Transgene Expression durch zytoplasmatische Injektion von Plasmiden und Transposon-basierten Konstrukten in Säugerembryonen
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
-Doctor medicinae veterinariae- (Dr. med. vet.)
vorgelegt von Wiebke Garrels
Bremen
Hannover 2010
Wissenschaftliche Betreuung: Apl.-Prof. Dr. med. vet. H. Niemann, Friedrich- Loeffler-Institut (FLI), Institut für Nutztiergenetik, Mariensee
PD Dr. rer. nat. W. Kues, FLI, Institut für Nutztiergenetik, Mariensee
1. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. med. vet. H. Niemann 2. Gutachter: Prof. Dr. C. Wrenzycki
Tag der mündlichen Prüfung: 21.05.2010
Die vorliegende Arbeit wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft gefördert
Diese Doktorarbeit wurde am Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Nutztiergenetik, Mariensee angefertigt
und ist meiner Mum gewidmet
So eine Arbeit wird eigentlich nie fertig, man muss sie für fertig erklären,
wenn man nach Zeit und Umständen das möglichste getan hat.
(J. W. Goethe, Italienische Reise, 16. März 1787)
1 Einleitung ... 9
2 Schrifttum ... 12
2.1 Gentransfer in Säuger-Embryonen ... 12
2.1.1 Erstellung transgener Tiere durch DNA-Vorkerninjektion ... 12
2.1.2 Erstellung transgener Tiere durch somatisches Klonen ... 16
2.1.3 Transiente Transgenese durch zirkuläre DNA-Plasmid-Injektion in Säugerembryonen bzw. intramuskuläre Injektion als DNA-Vakzine ... 18
2.1.4 Transposon-vermittelte Transgenese ... 20
2.1.5 Sonstige Methoden der Transgenese ... 22
2.2 Aufbau und Zellzyklus eukaryotischer Zellen ... 24
2.2.1 Prokaryoten ... 24
2.2.2 Eukaryoten ... 24
2.2.3 Genomorganisation bei Eukaryoten ... 26
2.3 Kurzer Abriss der Embryonalentwicklung beim Säuger ... 27
2.4 Telomeren ... 30
2.4.1 Telomeren als Funktionseinheit der Chromosomen ... 30
2.4.2 Telomeren als molekularer Zähler von Zellteilungen ... 32
2.4.3 Telomerenverkürzung während des Alterns ... 33
2.4.4 Telomeren assoziierte-Krankheiten ... 33
2.4.5 Telomerenregulation bei Nachkommen aus somatischem Kerntransfer .. 34
2.5 Telomeren-Regeneration durch die reverse Transkriptase Telomerase ... 35
2.5.1 Entdeckung der Telomerase ... 35
2.5.2 Aufbau des Telomerase-Enzyms ... 35
2.5.3 Zelltyp-spezifische Expression der Telomerase ... 36
2.5.4 Telomeraseaktivität in der Embryogenese und in Keimzellen ... 37
2.5.5 Telomeraseaktivität in Tumorzellen ... 38
2.5.6 Telomerase unabhängige Telomerenverlängerung ... 39
2.5.7 Phänotypen von über- bzw. unterexprimierten Telomerase-Genen ... 39
2.6 Telomer-bindende Proteine ... 41
3 Material und Methoden ... 43
3.1 Experimentelle Modulation der Telomerase in bovinen Embryonen . 43 3.1.1 In-vitro-Produktion von bovinen Embryonen (IVP) ... 43
3.1.2 Mikroinjektionsversuche ... 46
3.1.3 RNA-Gewinnung aus Embryonen für die Reverse Transkriptase (RT)-PCR ... 52
3.1.4 Reverse Transkription und Polymerase Chain Reaktion (PCR) ... 54
3.1.5 Humane und bovine Tumorzellen ... 58
3.1.6 Quantitative Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (Q-FISH) zur Be-stimmung der Telomerenlänge ... 60
3.1.7 Telomerase-Aktivitätsmessung ... 63
3.1.8 Southern Blot ... 65
3.1.9 Statistische Auswertung ... 68
3.2 Transposon-Injektionen in das Zytoplasma von Zygoten der Maus und des Schweines ... 68
3.2.1 Mäusezygoten ... 68
3.2.2 Schweinezygoten ... 79
3.3 Experimentelles Design ... 83
4 Ergebnisse ... 85
4.1 Vorüberlegungen ... 85
