Reverse Transkription und Polymerase Chain Reaktion (PCR)

3.1.4.1.1 Herstellung des Mastermixes und der Reaktionsmixtur

Die Reverse Transkription (RT) hatte ein Endvolumen von 25 l. Es wurde ein Mastermix (MM) mit den verschiedenen Komponenten hergestellt, um Pipettierfehler zu minimieren. Der MM wurde hergestellt, indem die Reagenzien in sterile DNase und RNase freie Multireaktionszentrifugationsröhrchen 0,65 ml (Carl Roth GmbH und Co., Deutschland) gegeben wurden. Die Lösungen und Reagenzien für die Reverse Transkription wurden aufgetaut und während der Präparation des MM auf Eis gelagert. Zunächst wurde Wasser vorgelegt; dann wurden die anderen Komponenten hinzugegeben. Als Negativ-Kontrollen wurde zum einen eine Reaktion ohne Zugabe des Enzym Reverse Transkriptase ), sowie eine Reaktion ohne Template (RT-H2O) angesetzt. Damit konnten mögliche Kontaminationen genomischer DNA bzw.

unspezifische Kontaminationen des Mastermixes ermittelt werden. Für die Herstellung des Mastermixes wurden die Angaben für die Herstellung der Reaktionslösung (siehe Tabelle 3) entsprechend der Anzahl der Proben multipliziert.

Der MM wurde dann auf die entsprechende Anzahl von kleinen 0,2 ml Zentrifugationsröhrchen (Biozym, 711080 PCR Softtubes, Oldendorf) verteilt. Zuletzt wurde die in 3.1.3 bzw. 3.1.5.2 gewonnene RNA hinzugegeben, gut gemixt und schließlich in den Thermozykler gestellt (PTC-200 Thermocycler MJ Research, Watertown).

Tab. 3: Zusammensetzung der Reaktionslösung für die Reverse Transkription.

Komponente Probe Negativ-Kontrolle

H2O 9,5 l 11,5 l

MgCl2(50mM) 2,5 l 2,5 l

10X PCR 2,5 l 2,5 l

dNTP´s (10mM) 2,5 l 2,5 l

Hexamers (50M) 1,0 l 1,0 l

RNase-Inhibitor (20 U/l) 1,0 l

-

Rev.Transkriptase ^(50U/l) 1,0 l

-

RNA 5,0 l 5,0 l

3.1.4.1.2 RT-Programm

Die RT wurde durchgeführt bei 25°C für 10 Minuten, gefolgt von einer Stunde bei 42°C und anschließender Denaturierung bei 99°C für 5 Minuten. Schließlich wurden die Proben auf 4°C gekühlt und bis zur Weiterverarbeitung in der PCR auf Eis gelagert.

3.1.4.2 PCR

3.1.4.2.1 Oligodesoxynukleotide (Primer) für die PCR

Die verwendeten Primer mit den entsprechenden Sequenzen sind in Tabelle 4 dargestellt. Die synthetisierten Primer wurden von der Firma Eurofins bezogen. Die ersten drei Primerpaare dienten zum spezifischen Nachweis der Telomeren Transkripte. Poly A diente als Positivkontrolle für eine erfolgreiche RNA-Präparation.

Tab. 4: Übersicht über die verwendeten Primer.

Die Primersynthese erfolgte bei der Firma Eurofins MWG. Die Suffixe h und b stehen für human bzw.

bovine.

Gen Primersequenz ^G

röße des Amplifikats [bp] Postion des Primers Datenbank- nummer

hTERC F: 5´GGC CAT TTT TTG TCT AAC CC R: 5´GTT TGC TCT AGA ATG AAC GG

137 831-968 AF 047386

bTERC F: 5´TAC CGC CAT CCA CCA TCC AG R: 5´TCT TCA CGG CGG CAA TGG AC

210 236-556 AF 221936

hTERT F: 5´GTG AGG AGA TCC TGG CCA AG R: 5´TCG GCC CTC TTT TCT CTG CG

345 1668--2013 NM_198253.2

Poly A F:5´GTT TCC TCG GTG GTG TTT CCT GGG CTA TGC

R:5´TGG AGT TCT GTT GTG GGT ATG CTG GTG TAA

251 770-1021 NM_176647.2

Forward (F), Reverse (R)

3.1.4.2.2 Herstellung des Mastermixes und der Reaktionsmixtur

Die PCR hatte ein Endvolumen von 50 l. Es wurde wieder ein MM mit den verschiedenen Komponenten hergestellt (siehe Tabelle 5).

