3.2 Transposon-Injektionen in das Zytoplasma von Zygoten der Maus
3.2.1 Mäusezygoten
3.2.1.1 Superovulation und Gewinnung der Eizellen
Für die Embryonengewinnung wurden weibliche, 6-9 Wochen alte Tiere des Auszuchtstammes NMRI der Firma Harlan Winkelmann bzw. aus der eigenen Erhaltungszucht eingesetzt. Zur Verpaarung standen männliche Tiere vom gleichen Stamm mit einem Mindestalter von 12 Wochen zur Verfügung. Die Tiere wurden in Gruppen von bis zu sechs Tieren im klimatisierten Kleintierstall des Institutes bei einer Temperatur von 21°C in Makrolon Käfigen (Fa. Ebeco, Berlin) auf Labortier-einstreu (Ssnif, Bielefeld) gehalten; die relative Luftfeuchte betrug 50-65 % und Belichtung erfolgte für 12 Stunden von 6.00 bis 18.00 h nach Winterzeit. Die Mäuse wurden mit Wasser und pelletiertem Alleinfutter ad libitum versorgt.
Bei den Mäusen wurde eine Superovulation durch intraperitoneale Gabe von 10 I.E.
PMSG (Pregnant Mare´s Serum Gonadotropin, Intergonan ®, Vemie, Kempen) ausgelöst, diese Injektion wurde gegen 12.00 h durchgeführt. 48 Stunden später erfolgte eine intraperitoneale Gabe von 10 I.E. hCG (human Chorion Gonadotropin, Primogonyl@, Schering, Berlin). Im Anschluss an die hCG Injektion wurden die Tiere einzeln mit den Böcken zusammengesetzt. Die Ovulationen bei den Mäusen waren
etwa 10-13 Stunden nach hCG Gabe zu erwarten, also gegen 24.00 h. Die erfolgreiche Verpaarung konnte am nächsten Morgen durch Vorhandensein eines vaginalen Koagulationspfropfes überprüft werden (Tag 0).
Die Gewinnung der Zygoten wurde nach dem von Hogan (HOGAN et al.,1986) beschriebenen Prinzip durchgeführt. Spendertiere mit einen Vaginalpfropf wurden 20 Stunden nach der Gabe des hCGs mittels cervicaler Dislokation getötet.
Anschließend wurden die Bauchhöhle eröffnet und die inneren Geschlechtsorgane freigelegt. Die Ovarien wurden mit dem Eileiter und einem Stück vom Uterus aus der Bauchhöhle entfernt und in eine Petrischale mit PBS gegeben, dem 0,3 % BSA (Fraktion V) zugegeben waren. Die Eileiter wurden unter einem Stereomikroskop (Wild, Heerburg) bei 40-facher Vergößerung vom Infundibulum aus in Richtung Uterus mit einer stumpfgeschliffenen Knopfkanüle gespült. Auch hier diente das PBS mit BSA Zusatz als Spülmedium. Wenn die gewonnenen Zygoten noch von Kumuluszellen umgeben waren, wurden sie kurzzeitig in 300 µl/ml Hyaluronidase (SIGMA) gesetzt. Anschließend wurden alle Zygoten durch dreimaliges Waschen in frisches Spülmedium überführt. Nur Zygoten mit zwei Polkörpern wurden als befruchtet angesehen. Nach der Beurteilung wurden die Zygoten in Petrischalen mit 35 mm Ø überführt, die 60 µl Tropfen des mit Silikonöl überschichteten Spülmediums enthielten. Anschließend wurden die Petrischalen bis zur Mikromanipulation in einem Inkubator (Fa. Melag, Berlin) bei 37°C in feuchtigkeitsgesättigter Luft aufbewahrt.
