Bei den bisherigen Versuchen zur Transposon vermittelten Transgenese erfolgte die Mikroinjektion immer in den Zygotenvorkern, meistens mit in vitro transkribierter mRNA als Transposasequelle (MATES et al., 2009).
In diesen Versuchen wurden die Transposon-Plasmide ins Zytoplasma injiziert. Die Arbeitshypothese war, dass die Transposonplasmide in den Zellkern transportiert werden und das SB100-Plasmid dort in mRNA transkribiert wird. Die Transposase-mRNA wird ins Zytoplasma transportiert, wo sie in SB100-Transposase-Protein translatiert wird. Diese transloziert in den Zellkern, wo dann die von LTR´s flankierte Transposon-Sequenz mit Hilfe der Transposase ins Genom integriert (transponiert) wird. Aufgrund dieser Schritte, war nicht klar, zu welchem Zeitpunkt in der Embryonalentwicklung die Transposition ins Genom erfolgt. Bei einer relativ späten Integration, etwa nach dem ersten Zellzyklus, wäre vor allem mit Mosaik-Integrationen zu rechnen gewesen. Auch der Einfluss der embryonalen Genomaktivierung, die bei der Maus zwischen 1- und 2-Zellstadium und beim Schwein im 4-Zellstadium erfolgt (CHRISTIANS et al., 1995; PRATHER, 1993) war nicht sicher vorhersagbar.
Die Mausstudie war ein Pilotprojekt, die wegen der sehr kurzen Reproduktionszeit in 8-12 Wochen durchgeführt werden konnte (HOGAN, 1986; WALL et al., 1996). Es sollte geklärt werden, ob die Transposon-vermittelte Transgenese auch mit der vereinfachten Mikroinjektion ins Zytoplasma möglich ist. Die Oozyten sind durchsichtig und die Vorkerne gut erkennbar, so dass sicher ins Zytoplasma injiziert werden konnte. Bei 2 Geburten wurden insgesamt 5 Jungtiere geboren. Die relative geringe Anzahl an Nachkommen (nur 5 von 64 übertragenen Embryonen) kann darauf hin deuten, dass die Injektion in die volumenmäßig kleineren Mauszygoten zu höheren Verlustraten als beim Rind führt, bzw. die Mäusezygoten den rel. hohen Injektionsdruck nicht so gut vertragen. Mit der Transferpipette könnten auch kleine Läsionen im Eileiter gesetzt werden, das austretende Blut hätte dann die Zygoten lysiert. Die Methode des Embryotransfers bei der Maus wurde nicht mehr routinemäßig im Labor durchgeführt und erst für diese Versuche wieder aufgenommen. Die Optimierung der Injektion in Mausezygoten oder der
Embryotransfer standen aber auch nicht im Fokus dieser Arbeit, sondern es sollte in einem „Proof-of-Principle“-Ansatz getestet werden, ob die zytoplasmatische Injektion zusammen mit Transposon-Plasmiden zur Transgenese bei Säugern führt. In einem Wurf konnte ein Tier makroskopisch unter spezifischer Anregung als Venus-GFP positiv bewertet werden, eines war negativ und eines zeigt eine Mosaikexpression.
Die Mäuse wurden dann mittels verschiedener molekularbiologischer Methoden untersucht. Zunächst wurden mittels PCR-DNA vom Venus-Plasmid aus Ohr- und Schwanzbiopsien nachgewiesen. Die SB100-Transposase und der Backbone-Anteil der Venus-Plasmide waren in der PCR nicht nachweisbar. Dieser Befund spricht dafür, dass eine Transposase vermittelte Integration in das Genom stattgefunden hat. Bei einer Zufallsintegration wären noch Sequenzen vom Backbone Anteil des Plasmids nachzuweisen gewesen. Bei der Mosaik-Maus sowie bei der negativen Maus konnte keine Keimbahntransmission gezeigt werden, die geborenen Nachkommen waren phäno- und genotypisch negativ. Bei der positiven Maus konnte eine Keimbahntransmission nachgewiesen werden. Die positiven Tiere aus der F1 Generation wurden weiter verpaart und eine Venus-Transposon-transgene Linie etabliert. Bislang erfolgte die Zucht bis zur F5-Generation, die Vererbung des Venus-Transgens erfolgte nach den Mendelschen Regeln, es konnten keine negativen Auswirkungen der Transgenität auf die Entwicklung festgestellt werden. Durch gezielte Verpaarung ist es gelungen, eine homozygote Linie zu etablieren.