4.2 Ektopische Expression von hTERC und humaner Telomerase in Rinderzygoten durch transiente Transgenese ... 85
4.2.1 Mikroinjektion von humanen Telomerase-Plasmiden zur Generierung episomaler, transienter Transgenese ... 86
4.2.2 Analyse der generierten Blastozysten ... 91
4.2.3 Analyse der Telomerlängen in Blastozysten... 94
4.2.4 Aktivitätsmessung der Telomerase ... 102
4.2.5 Southern Blot zur Längenbestimmung der Telomeren ... 105
4.3 Kombination von zytoplasmatischer Injektion und Transposon- Plasmiden ... 106
4.3.1 Stabile Transgenese durch zytoplasmatische Transposon-Injektion in der
Maus ... 106
4.3.2 Stabile Transgenese durch zytoplasmatische Transposon-Injektion im Schwein ... 124
5 Diskussion ... 136
5.1 Expression humaner Telomerasekomponenten in bovinen Embryonen ... 140
5.2 Transposon-vermittelte Transgenese bei Mäusen und Schweinen . 146 5.3 Zusammenfassende Betrachtung und Ausblick ... 151
6 Zusammenfassung ... 154
7 Summary ... 156
8 Anhang ... 160
8.1 Angaben zu den Transposon-Plasmiden mit Primer-Sequenzen .... 160
8.1.1 pRCME_VenusTransposon ... 160
8.1.2 pCMV-SB100 ... 166
8.2 Medienzusammensetzung ... 170
8.2.1 Medien für die IVP boviner Embryonen ... 170
8.2.2 Lösungen und Reagenzien für die mRNA-Isolation aus Embryonen ... 176
8.2.3 Lösungen und Reagenzien für die Reverse Transkription und die PCR 176 8.2.4 Lösungen und Regenzien für die Agarose-Gelelektrophorese ... 178
8.2.5 Medien für Q-FISH ... 178
8.2.6 Lysis-Puffer für Q-TRAP ... 180
8.2.7 Lösungen und Reagenzien für Southern Blot ... 180
8.2.8 Medien für Northern Blot ... 183
8.2.9 Medien für die Zellkultur ... 183
9 Verzeichnisse ... 184
9.1 Abkürzungsverzeichnis ... 184
9.2 Tabellenverzeichnis ... 188
9.3 Abbildungsverzeichnis ... 189 9.4 Literaturverzeichnis ... 191
10 Danksagung ... 218
1 Einleitung
Rind und inbesonders das Schwein sind wichtige Modelle für die biomedizinische Forschung (KUES und NIEMANN, 2004; GOLOVAN et al., 2001; MULLER und BREM, 1994). Großtiermodelle sind für präklinische Versuche besser geeignet als Labornager, weil Physiologie, Metabolismus, Genom-Organisation und Lebensspanne ähnlich der humanen Situation sind (WALL und SHANI, 2008;
HABERMANN et al., 2007). Schweine werden bereits erfolgreich als Modell für kardiovaskuläre Erkrankungen, Arteriosklerose, Diabetes, ophtalmologische Erkrankungen sowie die Krebsforschung genutzt (GRANADA et al., 2009; PHILLIPS et al., 1982). Die Möglichkeit zur gezielten genetischen Veränderung durch rekombinante DNA-Techniken würde die Nutzung von Großtieren als Modell für humane Erkrankungen und für die Entwicklung neuer präklinischer Therapien wesentlich erweitern. Die Nutzung porciner Organe für die Xenotransplantation könnte einen wesentlichen Beitrag zur Reduzierung des vorhandenen Mangels humaner Spenderorgane leisten (SHARMA und HARISH, 2004). Allerdings ist die Transgenese bei Großtieren noch immer sehr ineffizient. Beim Schwein entwickeln sich nach DNA-Injektion in einen Vorkern von Zygoten durchschnittlich nur 1-2 % der Embryonen zu transgenen Nachkommen. Auch beim somatischen Kerntransfer mit transgenen Kernspenderzellen ist beim Schwein nur mit 1-3 % lebenden transgenen Nachkommen zu rechnen (PETERSEN et al., 2008). Ein Teil transgener Schweine, die aus der DNA-Mikroinjektion oder dem somatischen Kerntransfer resultieren, zeigte unerwünschte Expressionsmuster, die sich in variegierter Expression bzw.
