Mikroinjektionsversuche

3.1.2.1.1 peGFPC1

Das Plasmid peGFP (Clontech), das in Abbildung 9 dargestellt ist, kodiert für das enhanced Green fluorescent protein (GFP) unter Kontrolle des ubiquitär aktiven Cytomegalie-Viruspromoters (CMV-Promoter). Das Protein wird spezifisch durch Exzitation bei 450-490 nm Wellenlänge angeregt und emittiert dann bei 510-550 nm Wellenlänge.

Das Plasmid wurde mit den Telomerase Komponenten ko-injiziert und die GFP Fluoreszenz dazu genutzt, erfolgreich injizierte Stadien zu selektieren.

Abb. 9: Vereinfachte Darstellung des peGFP-Plasmides (nur die Expressionskassette ist dargestellt)

3.1.2.1.2 Humane Telomerase RNA Komponente (hTERC)

Das hTERC Konstrukt wurde von D. Fu und K. Collins von der University of California bezogen (FU und COLLINS, 2003). Dieses Plasmid hat eine TERC-Promotersequenz und kodiert die humane 250 bp TERC-RNA. Eine vereinfachte Darstellung des Konstruktes ist in Abbildung 10 zu sehen.

Abb. 10: Vereinfachte Darstellung des hTERC-Konstruktes (nur die Expressions-Kassette ist dar-gestellt)

3.1.2.1.3 Humane Telomerase Reverse Transkriptase (hTERT)

Das Plasmid pCl-Neo-hTERT (MEYERSON et al., 1997) kodiert das Gen für die humane Reverse Transkriptase unter Kontrolle des ubiquitär aktiven CMV-Promoters. Der hTERT kodierende Bereich ist 3,4 kb lang. Eine vereinfachte Darstellung des Plasmids zeigt Abbildung 11.

Dieses Plasmid wurde von den Weinberg Laboratories in Cambridge/USA bezogen.

Um bei dem Konstrukt eine Expression im Blastozystenstadium zu erreichen, wurde das Konstrukt an den Cytosinen von Cytosin-phosphodiester-Guanosinen (CpG) methyliert (IQBAL et al., 2009) (siehe 3.1.2.2).

Abb. 11: Vereinfachte Darstellung des hTERT-Konstruktes (nur die Expressionskassette ist dar-gestellt)

Die jeweiligen Plasmide wurden zur Amplifikation in die Escherichia coli Stämme XL-10, bzw. ER2925 transformiert und auf LB-Agar-Platten mit Antibiotika (entweder Ampicillin oder Kanamycin) inkubiert. Von Einzelkolonien wurden Flüssigkulturen in LB mit Antibiotikum angeimpft und nach über Nacht-Kultur die Plasmid-DNA über alkalische Lyse und Anion-Austauscher-Säulen (Qiagen) aufgereinigt. Die Reinheit

WT-Promoter hTERC 3´genomic

250 bp

hTERT CMV E/PPromoter

3,4 kb

pCl neo

der Plasmid-DNA und die supercoiled-Konformation wurden über Gelelektrophorese überprüft. Die Konzentration wurde mit dem NanoDrop-Gerät (ND-100 Specto-photometer, NanoDrop Technologies, USA ) bestimmt.

3.1.2.2 In-vitro-Methylierung von Plasmid-DNA

Die zu verwendenden Plasmide wurden in XL10 (Stratagene, Genotyp: endA1 glnV44 recA1 thi-1 gyrA96 relA1 lac Hte Δ(mcrA)183 Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 tet^R F'[proAB lacI^qZΔM15 Tn10(Tet^R Amy Cm^R)] ) oder ER2925 (Qiagen, Genotyp: ara-14 leuB6 fhuA31 lacY1 tsx78 glnV44 galK2 galT22 mcrA dcm-6 hisG4 rfbD1 R(zgb210::Tn10)TetS endA1 rpsL136 dam13::Tn9 xylA-5 mtl-1 thi-1 mcrB1 hsdR2 ) Bakterien transformiert, auf antibiotikahaltigen LB-Agarplatten (entweder Ampicillin (100µg/ml) oder Kanamycin (50µg/ml)) ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. XL10 hat funktionelle Dam- und Dcm-Methylierungssysteme, dadurch wird auch die Plasmid-DNA am ersten Cytosin von 5´CCWGG-Sequenzen (Dcm) und an Adeninen von 5´GATC-Sequenzen (Dam) methyliert. ER2925 trägt infunktionelle Dam und Dcm-Methylierungssysteme, die aus diesem Stamm gewonnene Plasmid-DNA ist somit frei von Dam- und Dcm-Methylierungen. Von einer Einzelkolonie wurde eine 100 ml Kultur in Luria-Bertani (LB)-Medium inokuliert und für 12 Stunden bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Mittels Ionenaustauschersäulen der Fa Qiagen wurde ein Plasmid-Maxiprep durchgeführt. Dabei war entscheidend, dass hochreine Plasmid-DNA in superspiralisierter Form (ccc, covalently closed circular) erhalten wurde. Die ccc-Konformation wurde durch Agarose-Gelelektrophorese überprüft, ebenso die möglichst vollständige Abwesenheit von bakterieller genomischer DNA.