3.2.1.2 Mikroinjektion in das Zygoten-Zytoplasma 3.2.1.2.1 Verwendete Plasmide
3.2.1.2.1.1 Transposon
In dem Transposon-Konstrukt wird eine Venus-cDNA von dem ubiquitären Chicken beta Actin Intron (CAGGS)-Promoter angetrieben (CAGGS, steht für chicken beta actin promoter/enhancer gekoppelt mit dem Cytomegalievirus immediate–early enhancer, es handelt sich hier also um einen Hybrid-Promoter aus dem Hühnchen Actin-Promoter und Teilen des CMV-IE-Enhancers-Promoters). Dieses
Expressions-konstrukt ist von SB-ITRs flankiert. Venus ist eine gelbverschobene Fluorochrom-variante des eGFP und kann als Lebendmarker eingesetzt werden. Eine schema-tische Darstellung des Venus-Transposon-Konstruktes ist in Abbildung 13 zu sehen.
Abb. 13: Schematische Darstellung des Venus-Transposon-Plasmides
3.2.1.2.1.2 Transposase Sleeping Beauty-Plasmid
Sleeping Beauty ist eine KlasseII-Transposase. Durch die Separation von den LTRs ist ein nicht-autonomes Transposon-System entstanden und der transpositionelle Prozess kann kontrolliert werden. SB100 ist eine hyperaktive Mutante mit 100-fach höherer Effektivität im Vergleich zur ursprünglichen SB-Transposase (MATES et al., 2009). Das SB100 Transposase ist schematisch in Abbildung 14 dargestellt. Die cDNA von SB100 wird von einem ubiquitären CMV-Promoter transkribiert.
Abb. 14: Schematische Darstellung der SB100 x - Transposase
Die beiden Plasmide wurden von Zoltan Ivics (Max-Delbrück-Zentrum, Berlin) zur Verfügung gestellt. Sie wurden in spezifischen E. coli Stämmen amplifiziert und per Ionenaustauscher-Säulenchromatographie aufgereinigt.
Die Mikroinjektionen wurden, wie in 3.1.2 beschrieben, durchgeführt. Im Gegensatz zu den Rinderversuchen wurden Haltepipetten benutzt, die nur einen Ø von 60 µm hatten. Desweiteren wurde die Mikromanipulation nicht in TCM-air durchgeführt, sondern in Spülmedium mit 0,3 %-BSA Zusatz. Die Injektionslösung wurde mit 10 fg/pl Venus-Transposon-Plasmid und mit 10 fg/pl SB-Plasmid angesetzt. Pro Injektion wurden ca. 10 pl ccc-Plasmidlösung appliziert.
3.2.1.3 Empfängertiere, Embryotransfer und geborene Nachkommen
Für den Transfer der injizierten Zygoten wurden NMRI-Mäuse in natürlicher Östrusphase im Alter von mindestens zwei Monaten verwendet. Diese Weibchen wurden in großen Käfigen in Gruppen bis zu sechs Tieren gehalten und pro Käfig wurde ein vasektomiertes Männchen einen Tag vor dem Transfer dazu gesetzt. Am Tag des Transfers erfolgte eine Kontrolle auf Vorhandensein eines Vaginalpfropfes.
Für den Embryotransfer wurden Weibchen mit eindeutigem Pfropf in Narkose gelegt.
Der Zugang zu den Eileitern erfolgte über die seitliche Bauchwand. Etwa 15 Zygoten wurden pro Transfer mit einer Transferkanüle in einen Eileiter gegeben, die Unterhautmuskulatur vernäht und die Haut geklippt. Insgesamt wurden 5 Transfers durchgeführt.
3.2.1.4 Isolation von genomischer DNA aus Mäuseschwänzen
Zur Genotypisierung von Mäusen wurden diese in Narkose gelegt und ca. 3 mm der Schwanzspitze abgetrennt. Die Blutung wurde mit einem Elektrocounter gestoppt.
