Schweinezygoten

3.2.2.1 Spendertiere und Eizellgewinnung

Als Spendertiere dienten institutseigene präpuberale Jungsauen der deutschen Landrasse im Alter zwischen 5 und 6 Monaten. Für die zweimalige Fütterung pro Tag wurde eine institutseigene Futtermischung verwendet. Wasser bekamen die Tiere ad libitum. Zur Samengewinnung für die Besamung der Sauen dienten institustseigene Eber, die einzeln in einer eingestreuten Box gehalten wurden.

Für die Superovulation erhielten die Jungsauen 1200 I.E. PMSG i.m. appliziert. 72 Stunden später wurde die Ovulation durch Gabe von 500 I.E. hCG (Ovogest, Inervet) i.m. ausgelöst. 24 bis 30 Stunden später wurden die Sauen zweimal durch künstliche Besamung belegt.

Zur Gewinnung der Zygoten wurden die Spendertiere 48 Stunden nach hCG Gabe im institutseigenen Schlachthaus betäubt und geschlachtet. Der Genitaltrakt wurde sofort entnommen und in einem Isolierbehälter in das Labor gebracht. Nach Abtrennen der Gekröse vom Ovar wurden die Ovarien auf ihre Funktionskörper (Gelbkörper, Follikel, Zysten) überprüft und die Eileiter an der uterotuberalen Verbindung von den Uterushörnern abgetrennt. Vom Infundibulum aus wurden die Eileiter mit einer sterilen Knopfkanüle (Ø 1,4 mm) und einer 10 ml Spritze zweimal durchgespült. Als Spülmedium diente mit 1 % NBCS angereichertes PBS. Am uterotuberalen Ende wurde die Spülflüssigkeit in einer 90 mm Petrischale (Greiner, Frickenhausen) aufgefangen. Anschließend wurde die Spülflüssigkeit unter einem Stereomikroskop bei 15-facher Vergrößerung durchgemustert. Die gefundenen

Eizellen wurden mit Hilfe eines Pipettierhelfers (Mikropipetter, Brand) und einer Einmalkapillare in eine kleine, mit Spülmedium gefüllte Petrischale umgesetzt. Die Beurteilung erfolgte bei 50-facher Vergrößerung. Intakte Zygoten wurden schließlich in 80 µl Trofen der Spülflüssigkeit, die mit Silikonöl überschichtet waren, überführt und bis zur Mikromanipulation bei 37°C und feuchtigkeitsgesättigter Luft gelagert.

3.2.2.2 Mikroinjektion

Die Mikroinjektion wurde wie unter 3.1.2.4.1.5 beschrieben mit den gleichen Haltepipetten durchgeführt. Lediglich die Mikroinjektion fand nicht in TCM-air, sondern in PBS mit 1 % NBCS Zusatz statt. Die verwendeten Plasmide sind identisch wie unter 3.2.1.2 beschrieben.

3.2.2.3 Empfängertiere, Embryotransfers, gewonnene Feten und geborene Nachkommen

Als Empfängertiere für die injizierten Zygoten dienten etwa 90 kg schwere, präpuberale Jungsauen der deutschen Landrasse aus der institutseigenen Schweineversuchsanlage. Die Ovulationen wurden bei den Tieren so induziert, dass sie am Tag des Transfers ovuliert hatten. Dazu wurden an Tag 5 vor dem Embryotransfer 1000 I.E. PMSG (Intervet) i.m. verabreicht und 71 Stunden später 500 I.E. hCG (Intervet) i.m. injiziert. Zu jedem Termin wurden zwei Jungsauen nach der beschriebenen Methode synchronisiert.

Die intakten injizierten Zygoten wurden in PBS mit 1 % NBCS Zusatz in sterile Plastik-Straws (Paillette Cristal 133, Ref ZA 176, LÁigle, Frankreich) aufgezogen. Für Transport und Lagerung bis zum Transfer wurde ein Thermogefäß (Embryo Gefäß, MT 35/24, Minitube) mit auf 38°C vorgewärmten Stahlkügelchen verwendet. Der Transfer erfolgte chirurgisch. Hierzu wurde ein anästhesiertes Tier in Rückenlage auf dem OP-Tisch fixiert und beckenwärts hochgelagert. Die Bauchöhle wurde zwischen den letzen beiden Zitzenpaaren in der Linea alba eröffnet. Uterus und Ovarien wurden aufgesucht und die Anzahl der frisch ov. Follikel und Gelbkörper bestimmt.

Um die Embryonen zu übertragen, wurde ein Straw mit bis zu 30 Zygoten vorsichtig

über den Fimbrientrichter tief in den Eileiter eingeführt und die Embryonen dort abgesetzt. Anschließend wurde der Uterus in die Bauchhöhle zurückverlagert und diese mittels einer Bauchfell-, Muskel-, Unterhaut- und Hautnaht verschlossen. Die Tiere wurden anschließend antibiotisch und mit einem Schmerzmittel versorgt.

Insgesamt wurden sechs Transfers durchgeführt, aus denen vier Trächtigkeiten etabliert wurden.

3.2.2.4 Fibroblastenkultur

Alle Arbeiten mit Zellkulturen wurden an einer Clean Bench (Kojair KR-130, Fa.