Verunreinigungen mit linearer bakterieller DNA können mittels einer Exonuklease-Behandlung entfernt werden. Die Freiheit von bakteriellen Endotoxinen wurde durch Testtransfektionen in primäre Schweinezellen überprüft.

Um Plasmide mit typischen DNA-Methylierungen an Cytosinen von CpG-Dinukleotiden herzustellen, wurden jeweils 5 µg Plasmid-DNA mit 4 U einer rekombinanten Methyltransferase (SssI, New England Biolabs) und 160 µM S-Adenoysl-Methionin (SAM) für eine Stunde bei 37°C inkubiert (IQBAL et al., 2009).

Die Vollständigkeit der CpG-Methylierung wurde durch Testverdaue mit den

Isoschizomeren Restriktionsendonukleasen HpaII (NEB) und MspI (NEB) mit der Tetranukleotid-Erkennungssequenz 5´-CCGG überprüft. HpaII ist methylierungs-sensitiv und restringiert DNA nicht, wenn das Cytosin in der Erkennungssequenz methyliert ist. Dagegen ist MspI methylierungs-insensitiv und restringiert sowohl CpG methylierte als auch unmethylierte DNA. Nur Plasmide mit mindestens 90 % CpG-Methylierungsgrad wurden für die Mikroinjektion eingesetzt.

3.1.2.3 Herstellung der Injektionslösung

Für die Injektion in Zygoten wurden die jeweiligen Plasmid-DNAs in sterilem Injektionspuffer, bestehend aus 10 mM TrisHCl ph 8,0 und 0,25 mM Ethylendiamin-tetraessigsäure (EDTA), auf eine Endkonzentration von 10 femtogramm/picoliter (fg/pl) verdünnt. Folgende Ansätze wurden injiziert (1) peGFP und hTERC, (2) peGFP, hTERC und methylierteshTERT (mhTERT) und (3) peGFP.

3.1.2.4 Mikroinjektion von covalently closed circular Plasmiden in Zygoten Die beim Nutztier am häufigsten angewandte Technik des Gentransfers ist die Mikroinjektion von Genkonstrukten in einen Vorkern von Zygoten (PURSEL et al., 1989). Es wurden zahlreiche Faktoren untersucht, welche die Effizienz der Mikroinjektion beeinflussen. Damalige Untersuchungen ergaben, dass eine Injektion ins Zytoplasma keinen Erfolg oder nur sehr geringe Erfolgsraten hat (BRINSTER et al., 1985). Eine neuere Untersuchung am Institut für Nutztiergenetik zeigte dagegen, dass für eine ektopische Genexpression in frühen Embryonalstadien die zytoplasmatische Injektion kovalent geschlossener zirkulärer Plasmide geeignet ist (IQBAL et al., 2009).

3.1.2.4.1 Herstellung der Pipetten 3.1.2.4.1.1 Haltepipetten

Die Haltepipetten dienten zur Fixation der Zygote. Für ihre Herstellung wurden Schmelzpunktbestimmungsröhrchen (No. 3005, Assistent, Sondheim) mit einem

Durchmesser von 1,5 mm verwendet. Diese wurden mit einem Mikropipettenzieher (Bachhofer, Reutlingen) ausgezogen und anschließend an einer Mikroschmiede (P430, 25800501, Bachhofer, Reutlingen) abgebrochen. Der äußere Durchmesser sollte bei Rinderzygoten etwa 120 m betragen. Anschließend wurden ebenfalls mit der Mikroschmiede die scharfen Abbruchkanten geglättet. Hierzu wurde die erhitzte Glaskugel der Schmiede so an der Pipette positioniert, dass die Kanten durch Schmelzen abgerundet wurden, bis der Öffnungsdurchmesser nur noch ca. 90 m betrug.

3.1.2.4.1.2 Injektionspipetten

Die Injektionspipetten mussten direkt vor dem Versuch hergestellt werden, da es sonst durch die Staubpartikel in der Luft zu einer Verstopfung der Pipetten kam. In einen Mikropipettenzieher (Model P-87, Sutter Instruments und Co.) wurde eine Kapillare mit Glasfilament (No. 100 TF-10,  1 mm, Clark Electromedical Instruments, UK) eingespannt. Diese wurde mit einem speziellen Programm automatisch in die gewünschte Form gezogen, so dass Pipetten von gleichbleibender Qualität hergestellt werden konnten.

Die Injektionspipetten wurden dann retrograd mit Hilfe einer 10 l Pipette (Eppendorf) und speziellen Mikrolader Pipettenspitzen (Eppendorf) mit ca. 2 l der Plasmidlösung beladen.

