4.3 Kombination von zytoplasmatischer Injektion und Transposon-
4.3.2 Stabile Transgenese durch zytoplasmatische Transposon-Injektion im
4.3.2.1 Injektion von Transposon-Plasmiden zur Generierung stabiler Transgenese beim Schwein
Nach dem erfolgreichen Pilotversuch in Mäusen sollte die zytoplasmatische Transposon-Plasmid-Injektion beim Schwein, einem wichtigen Nutztier und biomedizinischem Modell, angewandt werden. Bisher sind noch keine durch Transposon-Verfahren transgene Schweine beschrieben worden.
Es standen 25 Jungsauen für dieses Teilprojekt zur Verfügung, die an insgesamt 5 Versuchstagen genutzt wurden. An den Versuchstagen 1 und 2 wurde die Plasmid-Mixtur aus Venus-Transposon und SB100-Hilfsplasmid (10 fg/pl, 5 fg/pl) und an Versuchstag 3 eine Mischung aus Venus-Transposon Plasmid und SB100-mRNA injiziert. Die RNA/DNA-Lösung entsprach den Angaben aus der Literatur für Vorkerninjektionen bei der Maus (MATES et al., 2009). Es wird angenommen, dass die mRNA schneller in Protein umgesetzt werden kann, als das Plasmid und dadurch Mosaik-Integrationen vermindert werden (IVICS et al., 2009). An den letzten beiden Versuchstagen wurde eine modifizierte Plasmid-Lösung injiziert (10fg/pl Venus-Transposon, 2,5 fg/pl Hilfsplasmid).
An 5 Versuchstagen wurden 25 Sauen zur Zygotengewinnung geschlachtet, aus diesen wurden insgesamt 273 befruchtete und 36 unbefruchtete Stadien gewonnen.
270 Zygoten bzw. 2-Zeller wurden mit den verschiedenen Injektionslösungen injiziert.
Von diesen wurden 241 Zygoten bzw. 2-Zeller operativ auf 8 synchronisierte Empfänger transferiert. Es konnten 5 Trächtigkeiten etabliert werden. Ein Teil der Empfängertiere wurde am Tag 30 nach ET geschlachtet, um die Feten auf Transgenität zu untersuchen. Bei der ersten Schlachtung wurden 5 Feten gewonnen (Fetennummer 37-1 bis 37-5). Bei der zweiten Schlachtung wurden 2 Feten gewonnen (Fetennummer 40-1 und 40-2). Bei der dritten Schlachtung wurden 17 Feten gewonnen und bei der vierten Schlachtung wurden 5 Feten gewonnen (Fetennummer 95-1 bis 95-5). Von allen Feten wurden Fibroblastenkulturen angelegt.
Die Feten von Versuchstag 2 wurden ausgetragen und 12 Ferkel wurden geboren, von denen 7 kurz nach der Geburt verstarben. Insgesamt waren 4 Feten und 7 Ferkel positiv. Übersicht siehe Tabelle 14.
Tab. 14: Übersicht über die durchgeführten Transposoninjektionen und erhaltene Feten, bzw. Ferkel
Experiment Versuchstag 1
9 unbefr. Eizellen 49 Zygoten
Verwendete
(1 Fetus degeneriert) _________________ 5 Feten
Anzahl Venus
alle negativ _________________ alle negativ
4.3.2.2 Analyse der Feten
Direkte Analysen mittels spezifischer Anregung der Venus-Fluoreszenz zeigten, dass vier der fünf Feten (37-2, 37-3, 37-4 und 37-5) von Empfängertier 1 phänotypisch positiv waren. Sie wiesen eine homogene Fluoreszenz in allen Zellgeweben, einschließlich der Embryonalhäute auf. Fetus 37-1 war negativ. Der degenerierte Fetus (40-2) hatte eine Venus positive Amnionhülle. Am 2 Versuchstag wurde eine Trächtigkeit etabliert, die Ferkel wurden ausgetragen. Alle 17 Feten aus der Injektion mit DNA/RNA waren phänotypisch negativ, ebenso wie die Feten aus den Injektionsversuchen mit verringerter Hilfsplasmid-Konzentration (V4 und V5).
