Analyse der Telomerlängen in Blastozysten

Die Effekte der hTERC-Injektion bzw. der hTERC+ mhTERT-Injektion auf die Telomerenlänge wurden mittels Q-FISH quantitativ untersucht. Die Zellkerne der Blastozysten wurden mit einer Telomer spezifischen 18-mer PNA-Sonde hybridisiert, die direkt mit dem Flurochrom Cy3 markiert war. Nach vollständiger Sättigung der Bindungsstellen ist die gemessene Fluoreszenzintensität direkt proportional zur Telomerenlänge (POON et al., 1999). Pro Blastozyste wurden mindestens 15 Zellkerne gemessen, dadurch ergaben sich pro Versuchsgruppe mindestens 25.000 Messpunkte. Die Messungen wurden im Programm von S. Poon und P. Lansdorp TFL Telo V2 durchgeführt. Die Messergebnisse des Programmes wurden in Telomer Fluoreszenz Units (TFU) angegeben. Da die Telomer-Spotintensitäten (TFUs) eine

nicht-gaussche Verteilung aufwiesen, wurden die Daten logarithmisch transformiert (log10), um so eine Annäherung an eine Normalverteilung zu erreichen. Bei der statistischen Auswertung (siehe 3.1.9) wurde eine Wahrscheinlichkeit von p 0,05 als signifikant angesehen.

Um später die Ergebnisse in Kilobasen (kb) umrechnen zu können, wurden parallell humane Tumorzellen mit bekannter Telomerenlänge als Referenzzellen mittels Q-FISH vermessen. Diese wurden für den Q-Q-FISH präpariert und zusätzlich ein Southern Blot zur Telomerlängenbestimmung durchgeführt. Anhand der Telomeren- Werte konnte man den Verlängerungen in TFU eine Verlängerung in Basenpaaren zuordnen. Für die statistische Auswertung wurden die Werte aus den einzelnen Telomerspots der Zellkerne verwendet, die von dem Programm hinterlegt wurden.

In Abbildung 21 A ist der Zellkern einer Blastozyste nach Markierung mit der Telomerensonde abgebildet. Für die Auswertung der Fluoreszenzintensität wurde eine Schwarzweißaufnahme verwendet (Abb. 21 B). Um nachzuweisen, dass die Sonde tatsächlich die Telomeren markiert, wurden die Blastozysten für 2 Stunden in Colcemid (Sigma D 1925) inkubiert (Konzentration 1 µg/ml), um eine Fixierung der Zellkerne in der Metaphase zu erreichen (siehe Abb. 21 C)

Abb. 21: Q-FISH in embryonalen Interphase- und Metaphase-Zellkernen von Rinderblastomeren . A. Einzelner Interphase-Zellkern mit qFISH markierten Telomeren (rot) aus einer

Rinderblastozyste

B. Schwarzweißaufnahme desselben Zellkernes wie in A

C. Metaphasenplatte einer bovinen Blastozystenzelle mit angefärbten Telomeren (rot). Die chromosomale DNA ist mit DAPI gegengefärbt.

4.2.3.1 Telomerlängenanalyse der Blastozysten der Gruppe 1 (hTERC injiziert) In diesem Durchgang wurden insgesamt 21 Kontrollblastozysten (Gruppe 4) mit je etwa 15 gemessenen Zellkernen pro Blastozyste gegen 9 injizierte Blastozysten (Gruppe 1) verglichen, auch hier wurden im Schnitt 15 Zellkerne mit der TFL Telo 2-Software gemessen. Insgesamt gingen in Gruppe 4 ca. 30.0000 Messpunkte und bei Gruppe 1 ca. 20.000 Messpunkte in die Auswertung ein. Die Ergebnisse der Telomerlängenanalyse sind in Abbildung 22 dargestellt. In den Boxplot-Darstellungen sind die gemessenen Telomerspots einer Gruppe mit den dazugehörigen Intensitäten (x-Achse) dargestellt. Abbildung 22 A zeigt die nicht-gaussche Verteilung der gemessenen Spot-Intensitäten vor der logarithmischen Transformation. In Abbildung 22 B sind die Messdaten logarithmisch transformiert dargestellt. Die Daten weisen nun eine Normalverteilung auf. Die transformierten Daten waren die Grundlage für die Analyse der Telomerenlänge und die Berechnung der Signifikanz (Abb. 22 C). Die Analyse der Zellkerne ergab in der Kulturkontrolle (Gruppe 4) eine Telomerenlänge von 854 TFU und in der Gruppe 1 eine Telomerenlänge von 1138 TFU. Die Gruppen waren signifikant unterschiedlich (p<0,05). Die mit hTERC injizierte Gruppe wies also eine signifikante Verlängerung der Telomeren auf.

