A Adenin
Abb. Abbildung
Ac Activator
ALT Alternative Lengthening of Telomeres
BBB Backbone
BSA Bovines Serumalbumin
bTERC bovine Telomerase-DNA-Komponente bTERT bovine Telomerase Reverse Transkriptase
bzw. beziehungsweise
ca. circa
ccc Plasmid covalently closed circular Plasmid
cDNA complementary DNA (komplementäre DNA) CMC-Promotor Cytomegalieviruspromotor
CO2 Kohlenstoffdioxid Cq-Werte Quantification Cycle
hCG human Corion Gonadotropin
C Cytosin
d.h. das heißt
DNA Desoxyribonucleotide Acid= Desoxyribonukleinsäure Dnase Desoyribonuklease
dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
Ds Dissociator
eCG equines Choriogonadotropin
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EGFP „enhanced“ grün fluoreszierendes Protein et al. et alii (und andere)
ET Embryotransfer
EtBr Ethidiumbromid
EtOH chemische Formel für Ethanol
F Forward
f. folgende Seite
ff. folgende Seiten
F1/F2 Filialgeneration 1 und 2 FCS Fetales Kälber Serum
GFP Grün fluoreszierendes Protein (Green fluorescent protein)
G Guanin
h Stunde
hCG humanes Choriongonadotropin
HCL Salzsäure
HEK293-Zellen Human Embryonal Kidney
hT humane Tumorzellen
hTERC humane Telomerase-RNA-Komponente hTERT humane Telomerase Reverse Transkriptase
ICM inner cell mass (innere Zellmasse) i.d.R in der Regel
I.E. Internationale Einheit
i.m. intramuskulär
ITRs inverted terminal repeats IVC in-vitro-culture (In-vitro-Kultur)
IVP in-vitro-produktion (In-vitro-Produktion)
IVM in-vitro-maturation (In-vitro-Reifung) IVF In-vitro fertilisation (In-vitro Befruchtung)
kb Kilobasen
KOK Kumulus-Oozyten-Komplex
mhTERT methylierte humane Telomerase Reverse Transkriptase
min Minute
ml Milliliter
mm Millimeter
MM Mastermix
MOPS Morpholinopropansulfonsäure mRNA messenger ribonuclein acid
ms Millisekunde
MNS mononukleäre Zellen
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
NaClL Natrium cloride = Kochsalz NBCS New born calf Serum
NEB Firma New England Biolab
Ng Nanogramm
nm Nanometer
PCR Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase chain reaction) PBS Phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Salzlösung)
PFA Paraformaldehyd
PMSG Pregnant Mare´s Serum Gonadotropin PMN polymorphkernige neutrophile Granulozyten PNA Peptidnukleinsäuren
POT 1 Protein-Protection of Telomere 1 POT 2 Protein-Protection of Telomere 2 PVA Polyvinylalkohol
Q-FISH Qantitative Fluoreszenz in situ Hybridisierung
qPCR quantitative PCR
Q-TRAP Telomeric Repeat Amplification Protokoll
r reverse
RNA Ribonucleotide Acid
Rnase Ribonuclease
RT Reverse Transkription
RT-PCR Reverse Transkription – Polymerase Chain Reaktion
SB Sleeping Beauty
SDS Dodecylsulfate
SOF Synthetiv Oviductal Fluid = Synthetische Eileiter Flüssigkeit
sog. sogenannt
SSC sodium chloride SV40 Simian Virus 40
TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer TCM-air Tissue culture medium
TE Trophektoderm
TFU Telomer Fluoreszenz Unit TERC Telomerase-RNA-Komponente TERT Telomerase Reverse Transkriptase
T Tymin
Tol 1 Tol 2
TRF 1 Telomeric repeat binding factor 1
TRF 2 Telomeric repeat binding factor 2 TBE TRIS-Borat-EDTA-Puffer
TFU Telomer Fluoreszenz Units)
U Uracil
USD US Dollar
V Volt
vs. versus
z.B. zum Beispiel
9.2 Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Übersicht über die Erfolgsraten bei den wichtigsten durch somatischen Kerntransfer geklonten Spezies (nach Kues und Niemann 2004,
verändert). ... 17
Tab. 2: Frühembryonale Entwicklung bei verschiedenen Säugern von der befruchteten Eizelle bis zur Implantation und Trächtigkeitsdauer. ... 29
Tab. 3: Zusammensetzung der Reaktionslösung für die Reverse Transkription... 54
Tab. 4: Übersicht über die verwendeten Primer. ... 55
Tab. 5: Herstellung der Reaktionsmixtur für PCR ... 57
Tab. 6: Temperaturprofile der PCR Programme für die Amplifikation spezifischer Gentranskripte ... 57
Tab. 7: Übersicht über die verwendeten Primer. ... 72
Tab. 8: Temperaturprofile für die bei den Transposonversuchen verwendeten Primer ... 73
Tab. 9: Übersicht der produzierten KOKs, IVF-Zygoten und behandelte Zygoten .... 87
Tab. 10: Entwicklungsraten in den Versuchsgruppen ... 89
Tab. 11: Verpaarungen Founder-Nummer 1 bis 3 ... 116
Tab. 12: Übersicht über die Erzeugung einer für den Venus-Genotyp positiven homozygoten Linie ... 118
Tab. 13: Ergebnis der Rückkreuzungen von homozygoten Venus Tieren (V++) mit Wildtyp Mäusen ... 120
Tab. 14: Übersicht über die durchgeführten Transposoninjektionen und erhaltene Feten, bzw. Ferkel ... 125
9.3 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Effizienz der DNA-Vorkerninjektion in verschiedenen Säugerspezies. ... 14 Abb. 2: Injektion in den Vorkern einer Schweinezygote. ... 15 Abb. 3: Transposition eines Klasse-II-Transposons ... 21 Abb. 4: Die mitotische Zellvermehrung der Eukaryoten (Abb. aus ALBERTS, 2004, S.