Rückkreuzungen von phänotypisch-homozygoten Tieren mit Wildtyp-Tieren (n=3) ergaben insgesamt 35 uniforme phänotypisch Venus-positive Nachkommen. Ein Southern Blot wurde beispielhaft bei einigen Tieren aus der F1 Generation durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die phänotypisch positiven Mäuse nur eine Kopie des Venus-Transposons integriert hatten. Auch im Southern Blot konnten keine Hybridisierungssignale für das SB100–Hilfsplasmid, oder Backbone-Sequenzen nachgewiesen werden, somit ist von einer Transposase vermittelten Integration auszugehen. Unter spezifischer Anregung und sensitiver Detektion zeigten homozyote Tiere eine deutlich verstärkte Venus-Fluoreszenz gegenüber heterozygoten Tieren. Dies war sowohl in der Haut lebender Tiere, als auch in den inneren Organen makroskopisch sichtbar, was dafür spricht, dass in den
homozygoten Tieren beide Allele exprimiert wurden mit einem additiven Effekt auf die Venus-Fluoreszenz (Allel-Dosis-Effekt). Phänotypisch war nur in der Milz keine Expression detektierbar, dies wurde durch Northern Blot bestätigt. Obwohl der CAGGS-Promoter ubiquitär aktiv beschrieben ist, kam es zu keiner Expression in der Milz. Dieses Phänomen wurde auch in einer anderen Rbeit gefunden (KATTER, 2009).
Mit Hilfe der FACS-Analyse wurden die peripheren Leukozyten untersucht. Bei den positiven Tieren wurden zwei Populationen gefunden, eine mit schwacher Fluoreszenz und eine mit einer sehr starken Fluoreszenz. Diese Beobachtung ist möglichweise durch die Reifungszustände der Blutzellen bedingt. Eine Erhöhung der Fluoreszenz zwischen der hetero- und homozygoten Maus war nicht zu erkennen.
Möglicherweise war bei den Blutzellen der heterozygoten Maus schon ein maximaler Expressionslevel erreicht.
Die zytoplasmatische Injektion von Venus-Transposon und Transposase-Hilfsplasmid führte zur stabilen Transgenese. Es wurde eine Mauslinie mit einer spezifischen Integration des Venustransposons etabliert. Es konnte Keimbahn-expression erzielt und die Tiere konnten zu einer homozygoten Linie verpaart werden. Die phänotypisch positiven Tiere waren auch genotypisch positiv (n>100, Founder und Nachkommen). Silencing-Effekte und variegierende Expressionsmuster wurden nicht gefunden, in homozygoten Tieren war eine eindeutige Erhöhung der spezifischen Fluoreszenz nachweisbar (Dosiseffekt von 2 Allelen).
Beim Schwein wurden an 5 Versuchsstagen Transposon-Plasmide in das Zytoplasma injiziert. Am ersten und zweiten Versuchstag wurde eine Lösung von 10 pg/pl Venus-Transposon und 5 pg/pl Transposase verwendet, am dritten Versuchstag wurde wie in der Literatur (MATES et al., 2009) beschrieben, mit 10 pg/pl Venus-Transposon und einer künstlich erzeugten SB100-Transposase mRNA (5 pg/pl) injiziert. An den letzten beiden Versuchstage wurde die Menge des Transposase-Plasmids im Vergleich zu den ersten beiden Versuchstagen reduziert (2,5 pg/pl). Es wurden zwischen 20 und 40 Zygoten pro Empfängertier übertragen. In der Literatur sind Werte zwischen 44 bis 240 übertragene Embryonen pro Empfängertier zu finden, die Trächtigkeitsraten lagen im Schnitt bei 42,9 % (YIN et
al., 2002; BONDIOLI et al., 2001). In der vorliegenden Arbeit konnte bei 5 der 8 Empfängersauen eine Trächtigkeit etabliert werden. Die Trächtigkeitsrate lag bei 62,5 %, was über dem in der Literatur genannten Durchschnitt lag.