Der MM wurde hergestellt, indem die Reagenzien in sterile DNase und RNase freie 0,65 ml Zentrifugationsröhrchen (Carl Roth GmbH und Co., Deutschland) gegeben wurden. Die Lösungen und Reagenzien für die PCR wurden aufgetaut und während der Präparation des MM auf Eis gelagert. Zunächst wurde hochreines Wasser vorgelegt, dann wurden die anderen Komponenten hinzugegeben. Bei einigen PCR wurde eine Negativkontrolle erstellt, die keine cDNA enthielt, um eine Kontamination der Primer auszuschließen. Die Zusammensetzung des Mastermixes ist Tabelle 5 zu entnehmen.

Dieser MM wurde dann auf die entsprechende Anzahl von kleinen 0,2 ml Zentrifugationsröhrchen (Biozym, 711080 PCR Softtubes, Oldendorf) verteilt und zuletzt wurde die in 3.1.4.1 gewonnene cDNA hinzugegeben, gut gemixt und schließlich in den Thermozykler gestellt. Bei der cDNA, die aus den Embryonen gewonnen wurde, wurden Äquivalente, die 1,0 Embryonenäquivalenten, und somit 10 l entsprachen bzw. 0,5 Embryonenäquivalente, die 5 l entsprachen, für Poly A eingesetzt. Als Positivkontrollen (humane und bovine Tumorzellen cDNA) wurden 100 ng cDNA aus der RT eingesetzt.

Tabelle 6 enthält die PCR-Programme und Temperaturen für die jeweiligen Primerpaare.

Um die Richtigkeit der RT-PCR Fragmente zu bestimmen, wurden die erhaltenen Amplicons für jedes Primerpaar sequenziert (Agowa-Sequenzierservice).

Tab. 5: Herstellung der Reaktionsmixtur für PCR

Komponenten 1x MM Endkonzentration

cDNA 10l Embryonen für TERT

und TERC, bei humanen Tumorzellen 4l

-

Forward Primer (20m) 1,3 l 0,5 M

Reverse Primer (20m) 1,3 l 0,5 M

dNTP ´s (10m) 1,0 l 0,2 mM

MgCl2 (50mM) 1,5 l 1,5 mM

10X PCR 5,0 l 1x

Platinum^ Taq DNA

Polymerase (5U/l) 0,2 l 1 U

Hochreines Wasser ad 50 l

-

Tab. 6: Temperaturprofile der PCR Programme für die Amplifikation spezifischer Gentranskripte

Erste Denaturierung Denaturierung während der Zyklen Anlagerung der Primer Extension der DNA Zyklenzahl Finale Extension Endtempertatur

hTERC 97°C, 1 min 95°C,15 s 54°C, 20 s 72°C, 15 s 40

72°C, 5 min

8°C bTERC 94°C , 2min 94°C, 10 s 57°C, 45 s 72°C, 1 min 38 8°C hTERT 97°C, 2 min 95°C,15 s 58°C, 25 s 72°C, 15 s 35 8°C

3.1.4.2.3 Analyse des RT-PCR Produktes mit der Agarose-Gel-Elektrophorese Die elektrophoretische Auftrennung der PCR-Amplicons erfolgte in 2,0 %igen horizontalen Agarosegelen, versetzt mit Ethidiumbromid (0,3 g/ml) nach Standardmethoden (SAMBROOK, et. al, 1989). Hierbei wandert die negativ geladene DNA in einem elektrischen Feld zur Anode. DNA-Fragmente wurden so entsprechend ihrer Größe aufgetrennt.

Die Agarose wurde durch Aufkochen in 1 x TBE gelöst und nach dem Abkühlen auf ca. 60°C mit EtBr (Endkonzentration: 0,3 µg/ml) versetzt. Anschließend wurde die Flüssigkeit in einen abgedichteten Gelschlitten mit eingesetztem Probenkamm gegossen. Nach Verfestigung der Agarose wurde der Kamm entfernt und der Gelschlitten in die Elektrophoresekammer gegeben. Die Kammer wurde soweit mit TBE-Puffer befüllt, bis das Gel bedeckt war. Die aufzutrennenden Proben wurden mit 10 × Ladepuffer versetzt (Endkonz. 1 x) und 25 l in die Geltaschen pipettiert.

Anschließend erfolgte mit einer konstanten Spannung von 80 V für etwa 45 Minuten die Auftrennung. Die Agarose-Gele wurden mit einem gekühlten 16-Bit-CCD-Kamera-System (Vilber-Lourmat) fotografiert und als tif-Format abgespeichert. Um die jeweilige Größe der aufgetrennten DNA-Fragmente abzuschätzen, wurde bei der Elektrophorese ein DNA Größenmarker (100 bp ladder, High Molecular Weight, HMW-Marker, Firma Invitrogen), versetzt mit Probenpuffer, mit aufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei ausreichender Auftrennung beendet (Dauer ca. 45 Minuten).