Dieser Befund deutet darauf hin, dass TERC-RNA in frühen Embryonen, anders als bisher angenommen, einen limitierenden Faktor für die Telomerenverlängerung darstellt. Es wurde ein 1,7-fach erhöhter Wert errechnet.

Abb. 22: Analyse der Telomerenlänge nach Injektion mit humanem TERC-Plasmid

A. Verteilung der Telomerspotintensitäten aus Zellkernen von hTERC injizierten Blastozysten (inTFUs). Die Orginalmesspunkte weisen in der Boxplot-Darstellung eine eindeutige Schiefverteilung auf.

B. Verteilung der Telomerspotintensitäten aus Zellkernen von hTERC injizierten Blastozysten nach logarithmischer Transformation.

C. Q-FISH Messung der mittleren Telomerenlängen in injizierten Rinderembryonen. Gruppe 4:

Kontrolle nicht injiziert; Gruppe 1: Injiziert mit humanem TERC.

Unterschiedliche Buchstaben zeigen eine Signifikanz an.

Fl + bedeutet, dass die in die Analyse eingegangenen Blastozysten eine spezifische eGFP-Fluoreszenz aufwiesen.

4.2.3.2 Telomerlängenanalyse von Blastozysten der Gruppe 2 (hTERC und mhTERT injiziert) zusammen mit der Gruppe 3 (nur peGFP injiziert)

In diesem Durchgang wurden insgesamt 15 Kulturkontrollblastozysten (Gruppe 4) mit je etwa 15 gemessenen Zellkernen pro Blastozyste gegen 15 injizierte Blastozysten mit Fluoreszenz (Gruppe 2), sowie 9 injizierte Blastozysten ohne Fluoreszenz (Gruppe 2) und 13 injizierte Blastozysten mit Fluoreszenz (Gruppe 3, nur eGFP injiziert) getestet. Auch hier wurden bei den jeweiligen Gruppen im Schnitt 15 Zellkerne gemessen, was pro Gruppe zwischen 20.000 und 40.000 Messpunkte ergab. Die Ergebnisse der Telomerlängenanalyse sind in Abbildung 23 dargestellt.

Die Boxplotdarstellung zeigt die schiefe Verteilung vor der logarithmischen Transformation (Abb. 23 A). Die transformierten Daten (Abb. 23 B) waren die Grundlage für die Analyse der Telomerenlänge und die Berechnung der Signifikanz (Abb. 23 C).

Abb. 23: Analyse der Telomerenlänge in Rinderblastozysten nach Injektion von Expressionsplasmiden für humane Telomerasegene in Zygoten.

A. Verteilung der Telomerspotintensitäten aus Zellkernen von hTERC und mhTERT-Plasmid injizierten Embryonen (in TFUs). Die Orginal-Messpunkte weisen in der Boxplot-Darstellung eine eindeutige Schiefverteilung (Nicht-Normalverteilung) auf.

B. Verteilung der Telomerspotintensitäten aus Zellkernen von hTERC und mhTERT injizierten Blastozysten nach logarithmischer Transformation und entsprechender Boxplot-Darstellung.

C. Q-FISH Messung der mittleren Telomerenlänge in mikroinjizierten Rinderembryonen.

Gruppe 4: Kulturkontrolle nicht injiziert; Gruppe 3: Kontrollgruppe, nur mit eGFP-Plasmid injiziert; Gruppe 3: injiziert mit hTERC, mhTERT und GFP: zuerst die Blastozysten, die keine Fluoreszenz aufwiesen (Fl-) und dann die Blastozysten mit eGFP-Fluoreszenz (Fl +).

Unterschiedliche Buchstaben zeigen eine Signifikanz an.

Die Analyse der Zellkerne ergab bei der Kulturkontrolle (Gruppe 4) eine Telomerenlänge von 761 TFU. Bei der Injektionskontrolle (Gruppe 3: nur peGFP injiziert) wurde eine Länge von 749 TFUs ermittelt. Die Messung der hTERC/mhTERT-Blastozysten (Gruppe 2) mit Fluoreszenz (Gruppe 2+) ergab eine Telomerenlänge von 1113 TFU; in Gruppe 2+ wurden nur normal entwickelte Blastozysten einbezogen. Die Gruppe 2 ohne Fluoreszenz (Gruppe 2-) bestand aus normal entwickelten Blastozysten ohne detektierbare eGFP-Fluoreszenz, für diese wurde eine Telomerenlänge von 825 TFU ermittelt. Irreguläre Entwicklungsstadien wurden von der Q-FISH Analyse ausgeschlossen.

