mit verwandten Kokzidien hervorgerufen werden, auftreten (HEMPHILL 1999).

2.5.1.3. DAT

Das Prinzip des DAT ist, dass intakte, formalinbehandelte Tachyzoiten in der Gegenwart spezifischer Antikörper agglutinieren. Durch Zusatz von Farbstoffen kann diese Agglutination sichtbar gemacht werden. Der Test detektiert nur IgG-Antikörper, weil spezifische und unspezifische Immunglobulin M (IgM)-Antikörper durch Zusatz von Mercaptoethanol zerstört werden. Für die Durchführung des Tests werden viele Tachyzoiten benötigt, damit die Reaktion in der Vertiefung der Mikrotiterplatten mit dem bloßen Auge sichtbar wird (BJÖRKMAN u. UGGLA 1999). Im Jahr 1998 beschrieben zwei unabhängige Veröffentlichungen einen DAT für N. caninum (PACKHAM et al. 1998, ROMAND et al. 1998). Als Antigen setzten ROMAND et al.

(1998) Tachyzoiten des caninen NC-1-Isolats ein, PACKHAM et al. (1998) benutzten Tachyzoiten des bovinen Isolats BPA-1. Sie stellten fest, dass die eingesetzte Tachyzoitensuspension eine Konzentration von 3-4 x 10⁴ Tachyzoiten/µl haben muss. Ist die Konzentration zu niedrig, kann man die Reaktion nicht sehen, ist sie zu hoch, sehen die negativen Ergebnisse aus wie schwach positive Reaktionen. Durch Untersuchung einer großen Anzahl von Seren von 16 verschiedenen Tierarten gelangten PACKHAM et al. (1998) zu dem Ergebnis, dass der DAT eine mit dem IFAT vergleichbare Sensitivität und Spezifität hat. Der Test erwies sich auch als hochspezifisch, als Seren von Tieren getestet wurden, die mit verwandten Parasiten (einschließlich T. gondii) infiziert waren (PACKHAM et al. 1998, ROMAND et al.

1998). ROMAND et al. (1998) untersuchten Seren von mit S. muris, S. neurona, S.

cruzi, H. hammondi und T. gondii immunisierten Kaninchen. Dabei kam es nur zu einer schwachen Kreuzreaktion bei einem Kaninchen, das mit S. cruzi immunisiert worden war. PACKHAM et al. (1998) stellten fest, dass es bei Untersuchung von hämolysierten Seren oder Fötalflüssigkeiten zu falsch positiven Ergebnissen im DAT kommen kann.

PACKHAM et al. (1998) testeten für den N.-caninum-DAT 15 verschiedene Farbstoffe, von denen sich Eosin Y am besten eignete, obwohl es das Pellet nicht so charakteristisch färbte, wie dies im kommerziellen Toxoplasma-Kit (bioMérieux, Marcy l'Etoile, Frankreich) der Fall ist. Wenn man den MAT für T. gondii mit dem für N. caninum vergleicht, kann man insgesamt sagen, dass die Agglutinationen im Toxoplasma-MAT charakteristischer und leichter ablesbar sind. Außerdem kann man den Toxoplasma-Testkit schon nach 5 Stunden ablesen, wohingegen der Neospora-MAT über Nacht inkubieren muss, was ein großer Nachteil dieses Tests ist (PACKHAM et al. 1998).

Der DAT ist ein Test zum Nachweis und zur Quantifizierung von IgG-Antikörpern gegen N. caninum bei verschiedenen Wirtsspezies. Er ist billig, leicht ables- und durchführbar und erfordert ein Minimum an Laborausstattung und Materialien. Mit

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diesem Test können Serumproben verschiedener Wirtsspezies in demselben Testdurchlauf mit vergleichbaren Agglutinationsmustern untersucht werden, ohne dass wie beim IFAT oder ELISA tierartspezifische Anti-IgG-Konjugate benötigt werden, die für jede Tierart zeitaufwendig standardisiert werden müssen. Der DAT ist gut geeignet für große epidemiologische Screening-Untersuchungen bei Feldstudien (ROMAND et al. 1998).

2.5.1.4. Immunoblot

Beim Immunoblot werden die Antigene durch Gelelektrophorese aufgetrennt, elektrophoretisch auf eine Trägermembran übertragen und dann mit Antikörpern nachgewiesen (VOET u. VOET 1994).

Der Immunoblot wird eher zusätzlich zu anderen Tests verwendet als als Mittel zur Routineuntersuchung von Seren. Er ist wichtig, um immunodominante Antigene zu identifizieren (ATKINSON et al. 2000b) und wurde auch in begrenztem Umfang bei Herdenuntersuchungen verwendet (SCHARES et al. 1998, ATKINSON et al. 2000a).

Ein positives Ergebnis liegt vor, wenn mindestens zwei von vier spezifischen immunodominanten Antigenbanden reagieren (SCHARES et al. 1998, 1999). Bei dieser Art der Auswertung scheint die Kreuzreaktivität mit T. gondii im Immunoblot vernachlässigbar, hängt jedoch von dem jeweils benutzten Antigenextrakt und den Serumverdünnungen ab (ATKINSON et al. 2000b). Wenn Kreuzreaktivität auftritt, ist sie mit keinem der immunodominanten Antigene assoziiert (BJERKÅS et al. 1994, PARÉ et al. 1995a, HOWE et al. 1998, SCHARES et al. 1998, ATKINSON et al.

2000a).