Die Trächtigkeit wurde mittels Ultraschall nachgewiesen, die Anzahl der Ferkel konnte jedoch nicht genau bestimmt werden. Die beiden tragenden Sauen vom ersten Versuchstag wurden an Tag 30 geschlachtet, um schnellst möglich Einblick in mögliche Transgenität zu bekommen. Von den 6 gewonnenen Feten waren vier positiv. Ein Fetus war bereits degeneriert und hatte nur eine positive Amnionhülle.
Diese ersten Ergebnisse zeigten schon, dass eine Transposon vermittelte Transgenese beim Schwein möglich zu sein schien. Die etablierte Trächtigkeit vom zweiten Versuchstag wurde deshalb nicht abgebrochen, sondern die Ferkel wurden ausgetragen. Von den 12 Ferkeln waren 5 positiv und 7 negativ. 4 negative und 3 positive Ferkel verstarben, was nicht auf die Transgenität zurückzuführen war, sondern auf eine vorhandene Infektion.
Am 3ten Versuchstag wurde die alternative-Injektionslösung mit mRNA als Transposase-Quelle eingesetzt, entsprechend den Angaben aus der Literatur (MATES et al., 2009). Bei der Schlachtung wurden 17 Feten gewonnen, wobei diese sich bei allen folgenden Untersuchungen sowohl phänotypisch als auch genotypisch als negativ herausstellten. Eine mögliche Erklärung ist hier, dass die mRNA für eine Injektion ins Zytoplasma nicht stabil genug ist, so dass das Transposase-Enzym nicht mehr translatiert werden konnte und somit eine Integration nicht möglich war.
Am 4ten und 5ten Versuchstag wurde die Lösung mit dem reduzierten Transposase Anteil eingesetzt. Hintergrund war, dass in den transgenen Feten aus den ersten Durchgängen meistens Mehrfach-Integrationen nachgewiesen wurden. Durch die verminderte Konzentration des Transposase-Hilfsplasmids sollte die Wahrscheinlichkeit für Einfach-Integrationen erhöht werden. Am 4ten Versuchstag konnte keine Trächtigkeit etabliert werden, dies lag sehr wahrscheinlich an der schlechten Eizellqualität. Am 5ten Versuchstag wurden 5 Feten gewonnen, die in allen Untersuchungen negativ waren. Hier ist zu vermuten, dass die Transposase-konzentration zu niedrig war. Möglicherweise gibt es einen sehr engen Konzentrationsbereich der injizierten Plasmide, um eine funktionelle
Transposase-Konzentration in der Zygote zu erzielen. Dieser Aspekt bedarf weiterer Abklärung in zukünftigen Untersuchungen.
Der Vorteil der hier etablierterten Methode zur Transgenese beim Schwein liegt besonders in der hohen Rate transgener Feten und Ferkel, die unter den besten Konzentrations-Bedingungen (10pg/pl Transposon, und 5 pg/pl SB100-Transpoase-Plasmid) der Expressionsplasmide erzielt wurden. Zum anderen ist mit der zytoplasmatischen Injektionsmethode eine bessere Ausnutzung der aus dem Ovidukt von superovulierten Spendertieren gespülten Embryonalstadien möglich. Bei der Spülung ist immer eine gewisse Variabilität in der Entwicklung zu beobachten, hier wurde eine Spannbreite von möglichen frisch befruchteten Eizellen bis 2-Zell-Stadien gespült (Tab.14). Die zytoplasmatische Injektion ist in allen dieser Stadien möglich (Abb.47). Dagegen wäre die klassische Injektion in einen Vorkern nur in einer kleineren Fraktion der Embryonen möglich, und würde so eine größere Anzahl von Versuchstieren für die Superovulation nötig machen.
Pronukleaere Injektion
Zytoplasmatische Injektion
Fertilization Dekondensation Pronukleus-Phase DNA-Replikation, NMB 2-Zeller
Abb. 47: Injektionszeitfenster für pronukleäre und zytoplasmatische DNA-Injektion.