Die Schwanzspitze wurde in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen gegeben und mit 560 µl Tail-Lysispuffer (1 M Tris-HCL pH 8; 3 M NaCl2; 0,5 M EDTA; 20% SDS) und 40 µl (10 mg/µl) Proteinase K Lösung versetzt. Über Nacht wurde bei 50°C auf einem Thermoschüttler (Stärke 10) inkubiert. Am nächsten Morgen wurde bei Raumtemperatur für 15 Minuten bei 14.000 U/min zentrifugiert. 400 µl Überstand wurden abgenommen und in ein frisches Zentrifugenröhrchen zu 560 µl gesättigter NaCl Lösung gegeben. Per Hand wurde ein paar Mal geschüttelt und anschließend wurde für 15 Minuten erneut zentrifugiert. Dann wurden 700 µl Überstand in ein neues Röhrchen zu 700 µl 100 % Ethanol pipettiert und sofort vermischt (DNA-Präzipitation). Anschließend wurde erneut für 15 Minuten zentrifugiert und danach der Überstand vorsichtig abgegossen. Das abgegossene DNA-Pellet wurde mehrmals mit 70 % Ethanol gewaschen, bis es fast durchsichtig erschien. Die DNA wurde getrocknet und in dest. Wasser bei 37°C aufgelöst. Zuletzt wurde die Konzentration der DNA mit dem Nanodrop-Messgerät bestimmt.
3.2.1.5 PCR
Die PCR wurde wie unter 3.1.4.2 beschrieben durchgeführt. Die PCR-Protokolle für die Mäuse und Schweineexperimente waren identisch und werden deshalb bei den Schweineversuchen (siehe 3.2.2) nicht nochmals erwähnt. Die unter 3.2.1.4 gewonnene DNA aus den Mäuseschwänzen, sowie die unter 3.2.2.5 gewonnene DNA aus den Ohrkerben der Ferkel bzw. unter 3.2.2.6 gewonnene DNA aus den Fibroblastenkulturen der gewonnenen Feten wurde zur Typisierung eingesetzt.
3.2.1.5.1 Oligodesoxynukleotide (Primer) für die PCR und Temperaturprofile Die verwendeten Primer mit den entsprechenden Sequenzen sind in Tabelle 7 dargestellt. Die synthetisierten Primer wurden von der Firma Eurofins bezogen. Die ersten 3 Primer dienen dem spezifischen Transkriptnachweis, Poly A dient wieder als Positivkontrolle für die erfogreiche RNA-Präparation.
Tab. 7: Übersicht über die verwendeten Primer.
Die Primersynthese erfolgte bei der Firma Eurofins MWG.
Gen Primersequenz Größe de
s Amplifikats [bp] Postion des Primers Datenbank - nummer/ Referenz
YFP
3.2.1.5.1.1 Temperaturprofile der PCR Programme für die Amplifikation spezifischer Gentranskripte
Tabelle 8 enthält die PCR Programme und Temperaturen für die jeweiligen Primer-paare.
Tab. 8: Temperaturprofile für die bei den Transposonversuchen verwendeten Primer
Erste Denaturierung Denaturierung während der Zyklen Anlagerung der Primer Extension der DNA Zyklenzahl Finale Extension Endtemperatur
YFP 97°C, 2 min 95°C,15 s 63,4°C, 20 s
77°C, 15 s 32
72°C, 5 min
8°C SB 97°C , 2min 95°C, 15 s 59,2°C, 20
s
77°C, 15 s 40 8°C BBB 97°C, 2 min 95°C,10 s 59°C, 45 s 72°C, 1 min 37 8°C Poly A 97°C, 2 min 95°C,15 s 57°C, 20 s 72°C, 15 s 32 8°C
3.2.1.6 Southern Blot
Die Southern Blots für die Transposons waren bei Mäusen und Schweinen identisch, deshalb werden sie bei den Schweineversuchen 3.2.2 nicht mehr erwähnt. Als Material wurden bei den Mäusen die gewonnene DNA aus den Schwänzen (siehe 3.2.1.4) und bei den Schweinen die DNA aus Ohrkerben (3.2.2.5) und die DNA aus den Fibroblastenkulturen (3.2.2.6) verwendet.