Es ergab sich keine Signifikanz zwischen Gruppe 4, Gruppe 3 und Gruppe 2- (ohne Fluoreszenz). Der Test der Gruppen 2-, 3 und 4 gegen Gruppe 2+ (mit Fluoreszenz), ergab hingegen eine Signifikanz (p<0,05). Die mit hTERC und mhTERT injizierte Gruppe wies signifikant verlängerte Telomeren gegenüber der Kontrollgruppe auf. Es wurden um 1,5-fach verlängerte Telomeren in Gruppe 2+ berechnet. Daraus ergibt sich, dass die (i) Koinjektion von hTERC und mhTERT zu einer Verlängerung der Telomeren führt, (ii) die Telomerenverlängerung nur in den Embryonen auftritt, die auch den Vitalmarker peGFP exprimieren, (iii) die Injektion von peGFP nicht zu einer Telomerenverlängerung führt und (iv) im Vergleich zu einer hTERC-Injektion die Koinjektion hTERC/mhTERT mit keiner weiteren Verlängerung verbunden ist. Die beiden Gruppen (nur hTERC injiziert gegenüber hTERC und mhTERT injiziert) können statistisch nicht direkt miteinander verrechnet werden, da es zwei verschiedene Versuchsdurchgänge waren.

Die Ergebnisse der Verlängerung waren jedoch nicht wesentlich verschieden (1,7 zu 1,5), so dass es offenbar keinen Vorteil gibt, wenn man beide Komponenten ektopisch exprimiert. Mit der alleinigen Expression von mhTERT wurde eine signifikante Verlängerung erreicht (IQBAL et al. 2010, zur Publikation eingereicht).

Mit funktionellen Genen wie TERC und TERT wurde im Embryo bisher nicht gearbeitet. Umso interessanter ist, dass auch mit der RNA-Komponente eine Verlängerung der Telomeren erreicht werden konnte. Im Gegensatz zu somatischen Zellen scheint diese in Embryonen auch limitierend für die Telomeraseaktivität zu sein. Mit der Expression der einzelnen Telomerasekomponenten konnte sehr

wahrscheinlich bereits eine Maximalkapazität erreicht werden, so dass die Expression der gesamten Telomerase keine weitere Verbesserung der Ergebnisse bringt.

4.2.3.3 Telomerlängenanalyse der humanen Tumorzellen 293

Die humanen Tumorzellen 293 wurden als Kontrolle bei jedem Q-FISH Durchgang mitgeführt, um die Vergleichbarkeit der Messergebnisse zu gewährleisten. Von dieser Tumorzelllinie ist bekannt, dass sie relativ kurze Telomeren mit einer konstanten Länge haben. Insgesamt wurden bei den verschiedenen Q-FISH Durchgängen 19 präparierte Objektträger mit den Zellkernen der Tumorzelllen gemessen. Die ersten elf Objektträger wurden in den Q-FISH Durchgängen für die hTERC injizierten Blastozysten gemessen. Die nächsten 8 für die hTERC und mhTERT injizierten. Insgesamt wurden also 19 Objektträger untersucht. Pro Objektträger wurden mindestens 15 Zellkerne gemessen, dies ergab ca. 25.000 Messpunkte. Auch hier zeigte sich bei der Darstellung der einzelnen Messpunkte eine nicht-gaussche-Verteilung (Abb. 24 A). Nach logarithmischer Transformation weisen die Tumorzellen ebenfalls eine Normalverteilung auf (Abb. 24 B).

Abb. 24: Telomerenlängenmessung von humanen 293-Tumorzellen mittels Q-FISH

A. Verteilung der Telomerspotintensitäten aus Zellkernen der humanen Tumorzellen (inTFUs). Die Daten weisen in der Boxplot-Darstellung eine eindeutige Schiefverteilung auf.

B. Verteilung der Telomerspotintensitäten aus Zellkernen der humanen Tumorzellen nach logarithmischer Transformation und entsprechende Boxplot-Darstellung.

Bei den humanen Tumorzellen ergab sich im Mittel eine Telomerenlänge in TFUs von 535 Telomer Fluoreszenz Units (TFU).