Die Feten 37-1 bis 37-5, 40-1 und 40-2 sowie die geborenen Ferkel wurden mittels makroskopischer und mikroskopischer Fluoreszenzaufnahmen sowie verschiedener molekularbiologischer Verfahren untersucht.
4.3.2.2.1 Fluoreszenzaufnahmen
Von dem Fetus 37-2 (Venus positiv) wurden am Mikroskop Bilder von den Organanlagen aller drei Keimblätter dokumentiert. Beim Amnion wurde zusätzlich noch als Negativkontrolle 37-1 mit photographiert (Abb. 38).
Abb. 38: Fluoreszenzaufnahmen vom Fetus 37-2 Links: Aufnahme im Hellfeld,
Rechts: Im Dunkelfeld unter Venus Anregung. Beim Amnion wurde der negative Fetus 37-1 als Negativkontrolle mit abgebildet.
4.3.2.2.2 Genotypisierung der gewonnenen Feten
Mittels spezifischer PCR der genomischen DNA wurden die Feten auf das Vorhandensein des Venus-Fragmentes und des Backbone-Anteil aus dem Transposon untersucht. Desweiteren wurde untersucht, ob das Transposase-Plasmid Sleeping Beauty nachzuweisen war. Die Ergebnisse der PCR der Feten 37-1 bis 37-5 und 40-37-1 und 40-2 sind in Abbildung 39 zu sehen. Es wurde jeweils DNA
aus der Leber und den Embryonalhüllen untersucht. Es wurde auf Venus-GFP, SB-Plasmid und den Backbone Anteil untersucht. Poly A diente als Positiv Kontrolle auf das Vorhandensein von DNA. 37-1 und 40-1 waren sowohl in der Leber als auch den Embryonalhäuten negativ auf Venus, SB und den Backbone-Anteil. 37-2 und 37-5 waren nur positiv auf das Venus-GFP. Bei den Feten 37-3 und 37-4 waren neben dem Venus-GFP auch noch die Backbone Anteile nachweisbar, bei 37-3 in der Embryonalhaut zudem noch das SB-Plasmid.
Abb. 39: Genotypisierung von Schweine-Feten (d30) L: Leber; EH: Embryonalhüllen
1 und 40-1, waren negativ, bei 40-2 waren nur die Embryonalhüllen positiv auf Venus-GFP. Bei 37-3 und 37-37-4 war der Backbone Teil des Transposons noch nachzuweisen und die Embryonalhülle von 37-3 war positiv auf die Transposase SB.
Die PCR-Genotypisierung wurde per Southern Blot verifiziert. Bei allen in der PCR als positiv identifizierten Tiere, wurde die Integration des Transposons festgestellt.
Die Ergebnisse des Southern Blotes der Feten sind in Abbildung 40 zu sehen. Hier zeigt sich, dass der Fetus 37-5 einen Integranten aufweist, während die Feten 37-2,
37-3 und 37-4 wahrscheinlich unabhängige mehrfach Integrationen des Transposons aufweisen.