Vereinfachte Darstellung, zur Veranschaulichung sind spezies-spezifische Aspekte, wie gefärbtes Zytoplasma bei Schweinezygoten, weggelassen worden.
Da bei den erhaltenen Entwicklungsstadien (Zygoten und 2-Zeller) auch die 2-Zell-Stadien in jeweils nur eine Blastomere injiziert wurden, könnte dies den beobachteten Zell-Mosaizismus in einem normal entwickelten und einem degenerierten Fetus erklären. Bei 2 der Feten war zudem der Backbone-Anteil mittels PCR nachweisbar, bei einem sogar auch noch das SB-Plasmid. Im Southern Blot konnten keine SB oder Backbone-Sequenzen nachgewiesen werden, so dass davon auszugehen ist, dass die Backbone-Anteile nicht integriert wurden, sondern in der hoch-sensitiven PCR episomal vorhandene DNAs nachzuweisen waren.
Ein Fetus zeigte eine Einfachintegration des Venus-Transposons, alle anderen wiesen mehrere, unabhängige Integrationen des Venus-Transposons als Einzelkopie auf. Die unterschiedliche Anzahl der Einzelkopien ist wahrscheinlich für die gemessenen, unterschiedlichen Fluoreszenzintensitäten der Schweinezellen verantwortlich. Wahrscheinlich werden wie bei der transgenen Mauslinie alle Kopien exprimiert und addierten sich in der Flureszenz auf (Gen-Dosis-Effekt).
Mit der Splinklerette PCR konnte bewiesen werden, dass tatsächlich eine transpositionelle Integration stattgefunden hat, da alle identifizierten Integrationsorte einen definierten Übergang von der ITR-Sequenz in die genomische Sequenz aufwiesen.
Die beiden positiven Eber sind inzwischen geschlechtsreif und sollen für die Zucht eingesetzt werden, um hier den endgültigen Nachweis der Keimbahntransmission zu erbringen.
Die Ergebnisse zeigen, dass das SB100 Transposasesystem erfolgreich zur Generierung transgener Schweine angewendet werden.
5.3 Zusammenfassende Betrachtung und Ausblick
In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst gezeigt, dass humane Telomerasekomponenten in bovinen Embryonen mittels der zytoplasmatischen Plasmidinjektion exprimiert werden können und dies mit einer Verlängerung der Telomeren, sowie der Erhöhung der Telomeraseaktivität in der Blastozyste verbunden ist. Bovine Blastozysten mit verlängerten Telomeren, könnten eine vielversprechende Möglichkeit sein, bovine embryonale Stammzellen aus den
Blastozysten zu isolieren, da bei Mäusen eine Stammzellisolierung erfolgreich ist und diese wesentlich längere Telomeren aufweisen.
Beim Menschen wurde gezeigt, das Embryonen, die die kritische Telomerenlänge unterschritten haben, nicht mehr in der Lage sind, in der Gebärmutter zu implantieren (KEEFE et al., 2005). Eine Modulation der Telomeraseaktivität könnte also ein wichtiger Schritt für die Entwicklung von therapeutischen Strategien für den humanen Embryotransfer sein.
Mit dem SB100 Transposasesystem sind erstmals transgene Schweine erzeugt worden. Dies bringt große Chancen für eine effiziente Erzeugung transgener Nutztiere mit sich. Das Transposonkonstrukt trägt loxP sites, die es erlauben, in den angelegten Fibroblastenkulturen der positiven Feten ein Cre-Rekombinase vermittelten Kassettenaustausch vorzunehmen und damit funktionelle Transgene in vordefinierte chromosomale Loci einzubringen (Abb. 48).
CAGGS Venus
ITR ITR
gene of interest gene of interest
Cre-Rekombinase
loxP loxP
Abb. 48: Definierter Kassettenaustausch in kultivierten Zellen
Transgene Schweinezellen mit einer Einzelintegration des Venustransposon werden mit einer Austausch-DNA und einem Plasmid für Cre-Rekombinase elektroporiert. Sowohl das Transposon als auch die Austausch-Kassette tragen mutierte loxP-Sequenzen, die einen Cre-vermittelten Austausch ermöglichen.