Gen-Silencing äußern (DEPPENMEIER et al., 2006). Ein Grund dafür ist, dass die Fremd-DNA zufallsmäßig im Genom integriert wird, das Säugergenom aber nur zu 2- 3 % aus Protein-kodierenden Genen besteht, die überwiegende Anzahl von Fremd- DNA-Integrationen also in Bereichen geschieht, die für eine Genexpression ungeeignet sind.
Mit einem vereinfachten DNA-Injektionsverfahren von zirkulärer Plasmid-DNA in das Zytoplasma von Zygoten wurde eine neue effiziente Methode zur transienten Fremd- DNA-Expression in Säugerembryonen etabliert. Damit wurden wesentlich bessere
Expressionsraten, als mit der Standardmethode der Mikroinjektion, einer Injektion in den Zygotenvorkern, erreicht. Die Erfolgsrate lag zwischen 40-60 % (IQBAL et al., 2009). Die zytoplasmatische Plasmidinjektion führt jedoch meist zu einer transienten Transgenese, d.h. die injizierten Plasmide sind episomal stabil und werden an die Tochterzelle weitergegeben, aber replizieren nicht. Deshalb wurden in der vorliegenden Arbeit zwei verschiedene methodische Ansätze der Mikroinjektion in das Zytoplasma gewählt.
Im ersten Teil der Arbeit wurden bovinen Embryonen zirkuläre Expressionsplasmide, die humane Telomerase-Gene kodieren, in das Zytoplasma injiziert, um die Auswirkungen auf Entwicklungsfähigkeit, Telomerenlänge und Telomeraseaktivität in Blastozysten zu untersuchen. Es kommt zu einer transienten Transgenese, bei der die humanen Telomerase-Gene bis zum Blastozystenstadium exprimiert werden. Der Hauptbefund war, dass auch das katalytisch inaktive humane Telomerase-RNA-Gen zu einer Verlängerung der Rindertelomeren führt.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob die Kombination von zytoplasmatischer Plasmidinjektion mit einem nicht-autonomen Transposon zu einer verbesserten, stabilen Transgenese bei Labor- und Großtieren führt. Dazu wurden Versuche bei Maus und Schwein durchgeführt. Transposons sind springende DNA- Elemente, die zuerst von Barbara McClintock im Mais beschrieben wurden (MCCLINTOCK, 1953). Transposons kommen in spezies-spezifischer Ausprägung in allen untersuchten Genomen von Pro- und Eukaryoten vor. Jedoch sind die meisten Transposons durch Mutationen inaktiviert (MATES et al., 2009; KAWAKAMI, 2007).
Transposons wurden in den letzten Jahren als alternatives Verfahren für die Transgenese in Fliegen, Fischen, Fröschen, Mäusen und Ratten entwickelt (IVICS et al., 2009; KAWAKAMI, 2007). Bisher ist eine Transposon-vermittelte Transgenese bei Großtieren noch nicht beschrieben worden. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die gewählte Kombinationsmethode zu einer hohen Rate spezifischer Transposition des Reporterkonstruktes in das Genom von Mäusen und Schweinen führt; und vitale, stabil transgene Foundertiere erhalten werden können.