Abb. 40: Southern Blot von Gewebeproben der gewonnenen Feten.Der Pfeil zeigt das interne Venus Fragment
37/5: Einfachintegration des Transposons
37/4: Dreifachintegration des Transposons
37/3: Fünffachintegration des Transposons
37/2: Mehr als zehn Integrationen des Transposons
37/1: keine Integration
WT: Negativkontrolle mit genomischer DNA eines Wildtyp-Tieres
4.3.2.3 Analyse des Integrationsortes
Der Übergang 3´Transposon ins Chromosom ist über eine spezifische PCR für einige der Integrationsorte identifiziert worden (Splinklerette PCR). Die spezifische Transposition konnte nachgewiesen werden, d.h. aus dem Venus-Transposon-Plasmid (zirkulär) war jeweils exakt am Ende des ITR geschnitten worden (ITR rot unterlegt) und diese Sequenz in die (minimale) Erkennungssequenz von der Sleeping Beauty Transposase eingefügt worden. Die Erkennungssequenz ist ein TA-Dinukleotid (gelb unterlegt), d.h. durch diese Analysen konnte mit hoher Sicherheit gezeigt werden, dass im frühen Embryo tatsächlich eine Transposase-vermittelte Fremd-DNA–Integration erfolgt war. Bei einer Zufallsintegration würden zum einen geringere Effizienzen zu erwarten sein, zum anderen würden die Enden der Fremd-DNA variieren, da das Plasmid zufallsmäßig geöffnet würde. Desweiteren würden die Nachbar-Dinukleotide variieren, die Basenfolge TA tritt mit einer theoretischen
Häufigkeit von 1/16 auf. In den meisten Fällen sollten nicht-TA-Dinukleotide beobachtet werden. Normalerweise läßt sich mit dieser Methode auch die Intergationsstelle im Chromosom bestimmen. Bei den bereitgestellten Proben konnten jedoch nicht genug nachfolgende Basensequenzen identifiziert werden, so dass diese Bestimmung mit den in öffentlichen Datenbanken hinterlegten Genomsequenzen des Schweins nicht möglich war. Diese PCR-Untersuchungen wurden freundlicherweise im Labor von Z. Ivics durchgeführt und zur Verfügung gestellt. Die Analyse der noch nicht identifizierten Integranten läuft zur Zeit noch.
Die Abbildung 41 zeigt die Integrationsorte des Venus Transposons auf. Zuerst ist die Einfachintegration des Fetus 37-3 zu sehen. Danach sind 2 der Integrationen des Fetus 37-2 zu sehen (im Southern Blot waren mehr als 10 Integrationsstellen identifiziert worden). Der dritte Integrationsort konnte nicht mehr zu einem Fetus zugeordnet werden, aber auch hier konnte eine Transposon vermittelte Integration nachgewiesen werden.
Abb. 41: Integrationsorte des Transposons in Schweinefeten
4.3.2.4 FACS-Analyse der fetalen Zellen
Fetale Fibroblasten (500.000/ml) der angelegten Zellkulturen wurden untersucht. Die Fluoreszenz der positiven Fibroblasten war so stark, dass weniger sensitive Einstellungen gewählt werden mussten als es normalerweise für die Einstellungen bei der Negativkontrolle nötig ist. Deshalb ist in Abbildung 42 A die Negativkontrolle nach links aus dem Messfenster verschoben. In Abbildung 42 sind die Ergebnisse der FACS-Analyse der Feten 37-1 bis 37-5 zu sehen. Die Feten 37-2, 37-4 und 37-5 weisen jeweils eine stark fluoreszente Zellpopulation auf, dabei wurden mittlere Fluoreszenzwerte von 571 bis 3918 gegenüber einem mittleren Fluoreszenzwert von 1 für die nicht-transgenen Zellen gemessen. Nur der Fetus 37-3 weist zwei getrennte Zellpopulationen auf, dabei kommt eine Population in Hinblick auf die Fluorezenzwerte (mF = 3) nahezu den nicht-transgenen Zellen gleich, während die andere Population (mF = 2946) innerhalb des Bereichs der transgenen Zellen liegt.
Fetus 37-3 scheint damit eine Mosaik-Integration des Transposons in ca. 50 % seiner Zellen darzustellen.
Abb. 42: FACS-Analyse der Feten 37-1 bis 37-5.
Darstellung im Histogramm; y-Achse gezählte Ereignisse, x-Achse Grünkanal A. 37-1, B. 37-2, C. 37-3, D. 37-4, E. 37-5
Da auf Grund der starken Fluoreszenz der positiven Zellen weniger sensitive Einstellungen gewählt wurden, sind die Zellen der Negativkontrolle 37-1 nicht mehr zu sehen.