1195) ... 26 Abb. 5: Schematische Darstellung der Struktur der Chromosomen, mit den Telomeren (Abb. aus GREIDER und BLACKBURN, 1998) ... 30 Abb. 6: Verlängerung der Telomeren durch das Telomerase-Holoenzym ... 36 Abb. 7: Übersicht der Telomeraseaktivität in der Ontogenese von der Fertilisierung bis zum Blastozystenstadium (BEKAERT et al., 2004) ... 37 Abb. 8: Gereifte Oozyten nach 24 h Inkubation im Reifungsmedium ... 44 Abb. 9: Vereinfachte Darstellung des peGFP-Plasmides (nur die Expressionskassette ist dargestellt) ... 46 Abb. 10: Vereinfachte Darstellung des hTERC-Konstruktes (nur die
Expressions-Kassette ist dar-gestellt) ... 47 Abb. 11: Vereinfachte Darstellung des hTERT-Konstruktes (nur die Expressionskassette ist dar-gestellt) ... 47 Abb. 12: Injektion in das Zytoplasma einer Rinderzygote. Aufgrund der stark gefärbten Lipidbestand-teile sind die Vorkerne nicht sichtbar. ... 51 Abb. 13: Schematische Darstellung des Venus-Transposon-Plasmides ... 70 Abb. 14: Schematische Darstellung der SB100 x - Transposase ... 70 Abb. 15: Vergleich der Sequenzhomologie zwischen humanem und murinem TERC sowie humanem und bovinem TERC. ... 86 Abb. 16: Darstellung der verschiedenen Entwicklungsstadien im Hellfeld und unter spezifischer Fluoreszenzanregung. ... 90 Abb. 17: Darstellung arretierter Stadien sowie einer Blastozyste mit Mosaikexpression ... 91 Abb. 18: Analyse der endogenen bTERC Expression in Rinderembryonen ... 92 Abb. 19: Analyse der humanen TERC-Expression in mikroinjizierten Embryonen aus Gruppe 1... 93 Abb. 20: Analyse der humanen Telomerase Expression ... 94 Abb. 21: Q-FISH in embryonalen Interphase- und Metaphase-Zellkernen von Rinderblastomeren . ... 95 Abb. 22: Analyse der Telomerenlänge nach Injektion mit humanem TERC-Plasmid 97 Abb. 23: Analyse der Telomerenlänge in Rinderblastozysten nach Injektion von Expressionsplasmiden für humane Telomerasegene in Zygoten. ... 99 Abb. 24: Telomerenlängenmessung von humanen 293-Tumorzellen mittels Q-FISH
... 102 Abb. 25: Telomeraseaktivät in Rinderblastozysten, die humane Telomerase-Gene exprimieren. ... 104 Abb. 26: Telomerenlängenbestimmung in den humanen Tumorzellen hT293 ... 105 Abb. 27: Arbeitshypothese zur Kombination von zytoplasmatischer Injektion mit SB100-Transposon-Plasmiden. ... 108 Abb. 28: Spezifische Fluoreszenzanregung von Bakterien und Wildtyp-Mäusen ... 110
Abb. 29: Venus-Transgene Founder-Mäuse nach zytoplasmatischer Injektion von SB100 x-Plasmiden ... 111 Abb. 30: Genotypisierung der geborenen Jungtiere (Nr.1, Nr.2 und Nr.3) mittels PCR.
... 112 Abb. 31: Schematische Darstellung von NCO I geschnittener DNA mit der Position der spezifischen Sonden (schwarze Balken). A. Venus-spezifisch B.
SB100-Plasmid spezifisch ... 113 Abb. 32: Southern Blot Analyse von F1 Tieren ... 114 Abb. 33: Mikroskopische Identifizierung von Venus positiven Zellen(Hepatozyten) in der Leber bei Tier Nummer 2. ... 115 Abb. 34: Verpaarungen vom phänotypisch Venus-positiven Founder Nummer 1 .. 117 Abb. 35: Ergebniss der heterozygoten Verpaarungen zur homozygoten Linienetablierung ... 119 Abb. 36: Gewebespezifische Venus-mRNA-Expression in transgenen Mäusen .... 121 Abb. 37: Venus-Fluoreszenz in Leukozyten ... 123 Abb. 38: Fluoreszenzaufnahmen vom Fetus 37-2 ... 127 Abb. 39: Genotypisierung von Schweine-Feten (d30) ... 128 Abb. 40: Southern Blot von Gewebeproben der gewonnenen Feten.Der Pfeil zeigt das interne Venus Fragment ... 129 Abb. 41: Integrationsorte des Transposons in Schweinefeten ... 130 Abb. 42: FACS-Analyse der Feten 37-1 bis 37-5. ... 131 Abb. 43: Spezifische Venus-Anregung von Tier 505, Moritz, rechts unter Tageslicht photographiert. ... 132 Abb. 44: Genotypisierung der 12 geborenen Ferkel ... 133 Abb. 45: Southern Blot der geborenen Ferkeln, der Pfeil zeigt das Interne
Venus-Fragment ... 134 Abb. 46: Ergebnisse der FACS-Messungen der Leukozyten der Schweine 503-505
... 135 Abb. 47: Injektionszeitfenster für pronukleäre und zytoplasmatische DNA-Injektion.
... 150 Abb. 48: Definierter Kassettenaustausch in kultivierten Zellen ... 152
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