Durch die Enzym(Transposase)-vermittelte Integration wird jeweils nur eine Kopie des eigentlichen Transgens in das Genom eingebaut, dabei bevorzugt die
Transposase offenbar euchromatische Bereiche (MATES et al., 2009; GARRISON et al., 2007). Sowohl bei der Maus als auch beim Schwein wurden nahezu ubiquitäre Expressionsmuster nachgewiesen, variegierte Expressionsmuster oder Gen- Silencing traten nicht auf. Bei der Maus konnte bereits Keimbahntransmission nachgewiesen und die heterozygoten Founder zu einer transgen-homozygoten Linie verpaart werden. Dieses System verspricht eine einfache und effiziente Methode der Produktion transgener Tiermodelle zu werden und dürfte insbesondere für die Generierung und Nutzung transgener Großtiere von Bedeutung sein.
2 Schrifttum
2.1 Gentransfer in Säuger-Embryonen
Transgene Tiere sind von grundlegender Bedeutung für die moderne molekularbiologische und biomedizinische Forschung. Die ersten Versuche transgene Säuger zu erzeugen wurden 1971 durch Inkubation von Kaninchen- spermien mit radioaktiv markierter Simian Virus 40 (SV40)-DNA durch-geführt (BRACKETT et al., 1971). Nach künstlicher Befruchtung und Rückspülung von frühen Kaninchen-Embryonen konnte durch die Infektion einer Indikator-Zelllinie gezeigt werden, dass Säugerspermien virale DNA aufnehmen und bei der Befruchtung in die Eizelle transportieren können. Über das weitere Verhalten der Fremd-DNA konnte in diesen Versuchen nichts ausgesagt werden. Es war also nicht klar, ob die DNA unabhängig von den Chromosomen (episomal) oder in den Chromosomen integriert vorlag. Einige Jahre später konnten durch Infektion präimplantatorischer Maus-Embryonen mit SV40 transgene Mäuse erzeugt werden, die die Fremd–DNA in ihr Genom integriert hatten und an ihre Nachkommen weitergaben (JAENISCH, 1976). Trotz stabiler Integration der viralen DNA in das Genom der Wirtstiere kam es jedoch zu keinen phänotypischen Veränderungen, da die Fremd-DNA durch epigenetische Prozesse stillgelegt wurde (sog. Gen-Silencing).
2.1.1 Erstellung transgener Tiere durch DNA-Vorkerninjektion
Die Methode der Mikroinjektion linearer DNA in den Vorkern von Zygoten wurde bereits 1980 entwickelt (GORDON et al., 1980). Der erste Nachweis, dass eine rekombinante DNA zu phänotypischen Veränderungen im Säuger führt, wurde durch Injektion aufgereinigter DNA eines Rattenwachstumshormon(rGH)-Konstruktes in einen Zygotenvorkern geführt. Das Expressionskonstrukt trug den Metallothionein- Promoter und die cDNA von rGH. Das aufgereinigte lineare DNA-Expressions- konstrukt wurde direkt in den männlichen Vorkern von Mäusezygoten injiziert, die anschließend in den Eileiter von scheinschwangeren Empfängertieren übertragen
wurden (PALMITER et al., 1982). Die Mäuse zeigten phänotypisch ein verstärktes Wachstum.
Transgene Mausmodelle sind mittlerweile zum Standardwerkzeug der molekularbiologischen Forschung geworden. Sie werden für das Verständnis humaner genetischer Erkrankungen, wie Alzheimer und Parkinson, sowie die Entwicklung von Therapiemöglichkeiten in der Immunologie und Grundlagen- forschung benötigt (SCHARSCHMIDT und SEGRE, 2008; DODART und MAY, 2005;
YANG und GONG, 2005). Das Mausmodell hat jedoch neben etlichen Vorteilen auch Beschränkungen, die sich aus den gravierenden anatomischen und physiologischen Unterschieden zwischen Mensch und Maus ergeben (WALL und SHANI, 2008;
HABERMANN et al., 2007). Das Mausmodell ist zudem für spezifische Fragestellungen, z.B. in der Transplantationsmedizin und in der Bluthoch- druckforschung, nur sehr bedingt aussagekräftig.