4.3.2.5 Geborene Ferkel
Die geborenen Ferkel stammen aus dem zweiten Versuchsdurchgang. Da aus dem ersten Durchgang erfolgreich transgene Feten generiert werden konnten, sollte nun überprüft werden, ob auch die Geburt lebender Ferkel möglich ist. Im September 2009 wurden 12 Ferkel geboren. Direkt nach der Geburt verstarben 7 Ferkel aufgrund einer Infektion. Die Ferkel wurden am Tag der Geburt makroskopisch mittels spezifischer Anregung untersucht. Von den toten Ferkeln zeigten sich 3 positiv für Venus-GFP und 4 wiesen keine Fluoreszenz auf. Von den lebenden Ferkeln, waren 2 positiv auf Venus-GFP und 3 negativ. Von den 3 negativen Ferkeln wurden zwei getötet. Die 3 überlebenden Ferkel erhielten spezifische institutsinterne Nummern: die beiden positiven Eber Ni 503 und Ni 505 und der negative Eber Ni 504. Von den Ferkeln wurden Fluoreszenz-Aufnahmen gemacht. Als Beispiel ist hier das Tier Ni 505 im Alter von 2 Monaten in Abbildung 43 zu sehen.
Abb. 43: Spezifische Venus-Anregung von Tier 505, Moritz, rechts unter Tageslicht photographiert.
4.3.2.5.1 Genotypisierung der geborenen Ferkel
Die 12 Ferkel wurden mittels der PCR genotypisiert. Das Ergebnis ist in Abbildung 44 zu sehen. 5 Ferkel wurden positiv für das Venustransposon getestet. Alle positiven Ferkel waren negativ in der Untersuchung auf SB, und nur bei dem verstorbenen Ferkel 7 war noch der Backbone-Anteil nachweisbar.
Abb. 44: Genotypisierung der 12 geborenen Ferkel 1. Venus GFP:
Ferkel 1 + 2 + 7 + 8 + 12 waren Venus-positiv. Ferkel 12 wurde tot geboren und Ferkel 7 und 8 starben in der ersten Lebenswoche. Ferkel 1 erhielt die Nummer Ni 503, Ferkel 2 die Nummer Ni 505.
Das negative Ferkel 3 erhielt die Nummer Ni 504.
2. Poly A:
Positiv Kontrolle für die erfolgreiche Präparation der DNA 3. Backbone:
Bei Ferkel Nummer 7 und Nr.12 konnte der Backbone-Anteil nachgewiesen werden 4. SB:
Für Sleeping Beauty waren alle Ergebnisse negativ
Diese Ergebnisse zeigen, dass eine SB100 x Transposition im Schwein erfolgreich durchgeführt werden konnte, wobei die meisten Ferkel eine mehrfache Integration von jeweils einem Transposon zeigten (siehe Abb. 45).
Um eine mögliche Keimbahntransmission bei den Schweinen zu untersuchen, wurde von Gewebeproben der Ferkel ein Southern Blot durchgeführt. Bei allen in der PCR als positiv identifizieren Tiere, wurde die Integration des Transposons festgestellt.
Das Ergebnisse des Southern Blots der Ferkel ist in Abbildung 45 zu sehen. Die beiden überlebenden Ferkel Ni 503 und Ni 505 wiesen drei unabhängige Integrationen des Transposons auf.
Abb. 45: Southern Blot der geborenen Ferkeln, der Pfeil zeigt das Interne Venus-Fragment
Ferkel Nummer 6, Tiernummer 504, negativ, keine Integration des Transposons
Ferkel Nummer 5. Einfachintegration des Transposons; beide Tiere verstorben
Ferkel Nummer 3 und 4. Vierfachintegration des Transposons; verstorben
Ferkel Nummer 1 und 2, Tiernummer Ni 503 und Ni 505, Dreifachintegration des Transposons.
4.3.2.5.2 Untersuchung der Blutzellen
Zur Charakterisierung der Schweine 503, 504 und 505 wurden periphere Leukozyten untersucht. Im FACS sind bei Leukozyten zwei Populationen zu unterscheiden, die stärker streuenden polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN´s, Abb. 46 A, oberes Oval) und die schwächer streuenden Mononukleären Zellen (MNS, Abb.