Kojair Tech Oy, Vippula, Finnland) durchgeführt. Zur Gewinnung fetaler porziner Fibroblasten wurden tragende Sauen am Tag 30 der Trächtigkeit getötet und hysterektomiert. Unmittelbar im Anschluss wurde der Uterus in das Zellkultur-Labor gebracht, um dort die Feten zu gewinnen. Die entnommenen Feten wurden in PBS (Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline, St. Louis, MO, USA) gewaschen, das mit 200 U/ml Penicillin (Sigma, Aldrich, USA) und 200 µg/ml Streptomycin (Sigma Aldrich, USA) supplementiert war. Anschließend wurden die Feten in eine mit PBS gefüllte Petrischale (Ø 90 mm, Fa. Greiner Labortechnik Frickenhausen) überführt, aus dem Amnion entfernt und in PBS gewaschen. Das Amnion wurde zerteilt und in mehreren Zentrifugenröhrchen für eine spätere DNA Gewinnung und anschließende Analyse eingefroren. Extremitäten und Kopf wurden abgetrennt, die Leber entnommen und jeweils separat in 1,5 ml Zentrifugenröhrchen eingefroren, um ebenfalls für eine spätere Analyse bereit zu stehen. Der eviszerierte Restkörper wurde etwa dreimal in PBS gewaschen und anschließend mit Skalpellklingen in winzige Stücke zerteilt. Das Gewebe wurde auf 3 Zentrifugenröhrchen aufgeteilt und mit jeweils 500 µl EDTA/Trypsin (T-4174, Sigma Aldrich, USA) versetzt. Die Zentrifugenröhrchen wurden für etwa 20 Minuten bei 37°C und einer Schüttelstärke von 10 auf einem Thermoschüttler (Biometra) inkubiert. Der vereinzelte Inhalt jedes 1,5 ml Zentrifugenröhrchens wurde in eine T 25 Flasche (Tissue Culture Flask, Fa.

TPP / Schweiz) überführt, und je 5 ml T3-Medium mit 2-fach Penicillin (Sigma) und Streptomycin (Sigma) wurden hinzugefügt. Die Zellen wurden bei 37°C und 5 % CO2

in einem Brutschrank (Hera Cell, Heraeus Instruments, Hanau, Germany) kultiviert.

Nach 48 h wurde das Medium gewechselt. Die Gewebestücken wurden beim erstmaligen Splitten abgesaugt. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht hatten, wurden sie subkultiviert. Dazu wurde das Medium abgesaugt, die Zellen einmal mit 5 ml PBS gewaschen und anschließend mit 1 ml einer 0,05 % EDTA/Trypsin Lösung versetzt. Dann wurden die Zellen für 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Das Ablösen und Abrunden der Zellen wurde unter einem Stereomikroskop kontrolliert. Die abgelösten Zellen wurden mit je 10 ml Medium versetzt und in einer 75 cm² Zellkulturflasche (T75-Zellkulturschale, Tissue Culture Flask, 9296, Fa.

TPP/Schweiz) neu ausgesät. Sobald die Zellen erneut eine Konfluenz von 70-80 % erreicht hatten, wurden sie wieder mit EDTA/Trypsin behandelt und entweder weiter subkultiviert oder für eine spätere Nutzung eingefroren. Hierfür wurden die Zellen nach Trypsinisierung in 9 ml T3-Medium aufgenommen und bei 1000 g für 10 Minuten zentrifugiert (Megafuge 1.0, Fa Instruments, Hanau). Parallel dazu wurde T3-Medium im Verhältnis 9:1 mit DMSO (Dimethyl Sulfoxide, D2650, SIGMA Aldrich, MO, USA) als Kryoprotektivum versetzt. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand abgesaugt, das Pellett in 3 ml Einfriermedium aufgenommen und in 3 Kryoröhrchen (Cryo S, Greiner Bio-one, Frickenhausen) à 1 ml überführt.

Anschließend wurden die Zellen für zwei Tage bei -80°C eingelagert und am dritten Tag in flüssigen Stickstoff überführt.

3.2.2.5 DNA-Gewinnung aus Ohrkerben

Von den geborenen Ferkeln wurden Ohrkerben genommen, um genomische DNA für die Genotypisierung zu gewinnen. Dieses erfolgte wie unter 3.2.1.4 beschrieben.

3.2.2.6 DNA-Gewinnung aus Fibroblasten

Von den angelegten Fibroblastenkulturen der gewonnenen Feten wurde die DNA wie unter 3.1.5.1 beschrieben durchgeführt.

3.2.2.7 FACS-Messungen

Den beiden Venus-Transposon-positiven Ebern (Ni 503 und Ni 505), sowie dem nicht-transgenen Eber (Ni 504) aus dem gleichen Wurf wurden ca. 10 ml Blut aus der Jugularvene entnommen. Das Blut wurde mit den entsprechenden Mengen wie unter 3.2.1.11.1 beschrieben weiter verarbeitet.

3.2.2.8 Splinklerette-PCR

Diese PCR wurde von der Arbeitsgruppe von Zoltan Ivics (Max-Delbrück-Zentrum für Molekular Medizin, Berlin) durchgeführt und die vorliegenden Ergebnisse zur Verfügung gestellt. Das Prinzip der Splinkerette PCR ist eine PCR-Methode, die die Identifikation eines Integrationsortes ermöglicht. Da nur ein Primer bekannt ist, nämlich der im Transgen liegende, wird zunächst die genomische DNA restringiert, an die lineare DNA wird dann ein Adaptoroligonukleotid ligiert. Auf diesem Adaptor liegt die komplementäre Sequenz für den zweiten Primer. Aus den Ligations-produkten kann dann das Produkt mittels PCR herausamplifiziert werden auf dem folgende Anordnung vorliegt: Transgen, Übergang ins Genom, Adaptor. Das Amplicon wird sequenziert und die benachbarte DNA-Sequenz über Blast (NCBI, Pubmed) im Genom identifiziert.