Transgene Nutztiere stellen eine interessante Alternative und Ergänzung zum Mausmodell dar. Die ersten genetisch veränderten Schweine, Schafe und Kaninchen wurden 1985 durch DNA-Mikroinjektion in den Vorkern von Zygoten erstellt (HAMMER et al., 1985). In der Folgezeit wurde über transgene Ansätze versucht, verschiedene Eigenschaften von Nutztieren, wie Wachstum und Futterverwertung (GOLOVAN et al., 2001; PURSEL et al., 1997) sowie Reproduktion und Krankheitsresistenz (MULLER und BREM, 1994) zu verbessern.
Als großer Nachteil dieses Verfahrens erwies sich, dass die Erfolgsrate transgener Nachkommen mit durchschnittlich 5-10 % der geborenen Tiere gering ist. Bezogen auf die mikroinjizierten Embryonen liegen die Erfolgsraten nur bei 1-4 % (siehe Abb. 1).
0 5 10 15 [%]
Maus
Kaninchen
Schwein
Schaf
Rind
Abb. 1: Effizienz der DNA-Vorkerninjektion in verschiedenen Säugerspezies.
Die Transgenese-Effizienz ist sowohl als der relative Anteil der transgenen Tiere an den geborenen Nachkommen (gestrichelte Säulen) als auch als der relative Anteil an den DNA-injizierten und auf Empfängertiere übertragenen Embryonen (schwarze, gefüllte Säulen) angegeben (verändert nach Wall, 1996).
Zudem wird der Mikroinjektionsprozess als teuer und zeitaufwendig beschrieben (WALL et al., 1996). Im Gegensatz zur Maus weisen Zygoten von Rindern und Schweinen einen hohen Lipidanteil auf, was die Injektion in den Vorkern erschwert.
Nur durch Zentrifugation der Zygoten bei 12000-15000 g können die Vorkerne dargestellt werden (Abb. 2). Aufgrund der Zentrifugation kommt es zu einer vorübergehenden Abtrennung der Lipidbestandteile von den restlichen Zellbestandteilen (WALL und HAWK, 1988; HAMMER et al., 1985). Eine verminderte Entwicklungsfähigkeit der Embryonen durch diese Behandlung kann zu den beschriebenen geringen Erfolgsraten beitragen.
Abb. 2: Injektion in den Vorkern einer Schweinezygote.
Die Vorkerne sind durch Zentrifugation (15000 g) sichtbar gemacht worden.
Ein weiteres Problem ist, dass von den transgenen Nachkommen (Founder animals) nur ein kleiner Teil das Transgen vererbt (Keimbahntransmission) und die gewünschte Expression aufweist (WALL et al., 1996). Die Fremd-DNA wird zufällig im Genom integriert. Dabei verursachen Sauerstoffradikale, Strahlung und andere DNA-Mutagene zunächst DNA-Doppelstrangbrüche, diese sind zufällig im Genom verteilt und kommen in einer niedrigen Frequenz unter physiologischen Bedingungen vor. Durch die Schädigung der DNA wird ein zellulärer Reparaturmechanismus aktiviert, der in Anwesenheit von Fremd-DNA diese in einen DNA-Doppelstrangbruch ligieren kann. Da ein Säugergenom nur zu 2-3 % aus Protein-kodierenden Genen besteht, der Großteil von ungefähr 80 % repetitive Elemente und Strukturkomponenten (Telomere und Zentromere) und die restlichen ca. 17 % regulatorische Elemente (Promotoren, Enhancer, Silencer) sowie RNA-kodierende Gene sind, erfolgt die überwiegende Anzahl der Fremd-DNA-Integrationen in chromosomalen Bereichen, die für eine Genexpression ungeeignet sind. Die meisten Bereiche mit repetitiven DNA-Elementen sind durch extreme DNA-Kondensation zum sog. Heterochromatin geformt, das in der Regel nicht transkribiert werden kann.
Dadurch kann es zu variablen Expressionsmustern oder zum Silencing der Fremd- DNA kommen (DEPPENMEIER et al., 2006).
