PCR zum Nachweis von Neospora-DNA

Weil immunhistochemische Untersuchungen of nicht sensitiv genug sind, sind sensitivere Techniken zum direkten Nachweis des Parasiten in Gewebeproben und Körperflüssigkeiten nötig. Deswegen konzentrierten sich viele Labors auf die Entwicklung Neospora-spezifischer PCRs zum Nachweis der Parasiten DNA. Die

Effizienz der Amplifikation mittels PCR ermöglicht die Untersuchung sehr kleiner Mengen als Startmaterial (HEMPHILL 1999). Außerdem kann das Verfahren durch die Verwendung so genannter Nested-Primer noch effizienter gestaltet werden (LALLY et al. 1996b, ELLIS et al. 1997). Aber man muss vorsichtig sein, um eine Kontamination zu vermeiden. Diese kann aus anderen Proben, aus der Umwelt oder von vorher amplifizierten PCR-Produkten stammen (HEMPHILL 1999).

Gegenwärtige PCRs, die in der Neospora-Diagnostik verwendet werden, basieren auf verschiedenen Sequenzen, z. B. dem Internal transcribed Spacer 1 (ITS-1) (HOLMDAHL u. MATTSSON 1996, PAYNE u. ELLIS 1996), rRNA-Gensequenzen (HO et al. 1996), dem 14-3-3-Gens von N. caninum (LALLY et al. 1996b) oder einer Neospora-spezifischen genomischen DNA-Sequenz, die mit Nc5 bezeichnet wird (KAUFMANN et al. 1996, MÜLLER et al. 1996, 2002, YAMAGE et al. 1996, LIDDELL et al. 1999a, b, HILL et al. 2001).

Die ITS-1-Region ist eine Zielsequenz, die den Vorteil hat, dass sie in einer hohen Anzahl an Kopien vorliegt (HOLMDAHL u. MATTSSON 1996, PAYNE u. ELLIS 1996, HOMAN et al. 1997). Die PCR auf Basis der ITS-1-Region kann spezifisch fünf N.-caninum-Tachyzoiten aus der Zellkultur nachweisen (HOLMDAHL u. MATTSSON 1996). Sie wurde erfolgreich an Gewebeproben experimentell infizierter Mäuse und an Liquor, Buffy-Coat-Zellen, Amnionflüssigkeit, Plazenta, Rückenmark, Herz und Gehirn experimentell infizierter Mutterschafe und Föten durchgeführt. ELLIS et al.

(1997) führten neue Primer zur Verwendung in einer Nested-PCR ein, um ein möglichst kurzes Fragment zu amplifizieren, weil die DNA, die von klinischem Material wie z. B. von autolysierten Föten stammt, oft degradiert ist. Dieser Test wurde auch erfolgreich an formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe durchgeführt. Im Jahr 1999 beschrieben ELLIS et al. (1999) eine Single-tube-nested-PCR, mit der man unter experimentellen Bedingungen 10 fg N.-caninum-DNA nachweisen kann.

HO et al. (1996) entwickelten eine kokzidienspezifische PCR, die eine konservierte Region des 18SrRNA-Gens amplifiziert. Das Amplifikat kann durch die Hybridisierung mit einer Neospora-spezifischen Sonde, die einen Unterschied von nur einem einzigen Basenpaar von einer ähnlichen Toxoplasma-spezifischen Sonde aufweist, identifiziert werden. Mit dieser PCR konnte unter experimentellen Bedingungen ein Neospora-Tachyzoit aus der Zellkultur oder 5 Tachyzoiten in Blutproben oder Amnionflüssigkeit, denen Tachyzoiten experimentell hinzugefügt wurden, nachgewiesen werden. Diese PCR kann N.-caninum-DNA in bovinem Gehirn, Rückenmark, Herz, Lunge, Nieren, Zwerchfell, Skelettmuskel und Plazenta sowie in Amnionflüssigkeit Neospora-infizierter Rinder detektieren (HO et al. 1997a).

Zusätzlich wurden N.-caninum-DNA-Fragmente aus verschiedenen fötalen Geweben

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von experimentell infizierten Rhesusaffen, einschließlich Gehirn, Herz, Lunge, Leber, Milz, Skelettmuskel, Haut und Plazenta, amplifiziert (HO et al. 1997b).