Die Southern Blots von Geweben wurden wie unter 3.1.6. beschrieben durchgeführt, mit dem Unterschied, dass die Membran über Nacht hybridisiert und bei 65°C in 0,1 % SSC + 0,1 % SDS gewaschen wurde. Da insgesamt 3 Sonden auf die Membran aufgetragen werden mussten, wurde die Membran nach jeder Auswertung gestrippt, indem sie zunächst einmal in dest. Wasser gewaschen wurde. Es folgte ein zweimaliges Waschen für je 15 Minuten bei 37°C in 0,2 M NaOH + 0,1 % SDS gefolgt von einmaligem Waschen in 2 x SSC für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
Dann konnte die Membran erneut prähybridisiert und anschließend über Nacht hybridisiert werden.
Der Verdau der genomischen DNA wurde wie folgt angesetzt:
10 µg DNA
1,5 µl NcoI (NEB, USA) 3 µl 10xPuffer 3 (NEB, USA) 25,5 µl H2O (ad 30 µl)
Es wurde jeweils der gleiche Ansatz für das Sleeping Beauty und das Venus Plasmid gemacht:
1 µl Probe (100ng) 1 Nco I
2 µl 10xPuffer 3 16 µl H2O (ad 20 µl)
Die Lösung wurde so verdünnt, dass pro Geltasche 50 pg Plasmid eingesetzt wurden.
3.2.1.7 SB-Transposase Sonde
Zunächst wurde das SB-Plasmid für drei Stunden mit HpaII verdaut und so in ca. 13 Fragmente zerlegt. Dies erfolgte in einem 100 µl Ansatz:
10 µg Plasmid in 40 µl 5 µl HpaII
10 µl 10xPuffer IV (NEB) 45 µl H2O (ad 100)
Anschließend erfolgte eine Phenolfällung (TRI Reagent, Applied Biosystems, Deutschland ):
+ 400 µl H2O + 500 µl Phenol
Das Ganze wurde gemischt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Der Überstand wurde in ein unbenutztes 1,5 ml Zentrifugationsröhrchen gegeben.
Anschließend wurden bezogen auf die Menge des Überstandes 10 % 4 M LiCl und 250 % reiner Ethanol hinzugegeben.
Das Ganze wurde über Nacht bei -20°C präzipitiert und anschließend bei 15.000 g für 30 Minuten sedimentiert. Der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde zweimal mit 70 % Et0H gewaschen und anschließend getrocknet. Das Pellet wurde in 20 µl Wasser gelöst. Es folgte eine Markierung von 1 µg des linearisierten Plasmids mit dem DIG High Prime DNA Labeling Kit (Roche Diagnostics) in einem 20 µl Ansatz laut Angabe. 1 µl der gelabelten Sonde wurden in 9 ml Dig Easy Hybridisationslösung eingesetzt.
3.2.1.8 Venus Transposon- und Backbone-Sonde
Zunächst wurde das Venus-Transposon Plasmid für drei Stunden mit EagI bei 37 °C verdaut, dies resultierte in einem 1400 bp großen Fragment (Venus-GFP) und einem 3,5 kb großen Fragment (Backbone). Diese wurden einzeln markiert.
Der Verdau erfolgte in einem 100 µl Ansatz:
12 µg Plasmid in 40 µl 5 µl Eag I
10 µl 10x Puffer 3 (NEB) 45 µl H2O (ad 100)
Anschließend wurden die Fragmente in 1 % Agarosegel aufgetrennt. Die beiden Banden wurden ausgeschnitten und aufgereinigt. Die Markierung der beiden Fragmente (Venus und Backbone) erfolgte mit dem DIG High Prime DNA Labeling Kit (Roche Diagnistics) laut Angabe. Für die Markierungsreaktion wurden ca. 300 ng der DNA aus der jeweiligen Bande eingesetzt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Der Markierungsansatz wurde dann nochmal aufgereinigt mit dem Quiagen PCR Aufreinigungskit. Hierzu wurde der Markierungsansatz in 40 µl Elutionspuffer eluiert.
Von diesem aufgereinigten Markierungsansatz wurden dann 15 µl in 8 ml DIG Easy Hybridisierungs Lösung für die jeweilige Hybridisierung eingesetzt.