46 A, unteres Oval).
Das Tier 504 ist negativ (siehe 46 A+B). Bei Tier Nummer 503 ist eine negative Zellpopulation mF=5 und eine positive Zellpopulation mF=2685 zu erkennen (siehe Abb. 46 C+D). Bei Tier Nummer 505 sind sowohl eine negative Zellpopulation mF=3,
sowie eine schwach positive mF=1770 und eine sehr stark positive Zellpolulation mF=3643 zu erkennen (siehe Abb. 46 E+F). Hier stellt sich die Frage, ob ein Mosaizismus vorliegt, oder ob dies durch die Reifungszustände der Leukozyten bedingt ist.
Abb. 46: Ergebnisse der FACS-Messungen der Leukozyten der Schweine 503-505 A. Negatives Ferkel 504 C. Positives Ferkel 503 E. Positives Ferkel 505
A + C +E: Darstellung im Dot Blot. Die y-Achse stellt den Streulichtkanal, die x-Achse den Grünlichkanal dar.
B + D + F: Korrespondierende Histogramme. Die y-Achse stellt die gezählten Ereignisse, die x-Achse den Grunkanal dar. M 1 und M 2 bzw. M 3 sind die mittlere Fluoreszenzintensitäten der jeweiligen Zellpopulation
5 Diskussion
In einer vorangegangenen Arbeit war mit einem vereinfachten DNA-Injektionsverfahren von zirkulärer Plasmid-DNA in das Zytoplasma von Zygoten eine effiziente Methode zur transienten Fremd-DNA-Expression in Säugerembryonen etabliert worden (IQBAL et al., 2009). Die zytoplasmatische Plasmidinjektion führt meist nur zu einer transienten Transgenese, d.h. die injizierten Plasmide sind episomal stabil und werden an die Tochterzelle weitergegeben, aber replizieren nicht. Deshalb wurden in der vorliegenden Arbeit zwei verschiedene methodische Ansätze der Mikroinjektion in das Zytoplasma gewählt.
Im ersten Teil der Arbeit wurden zuerst zirkuläre Expressionsplasmide für die RNA-Komponente (hTERC) der humanen Telomerase und anschließend beide Telomerase-Gene (hTERC und mhTERT) gemeinsam in das Zytoplasma in vitro produzierter Rinderzygoten injiziert. In der Plasmidlösung war jeweils ein Plasmid enthalten, das für ein fluoreszentes Reporterprotein (eGFP) kodiert und dadurch eine Selektion der erfolgreich injizierten Embryonen ermöglichte. Die Rinderembryonen wurden in vitro bis zum Blastozystenstadium kultiviert. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl das RNA-Gen (hTERC) als auch die protein-kodierenden Gene (hTERT und eGFP) mit hoher Effizienz ko-exprimiert wurden. Der wichtigste Befund dieser Untersuchungen ist, dass sowohl die Expression des RNA-Gen hTERC, als auch die Ko-Expression von hTERC mit der katalytischen Einheit hTERT in einer signifikant verlängerten Telomerenlänge in Blastozysten resultierten. Ein additiver Effekt auf die Verlängerung der Telomeren in bovinen Blastozysten konnte bei der Ko-Expression von hTERC und mhTERT nicht beobachtet werden. Rinderembryonen sind für diese Untersuchungen gut geeignet, da ihre Telomerenlänge nahezu identisch mit der humanen Telomerenlänge ist (HEMANN und GREIDER, 2000). Durch die Injektion zirkulärer kovalent geschlossener (ccc)-Plasmide in das Zygoten-Zytoplasma kommt es in der Regel zu einer transienten Transgenese (IQBAL et al., 2009). Da ca.
10.000 Plasmid-Moleküle injiziert werden, sind rechnerisch ca. 50-100 Moleküle pro Blastozysten-Blastomere zu erwarten. Aufgrund der Stabilisierung durch die ccc-Konformation ist die Integration in das Genom ein sehr unwahrscheinliches Ereignis.