Dadurch sollte es möglich sein, vordefinierte Expressionshöhen und –muster zu produzieren und ein Screening auf exprimierende transgene Founder-Tiere bei minimalen Tierzahlen durchzuführen. Für einen definierten Kassetten-Austausch bietet sich insbesondere die fetale Zellkultur an, die eine Einfachintegration des Venustransposons trägt. Aus Zellkulturen mit erfolgreichem Kassettenaustausch können dann über den somatischen Kerntransfer transgene Tiere mit definiertem Expressionsmuster erstellt werden.
Zusammenfassend stellen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit einen wesentlichen Schritt zur Verbesserung der Produktion transgener Großtiermodelle für verschiedene Anwendungsbereiche dar.
6 Zusammenfassung
Wiebke Garrels
Transgene Expression durch zytoplasmatische Injektion von Plasmiden und Transposon-basierten Konstrukten in Säugerembryonen
Im ersten Teil der Arbeit wurden zirkuläre Expressionsplasmide für die RNA-Komponente (hTERC) der humanen Telomerase und beide Telomerase-Gene (hTERT und hTERC) in das Zytoplasma in vitro produzierter Rinderzygoten injiziert.
Bei den Plasmiden handelte es sich um zirkuläre, kovalent geschlossene (ccc)-Plasmide, die in der Regel eine transiente Transgenese induzieren. Mit der Injektion sollten die Auswirkungen einer ektopischen Expression der humanen Telomerase-komponenten in bovinen Blastozysten untersucht werden.
Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Limitierung der transienten Transgenese überwunden werden, indem die zytoplasmatische Plasmidinjektion mit einem nicht autonomen Transposon-System kombiniert wurde. Folgende Ergebnisse wurden erzielt:
1. Die humane TERC Komponente konnte in bovinen Blastozystenstadien ektopisch exprimiert werden. Dies führte zu einer signifikanten Verlängerung der Telomeren im Vergleich zu nicht injizierten Kulturkontrollen. Die Aktivität der Telomerase war erhöht.
2. Das humane Telomerase-Holoenzym konnte durch Plasmidinjektion von hTERC und mhTERT in bovinen Blastozysten exprimiert werden. Auch dies führte zu einer signifikanten Verlängerung der Telomeren im Vergleich zu nicht injizierten Kulturkontrollen. Die Aktivität der Telomerase war erhöht. Es ergab sich keine weitere Verlängerung im Vergleich zur alleinigen Expression des humanen TERC.
3. Im zweiten Teil der Arbeit wurden mit Hilfe der Kombination aus zytoplasmatischer Plasmidinjektion und dem nicht autonomen Transposon-System SB100 stabil-transgene Mäuse generiert. Das Transgen (Venus-Transposon) war durch spezifische Transposition als Einzelkopie in das Genom integriert worden; es war keimbahngängig und eine transgene Mäuselinie konnte etabliert werden, diese ist auch als homozygote Linie gezüchtet worden. Das Expressionsmuster war ubiquitär entsprechend der Aktivität des CAGGS-Promoters. Lediglich in der Milz und den roten Blutzellen war keine Expression nachweisbar. Eine variegierende Expression oder Gen-Silencing wurde nicht beobachtet. Interessanterweise war ein eindeutiger Allel-Dosis-Effekt nachweisbar, alle homozygoten Mäuse (2 Transgen-Allele) zeigten eine höhere Expression als heterozyogote/hemizygote Mäuse (1 Transgen-Allel). Beide Allele wurden exprimiert und trugen zur Erhöhung des Proteingehalts des Transgens bei.
4. Die Kombination aus zytoplasmatischer DNA-Injektion und Transposon-Plasmiden wurde erfolgreich für die Transgenese beim Schwein eingesetzt.
Hier wurden mit hoher Effizienz die ersten Transposon-transgenen Schweine erzeugt. Die positiven Eber sind mittlerweile ein halbes Jahr alt und sollen verpaart werden, um auch beim Schwein die Keimbahntransmission zu verifizieren.
.