3.2.1.9 Northern Blot
3.2.1.9.1 Herstellung der Sonde
Das pBKS-CMV GFP Plasmid wurde mit AgeI (NEB) linearisiert und über eine Phenol/Chloroform Extraktion aufgereinigt. Von dem aufgereinigten Plasmid wurde 1 µg eingesetzt und Digoxigenin markiert über in vitro Transkription mit T 7 RNA Polymerase (Dig Northern Starter Kit, Roche Diagnostics GmbH). Die Größe der markierten RNA-Sonde betrug ca. 900 bp. Die Sonde lag in einer Konzentration von ca. 400 ng/l vor. Für die Hybridisierung wurden in 9 ml Dig Easy Hybridisations-lösung (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) 2,5 µl der Sonde eingesetzt, was eine Konzentration von 100 ng/ml ergab.
3.2.1.9.2 Vorbereitung der Proben
Die Gewebeproben der Maus wurden mit dem Northern Blot untersucht. Proben von Herz, Lunge, Leber, Milz, Muskel, Hoden und Niere wurden aufgearbeitet und zwar jeweils eine positiv und eine negativ Kontrolle.
Es wurde eine Menge von 50 bis 100 mg Gewebe mit TRIReagent® (Ambion) nach Anweisung aufgearbeitet. Pro Probe wurden jeweils 5 µg gesamt RNA verwendet.
Diese wurden dann zu 20 µl Ladepuffer gegeben. Es folgte eine Denaturierung der RNA bei 65°C für 10 Minuten, anschließend wurde diese für 1 Minute auf Eis runtergekühlt. Dem 1 % Agarosegel, das mit N-morpholino propanesulfon Säure (MOPS) angesetzt wurde, wurden pro 100 ml Gel 2 ml 37 % Formaldehyd hinzugegeben. Das Gel wurde mit den RNA Proben beladen und etwa 3 Stunden bei 45 Volt laufengelassen, bis die Proben gut aufgetrennt waren. Als Größenstandard wurde der RNA Gewichtsmarker 0,5-10 kb von Invitrogen verwendet.
3.2.1.9.3 Transfer von RNA auf eine Membran
Nachdem das Gel zweimal in 20 x SSC gewaschen wurde, folgte das Blotten über Nacht mit 20 x SSC. Der Aufbau war identisch zum Southern Blot (siehe unter 3.1.8.2).
Die Membran wurde auf ein mit 2 x SSC getränktes Whatmannpapier gelegt. Es folgte ein UV-Crosslinking (UV Stratalinker 2400). Danach wurde die Membran mit
doppelt destilliertem Wasser gewaschen, auf ein trockenes Whatmannpapier gegeben und luftgetrocknet.
3.2.1.9.4 Hybridisierung der Membran
Zunächst wurde die Membran in 15 ml Dig Eeasy Puffer (Roche) für 4 h bei 68°C prähybridisiert. Es folgte eine Hybridisierung über Nacht bei 68°C mit der unter 3.2.1.9.1 hergestellten Sonde.
3.2.1.9.5 Detektion
Die Membran wurde zunächst 2 mal 10 Minuten bei Raumtemperatur in 2 x SSC + 0,1 %SDS gewaschen und anschließend 2 x 15 Minuten bei 68°C in 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Um die spezifischen Bindungen abzusättigen, wurde die 10 x Blockinglösung mit Maleinsäurepuffer auf eine einfache Konzentration verdünnt. Die Membran kam für 30 Minuten in diese Lösung. 10 ml der 1 x Blockinglösung wurden zurückgehalten und 1 l Antikörper (Anti-Digoxigenin-Alkalische-Phosphatase (AP) konjugiert, Roche Diagnostics) hinzugegeben. Die Membran wurde auf eine Glasplatte gelegt, die Lösung wurde draufgegeben und das Ganze wurde mit einer Folie abgedeckt und für 20 Minuten inkubiert. Danach wurde die Membran in Maleinäurepuffer, der 0,003 % Tween 20 (Roth) enthielt, 2 x 10 Minuten gewaschen.