Die zytoplasmatische ccc-Plasmidinjektion ist also gut für eine ektopische Expression rekombinanter Gene in frühen Embryonen geeignet. Eine stabile Transgenese mit Integration der Fremd-DNA ins Genom wie bei der klassischen Injektion von linearisierter DNA in einen Zygotenvorkern, tritt dabei nicht auf.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob diese Limitierung in Bezug auf stabile Transgenese durch die Kombination mit einem nicht-autonomen Transposon überwindbar ist. Transposons sind springende DNA-Elemente (FESCHOTTE und PRITHAM, 2007; MCCLINTOCK, 1953), die spezies-spezifisch in allen bisher untersuchten Genomen auftreten (DING et al., 2005). Aktive oder reaktivierte Klasse II-Transposons können durch rekombinante DNA-Techniken zu sog. nicht-autonomen Transposon-Systemen entwickelt werden (MATES et al., 2009; IVICS et al., 1997). In diesen wird die Transposition (hier der Einbau der von Transposon-LTRs flankierten Fremd-DNA) durch die Zugabe des Transposase-Enzyms in Form von Protein, mRNA oder eines Expressionsplasmids induziert. In publizierten Arbeiten wurde vorwiegend die pronukleäre Koinjektion von Transposon-DNA (linear oder circulär) mit Transposase-mRNA beschrieben; dabei wurden bis zu 37 % transgene Mäuse festgestellt (MATES et al., 2009).
In dieser Arbeit wurde die Methode der zytoplasmatischen Injektion mit dem Transposon-System kombiniert. Dabei wurde ein Plasmid, das ein LTR-flankiertes Venus-Gen trägt, und ein zweites Plasmid, das die SB100-Transposase trägt, in das Zytoplasma von Maus- oder Schweinezygoten injiziert. Es konnten erfolgreich transgene Mäuse und erstmals auch Transposon-transgene Schweine produziert werden. Die Vorteile der transposon-vermittelten Transgenese gegenüber einer Zufallsintegration bei klassischen Methoden sind, dass (i) es durch die Zugabe der Transposase (Integrase) zu einer höheren Rate transgener Founder-Tiere kommt, (ii) die Transposase-vermittelte Integration vor allem in euchromatischen Bereichen erfolgt, (iii) vorwiegend Einzelkopien des Transposons integriert werden (gegenüber Konkatameren der Fremd-DNA bei der klassischen Injektionsmethode) und (iv) bei der Transposition keine Plasmid-Backbone-Sequenzen mitintegriert werden.
Aufgrund des hohen CpG-Gehalts von Backbone-Plasmidsequenzen, sind diese besonders anfällig für Silencingmechanismen in Säugerzellen. Durch die
SB100-Transposition sind Silencing der Fremd-DNA und variegierte Expressionsmuster weitgehend ausgeschlossen. Bei den Founder-Tieren wurden homogene Expressionsmuster des Venus-Transgens beobachtet; Silencing oder variegierende Expressionsmuster wurden nicht gefunden; bei einem kleineren Teil der Founder Tiere war ein Transgen-Mosaizismus feststellbar. Die wesentlich erhöhte Effizienz der Transgenese beim Schwein macht diese Methodik zu einem vielversprechenden Ansatz für genetische Modifikationen bei Nutztieren.
Transgene Mausmodelle sind ein Standardwerkzeug für die Erforschung verschiedener genetischer Erkrankungen geworden. Schon 1980 wurde die pronukleäre DNA-Mikroinjektionstechnik entwickelt (GURDON und MELTON, 1981).
1982 wurde erstmals eine phänotypische Veränderung bei transgenen Mäusen gezeigt (PALMITER et al., 1982). 1985 wurden mit dieser Methode erstmals transgene Schweine, Schafe und Kaninchen erzeugt (HAMMER et al., 1985).