7 Summary
Wiebke Garrels
Transgenetic expression by cytoplasmic injection of plasmids and transposon-based constructs in mammalian embryos
In the first part of this study circular expression plasmids for the RNA component (hTERC) of human telomerase, and both genes encoding for the telomerase holo-enzyme (hTERC and mhTERT), respectively, were injected into the cytoplasm of in vitro produced bovine zygotes. The injection of covalently closed circular (ccc) plasmids typically leads to transient transgenesis and was used here to study the effects of ectopic expression of human telomerase components in bovine blastocysts.
In the second part of the study the focus was to resolve the limitations of transient transgene expression by combining the cytoplasmic plasmid injection with an autonomous transposon system.
The following results were achieved:
1. The human TERC component was ectopically expressed in bovine blastocysts. This led to a significant elongation of telomeres compared to the non-injected controls. The activity of the telomerase was measured and an increase in telomerase activity was observed.
2. The human telomerase holoenzyme could be reliable expressed through plasmid-based injection of hTERC and mhTERT in bovine blastocysts. This lead to significant elongation of the telomeres compared to the non-injected culture controls; the telomerase activity was slightly enhanced. No further elongation was achieved through the combined expression when compared to the hTERC group.
3. The combination of cytoplasmic plasmid injection and non-autonomous SB100 transposon resulted in transgenic mice. The transgene (Venus-transposon) was integrated as a single copy into the genome, germline transmission was confirmed and a transgenic mouse line was established, which could be maintained as a homozygous mouse line. The expression pattern was in accordance with the tissue specificity of the CAGGS promoter and no variegated expression or gene silencing was observed. Interestingly, a distinct allel-dose-effect was detected. Bi-allelic expression of the transgene was observed in all homozygous mice (2 alleles of the transgene). This led to a higher expression compared to heterozygous/hemizygous mice (1 allele of the transgene) and the presence of a larger amount of protein in the homozygous mice.
4. The combination of cytoplasmic DNA-injection and transposon plasmids was successfully applied for the production of transgenic pigs and the first transposon-transgenic pigs were produced. The transgenic boars are now 6 months old and will be used to study germline transmission of the transgene by breeding, when the animals reach sexual maturity.
Auszüge der vorliegenden Arbeit wurden bereits der veröffentlicht
2nd International Congress on Stem Cells and Tissue Formation 6-9.7.2008, Dresden, Deutschland
W. Garrels, W. Kues, U. Baulain and H. Niemann (2008):
“Experimental modulation of telomerase activity in bovine embryos”
NRW, Stammzellmeeting Aachen, Deutschland
W. Garrels, W. Kues, U. Baulain and H. Niemann (2008):
“Experimental modulation of telomerase activity in bovine embryos”
ESDAR-Meeting (European Society for Domestic animal Reproduktion) 9-12.09.2009, Gent, Belgien
W. Garrels, W. Kues, D. Herrmann, S. Holler, U. Baulain and H. Niemann (2009):
„Modulation of telomerase activity in bovine embryos using cytoplasmatic plasmid injection”
Annual Conference of the International Embryo Transfer Society (IETS) 9-12.01.2010, Cōrdoba, Argentinien
Wiebke Garrels, Wilfried Kues, Doris Herrmann, Stephanie Holler, Ulrich Baulain and Heiner Niemann (2010):
“Modulation of telomerase activity in bovine embryos by cytoplasmic plasmid injection results in elongated telomeres”
9th Transgenetic Technology Meeting 22-24.03.2010, Berlin, Deutschland
Wiebke Garrels, Lajos Mates, Stephanie Holler, Heiner Niemann, Zsuzsanna Izsvak, Zoltan Ivics and Wilfried A. Kues (2010):
“Production of Transgenic Pigs by the Sleeping Beauty Transposon System”
Gedruckt als Meeting-Abstract in Transgenic Research 19, 336.
ESDAR-Meeting
26-28.9.2010, Eger, Ungarn
Garrels, W., Mates, L., Holler,S., Niemann, H., Izsvak, Z., Ivics, Z.,Kues, W:A: 2010.
“Generation of transgenic pigs by the Sleeping Beauty transposition in zygotes”
Gedruckt in Reprod. Dom. Anim. (in press)
8 Anhang
8.1 Angaben zu den Transposon-Plasmiden mit Primer-Sequenzen