Die 14-3-3-PCR basiert auf der Sequenz des 14-3-3-Gens von N. caninum. Mittels einer Nested-PCR wurde ein 614 Basenpaar (bp) großes Fragment der DNA von N. caninum amplifiziert. Diese PCR amplifizierte keine Fragmente von T. gondii, S. muris, Sarcocystis tenella oder S. cruzi (LALLY et al. 1996b). Die Amplifikation von N.-caninum-DNA war sowohl aus Gewebeproben von experimentell infizierten Mäusen als auch aus infiziertem Mäusegehirn, das stark autolysiert war, möglich. Um die Sensitivität der PCR zu testen, wurde die PCR mit extrahierter DNA aus nicht infizierten Mäusegehirnen, zu denen DNA einer bekannten Anzahl von Tachyzoiten hinzugefügt wurde, durchgeführt. Dadurch konnte man feststellen, dass diese PCR etwa 5000 Parasiten pro g Gehirngewebe nachweisen kann.

KAUFMANN et al. (1996) stellten Primer für die Nc5-PCR her, die spezifisch ein 944 bp-Fragment der DNA von N. caninum amplifizierten. YAMAGE et al. (1996) entwickelten die PCR durch andere Primersätze (z. B. Np21⁺/Np6⁺) weiter. Mit dieser PCR kann man 10 pg Parasiten-DNA nachweisen. Es war möglich einen einzigen Neospora-Tachyzoiten vor dem Hintergrund von DNA, die aus 2 mg Gehirngewebe gewonnen wurde, zu detektieren. Später optimierten MÜLLER et al. (1996) diesen Test für die Anwendung in der Routinediagnostik. Sie führten das Uracil-DNA-Glycosidase-System ein, das eine mögliche Kontamination mit amplifizierter Ziel-DNA von vorherigen Reaktionen eliminiert. Der PCR folgt ein Ziel- DNA-Hybridisations-Assay, der die Neospora-spezifischen Amplifikationsprodukte unzweifelhaft identifiziert. Dieser Test ermöglicht den Nachweis von einem Parasiten aus der Zellkultur.

LIDDELL et al. (1999a) entwickelten eine quantitativ-kompetitive PCR, um die Menge von N. caninum in Geweben von infizierten Tieren festzustellen. Dazu synthetisierten sie ein Oligonukleotid, das in der PCR als Konkurrenz zur Neospora-spezifischen Nc5-Sequenz dient. Dieses Oligonukleotid dient gleichzeitig zur Erkennung möglicher falsch negativer Resultate. Mithilfe dieser PCR ist es möglich etwa 0,09 pg N.-caninum-DNA vor einem Hintergrund von 250 mg DNA aus Gewebe von der Maus darzustellen, was etwa einem Parasiten in 0,45 mg Mausgewebe entspricht (LIDDELL et al. 1999a, b).

HILL et al. (2001) isolierten N.-caninum-Oozysten aus Hundekot und extrahierten die DNA. Es folgte eine Nc5-PCR, bei der ein Kompetitionsmolekül verwendet wurde, um mögliche falsch negative PCR-Ergebnisse zu erkennen und die N.-caninum-Oozysten-DNA zu quantifizieren. Die Autoren konnten in 1 g schweren Kotproben Parasiten-DNA erst dann entdecken, wenn den Kotproben mehr als 50 Oozysten

zugefügt wurden. Diese Methode ist wichtig, um die Rolle des Hundes und anderer Karnivoren bei der Epidemiologie der Neosporose zu klären. Allerdings ist es vermutlich nötig, die Sensitivität weiter zu erhöhen.

MÜLLER et al. (2002) entwickelten eine Real-time-PCR, die es ermöglicht, die eingesetzte Parasitenmenge quantitativ zu ermitteln. Sie basiert auf der Nc5-Sequenz, einem dualen fluoreszierenden Hybridisationssonden-System und dem Real-time-PCR-Light-Cycler, welcher den Nachweis amplifizierter DNA ermöglicht.

Diese Real-time-PCR kann verwendet werden, um Infektionsintensitäten in Gewebe und Körperflüssigkeiten experimentell und natürlich infizierter Tiere festzustellen und ist damit nützlich für epidemiologische und klinische Studien sowie für die Erforschung effizienter Therapien.