Wenige Jahre später folgten weitere Nutztiere (PURSEL et al., 1989). Ein großes Problem der Mikroinjektion in den Zygotenvorkern ist die geringe Effizienz, da beim Rind nur etwa 2 %, beim Schwein nur etwa 3 % und bei der Maus 15 % der geborenen Nachkommen das Transgen stabil im Genom integriert tragen. Von den Nachkommen, die transgen sind (Founder Tiere), vererbt nur ein Teil das Transgen (Keimbahntransmission) und weist das gewünschte Expressionsmuster auf (HOGAN et al., 1986). Ein Grund dafür ist, dass die Fremd-DNA zufallsmäßig im Genom integriert wird, das Säugergenom aber nur zu 2-3% aus protein-kodierenden Genen besteht. Der Großteil des Genoms besteht aus repetitiven Elementen und Strukturkomponenten (Telomere und Zentromere). Somit erfolgt die Integration der Fremd-DNA überwiegend in Bereichen, die für eine Genexpression ungeeignet sind.
Die meisten Bereiche mit repetitiven Elementen sind durch extreme DNA-Kondensation zu sog. Heterochromatin geformt, das in der Regel nicht transkribiert werden kann. Nach Injektion von linearisierter DNA kommt es häufig zu einer Anlagerung der injizierten DNA-Moleküle zu Konkatameren; dabei sind sowohl
„head-to-head“, als auch „head-to-tail“-Anordnungen beobachtet worden (BRINSTER et al., 1985). Nach Integration dieser Konkatamere in das Genom kann es zur Interferenz der mehr bis vielfach vorhandenen Promoter- und Regulationselemente
kommen, die dann zu variablen Expressionsmustern oder zum Silencing führen können (DEPPENMEIER et al., 2006).
Zur Zeit ist es wegen der unzureichenden Vorhersagbarkeit der transgenen Expression notwendig, mehrere Linien auf die gewünschten Expressions-eigenschaften zu untersuchen. Wegen dieser geringen Effizienz sind mit der Produktion von transgenen Tieren auf dem Wege der Mikroinjektion in die Vorkerne der Zygoten hohe Kosten verbunden (WALL, 1996).
Das Mausmodell hat auf Grund der großen physiologischen und anatomischen Unterschiede Grenzen in der Erforschung humaner Erkrankungen (HABERMANN et al., 2007). Auch für die Erforschung und Weiterentwicklung der Transplantations-medizin bietet das Mausmodell nur sehr geringe Möglichkeiten. Deshalb ist es für die Forschung wichtig, transgene Nutztiere mit vorhersagbaren transgenen Expressionsmustern zu erstellen.
Nach jüngsten Befunden aus der Marienseer Arbeitsgruppe ist die zytoplasmatische Plasmidinjektion eine effiziente Methode, die in Säugerembryonen eine transiente Fremd-DNA-Expression induziert. Insbesondere für Zygoten von Rindern und Schweinen, in denen aufgrund des hohen Lipidgehalts die Vorkerne nicht sichtbar sind, war diese Methode sehr geeignet, da keine belastenden Zentrifugationsschritte durchgeführt werden mussten (IQBAL et al., 2009). Die zytoplasmatische Plasmid-Injektion erlaubt die Ko-Expression verschiedener Plasmide. Das Zytoplasma der Zygoten ist nach der umfangreichen Literatur zur Transgenese (NIEMANN und KUES, 2007) das falsche Zellkompartiment für die Injektion von Fremd-DNA, denn diese muss in den Zellkern gelangen. Dies ist theoretisch nur über die Kernporen möglich, durch die jedoch nur Moleküle mit einem Molekulargewicht von bis zu 50 Kilodalton (kD) frei diffundieren können (WEBSTER et al., 2009; WEIS, 2007).
Plasmide hingegen sind mindestens 3000 kD groß. Möglicherweise gibt es in Säugerembryonen einen aktiven Transportmechanismus für Plasmide, oder die Plasmide können nach dem Abbau der Kernmembran während des ersten Zellzyklus in den Kernbereich eindringen. Durch die ccc-Konformation ist in jedem Fall eine Stabilisierung der Fremd-DNA im Vergleich zu linearen DNA-Molekülen gegeben, da
insbesondere die freien DNA-Enden, an denen viele Abbauprozesse angreifen, nicht vorliegen. Der genaue Mechanismus bedarf weiterer Abklärung.
5.1 Expression humaner Telomerasekomponenten in bovinen Embryonen