3.1.2.4.1.3 Transportpipetten

Zur Herstellung der Embryotransportpipetten dienten ebenfalls die unter 3.1.2.4.1.1 erwähnten Schmelzpunktbestimmungsröhrchen. Diese wurden in der Mitte über einer Alkoholflamme gleichmäßig erhitzt, bis sie sich per Hand ausziehen ließen. Die dünnste Stelle wurde mit der Flamme durchtrennt. Die beiden daraus resultierenden Pipetten wurden am gewünschten Durchmesser angeritzt und schließlich glatt gebrochen.

3.1.2.4.1.4 Aufbau der Mikromanipulationseinheit

Die Mikromanipulation erfolgte unter einem inversen Lichtmikroskop (Axiovert 35 M, Zeiss, Oberkochen) mit Differentieller-Interferenz-Kontrast-Einrichtung bei 200-facher

Vergrößerung. Am Objekttisch des Mikroskopes konnten die beiden für die Injektion benötigten Pipetten befestigt werden. Die Haltekapillare wurde mit einer Gummidichtung im Spannkopf des linken Mikromanipulators (Zeiss) eingespannt und über einen Polyäthylenschlauch mit einer 1 ml Spritze (Dispomed Witt oHG, Geinhausen) verbunden. Diese dienten dazu, einen Unterdruck zu erzeugen, mit dem die Zygoten angesaugt und fixiert werden konnten.

In den Spannkopf des rechten Mikromanipulators (TransferMan, Eppendorf) konnte die beladene Injektionspipette gespannt werden. Über einen PVC-Schlauch wurde eine Verbindung mit dem Mikroinjektor (Transjector 5246, Eppendorf) hergestellt.

Beim Betätigen der Injektionstaste trat über einen Gasdruck die Injektionslösung aus der Kapillare aus. Der Injektionsdruck lag zwischen 0,9 und 1,8 bar. Die Injektionskapillaren konnten über einen Joystick entlang der x-, y- und z- Achse positioniert werden. Die beiden Pipetten wurden auf einer silikonisierten Glasplatte (7,5 cm x 5 cm) in ca. 500 l TCM-air in der Mitte des Gesichtfeldes so positioniert, dass sich die beiden Pipetten genau gegenüberstanden. Das TCM-air wurde auf 37°C im Wärmeschrank vorgewärmt auch der Objekttisch wurde beheizt.

3.1.2.4.1.5 Durchführung der Mikroinjektion

Mit einer Transportpipette wurden maximal fünf Zygoten in den TCM-air Tropfen überführt. Die Zygoten wurden der Reihe nach an der Haltepipette fixiert. Auf der 3 Uhr Position konnten nun Zona pellucida und Plasmamembran mit der Injektionspipette durchstochen werden (siehe Abb. 12). Mit Hilfe des Mikroinjektors wurde die jeweilige Plasmidlösung (3.1.2.3) injiziert, wobei der Erfolg optisch durch das Auseinanderströmen des Zytoplasmas kontrolliert werden konnte.

Abb. 12: Injektion in das Zytoplasma einer Rinderzygote. Aufgrund der stark gefärbten Lipidbestand-teile sind die Vorkerne nicht sichtbar.

Injektionspipette Haltepipette

Zygote

Nach der Injektion wurden die injizierten Zygoten in einen 37°C warmen Tropfen aus TCM-air gegeben, der mit Silikonöl überschichtet war. Der Vorgang wurde für alle zu injizierenden Zygoten wiederholt, wobei das TCM-air nach ca. 20 Zygoten ge-wechselt wurde. Nach Abschluss der Injektion wurden die injizierten Zygoten in SOF-Kulturmedium (siehe 3.1.1.3) gewaschen und anschließend kultiviert.

3.1.2.5 Beurteilung der Expression der mikroinjizierten Plasmide

Die Beurteilung des Expressionsmusters der Fremd-DNA erfolgte an Tag 7 bzw.

Tag 8 der präimplantatorischen Entwicklung der Rinderembryonen. Zur Detektion von GFP-exprimierenden Embryonen wurden diese aus dem Inkubator entnommen und unter einem inversen Lichtmikroskop (Axiovert 35 M, Zeiss) mit Fluoreszenzeinrichtung beurteilt. Die spezifische Anregung des GFP erfolgte durch eine Quecksilber-Höchstdrucklampe (HBO 50, Osram) und einen entsprechenden Filtersatz (Anregung 450-490 nm, Sperrfilter 520 nm). Unter GFP Anregung wurde an Tag 7 bzw. 8 der Gesamtanteil der GFP-positiven Entwicklungsstadien und der Teil der GFP-positiven Blastozysten bestimmt. Zur Dokumentation wurden Bilder im Hellfeld und im Dunkelfeld unter Fluoreszenzanregung aufgenommen.

Nach Beurteilung der Fluoreszenz wurden die positiven Blastozysten entweder in 5-10 Pools für die RT-PCR (3.1.3) oder die Telomerase Aktivitätsmessung (3.1.7) in speziellen 0,6 ml Zentrifugationsröhrchen (0,6 ml Tubes, low binding, Biozym) eingefroren oder für Q-FISH auf einem Objektträger präpariert (3.1.6)

3.1.3 RNA-Gewinnung aus Embryonen für die Reverse Transkriptase (RT)-PCR