Anschließend wurde ca. 3 Minuten in Detektionspuffer äquilibriert. Als letzter Schritt wurde die Membran in die Folie eingeschweißt, nachdem zuvor das Chemielumineszenz Substrat (CDP-Star, Roche Diagnostics) für die Alkalische Phosphatase gleichmäßig auf der Membran verteilt wurde. Das CDP-Star musste ca.
5 Minuten einwirken. Danach wurde die Folie aufgeschnitten und die überschüssige Flüssigkeit mit einem Tuch abgepresst. Abschließend wurde die Folie wieder zugeschweißt.
3.2.1.9.6 Auswertung des Northern Blotes
Die Membran wurde mit dem Fusion SL-7 Dokumentationssystem (Vilber Lourmat, Frankreich), in dem eine Kamera integriert ist, für 10 Minuten belichtet und anschließend ausgewertet.
3.2.1.10 Fluoreszenzaufnahmen
Die makroskopischen Aufnahmen von Venus-transgenen Tieren wurden mit einer digitalen Spiegelreflexcamera (Canon) unter einem Gelbfilter der Marke Coken (A.001) gemacht. Für die Anregnung der Venus-Fluoreszenz wurde eine LED-Lampe (LED LL-S blau, Eurolite) mit spezifischer Emission von Blaulicht (450-490 nm) genutzt. Diese Exzitationswellenlänge ist auch für die spezifische Anregung von eGFP-Fluoreszenz geeignet. Für Optimierungsversuche zu den notwendigen phototechnischen Einstellungen wurden eGFP-exprimierende E. coli von Dr. J.W.
Carnwath (Institut für Nutztiergenetik, Mariensee) zur Verfügung gestellt.
Für die mikroskopischen Aufnahmen der Gewebe wurde ein Zeiss Axiovert 35 M Mikroskop genutzt, das mit einer Fluoreszenz Optik von Hoechst 33342, GFP und Rhodamin ausgestattet war. Die Bilder wurden auf einem Fujichrome Color Reverse Provia 400 x Professional Film mit einer Contax 167 MT aufgenommen.
3.2.1.11 FACS Analyse von Leukozyten
3.2.1.11.1 Blutgewinnung und Leukozyten-Präparation
Für die Blutgewinnung wurden Mäuse getötet und ca. 800 µl Blut aus dem Herzen entnommen. Das entnommene Blut wurde in Blutröhrchen gefüllt, die EDTA als Koagulans enthielten. Aus dem EDTA Röhrchen wurde das Blut dann in ein 10 ml Falconröhrchen überführt und mit PBS 1:1 verdünnt. Zu diesen ca. 2 ml wurden dann 2 ml PBS und 4 ml H2O geben und das Röhrchen dann für 45 Sekunden geschwenkt. Anschließend wurden 4 ml 2 x PBS hinzugegeben, wieder kurz geschwenkt und dann für 10 Minuten bei 1000 g zentrifugiert. Das Pellet war nun sichtbar und der Überstand wurde entfernt. Das Pellet wurde nun wie folgt gewaschen: Zunächst wurden 1 ml H20 hinzugegeben und das Ganze dann 30 Sekunden auf- und abpipettiert. Dann wurden 1 ml 2 x PBS hinzugefügt, anschließend noch 4 ml PBS, gefolgt von erneutem Zentrifugieren für 5 Minuten bei 1000 g. Das Waschen musste so oft wiederholt werden, bis ein möglichst reines Leukozytenpellet erzielt wurde, das dann entweder eingefroren oder in PBS für die FACS- Messung vereinzelt wurde.
3.2.1.11.2 Flow-zytometrische Messungen
Die Flowzytometrie wurde mit einem FACScan® (BD Bioscience, Heidelberg, Germany) durchgeführt. Dieser war mit einem Argon Laser (488 nm, 15 mW) und drei verschiedenen Filtern: FL-1 (530/30 nm) für grüne Fluoreszenz, FL-2 (585/42 nm) für orange Fluoreszenz und FL-3 (650 LP nm) für rote Fluoreszenz ausgestattet. Die Flowzytometrischen-Daten wurden mit der Software WinMDI (Trotter 1998) ausgewertet.