Insbesondere bei Nutztieren, aber auch in der Maus, sind die Probleme der Transgenese mit ungenügender oder ektopischer Expression nur teilweise verstanden. Gegenwärtig ist es wegen der unzureichenden Vorhersagbarkeit der
transgenen Expression immer noch notwendig, mehrere Linien transgener Tiere auf die gewünschten Expressionseigenschaften hin zu untersuchen. Das führt besonders bei Nutztieren zu enormen Kosten. Es wird geschätzt, dass die Erzeugung eines transgenen Rindes mit Hilfe der Mikroinjektion ca. 500.000 USD und bei Schweinen ca. 25.000 USD kostet (WALL et al., 1996).
2.1.2 Erstellung transgener Tiere durch somatisches Klonen
Das erste durch somatischen Kerntransfer geklonte Säugetier war das Schaf „Dolly“
und wurde 1996 geboren (WILMUT et al., 1997). Mit dem somatischen Kerntransfer steht eine Methode zur Verfügung, die die Erstellung transgener Nutztiere in vielerlei Hinsicht verbessern kann. Ein großer Vorteil dieser Methode ist, dass in den Spenderzellen gezielte Veränderungen am Erbgut vorgenommen werden können (sog. Gen-Targeting) und anschließend identische Gruppen transgener Tiere erstellt werden können (DENNING et al., 2001). Ein weiterer Vorteil ist, dass die Keimbahngängigkeit des Transgens mit großer Wahrscheinlichkeit gegeben ist, da die Tiere aus der Erbinformation einer einzigen Zelle entstanden sind. Die Selektion erfolgt auf Zellebene und nicht auf Tierebene.
Nach „Dolly“ folgten in den in den darauffolgenden Jahren weitere Säugetier- Spezies, bei denen der somatische Kerntransfer erfolgreich, d.h. mit der Geburt von lebenden Nachkommen, eingesetzt wurde (siehe Tabelle 1).
Tab. 1: Übersicht über die Erfolgsraten bei den wichtigsten durch somatischen Kerntransfer geklonten Spezies (nach Kues und Niemann 2004, verändert).
Spezies
Geschätzte Anzahl weltweit lebender Klontiere
% lebensfähiger
Nachkommen Erstes gelungenes Experiment
Rind ca. 4000 15 - 20 (CIBELLI et al., 1998) Schwein ca. 1000-1500 < 1
(BETTHAUSER et al., 2000;
ONISHI et al., 2000;
POLEJAEVA et al., 2000)
Schaf ca. 400 5 - 8 (CAMPBELL et al., 1996)
Ziege ca. 400 3 (BAGUISI et al., 1999)
Pferd ca. 1 ~ 1 (GALLI et al., 2003)
Maultier ca. 1 ~ 1 (WOODS et al., 2003)
Katze ca. 1 < 1 (SHIN et al., 2002)
Hund ca. 1 < 1 (LEE et al., 2005)
Kaninchen ca. 6 < 1 (CHESNE et al., 2002)
Maus ca. 600 < 2 (WAKAYAMA et al., 1998)
Ratte ca. 4 ~ 2 (ZHOU et al., 2003)
Für die Erzeugung transgener Tiere mittels der klassischen Klon-Methode ist die Zelltransfektion bzw. ein Gen-knock out der Spenderzelllinie erforderlich. Hierzu werden die entsprechenden DNA-Konstrukte in die Spenderzellen, z.B. Fibroblasten, eingebracht. Die Grundschritte des somatischen Kerntransfers können wie folgt zusammengefasst werden: Der erste Schritt ist die Enukleation. Dazu wird mit Hilfe der Mikromanipulation und einer Enukleationspipette der erste Polkörper sowie die Methaphase-II-Platte aus der gereiften Oozyte entfernt (PRATHER et al., 1999). Bei diesem Schritt ist es wichtig, dass das aspirierte Volumen möglichst gering ist, da es maternale mRNA und Proteine enthält, die wichtig für die ersten Zellteilungen und die Rückprogrammierung des übertragenen Genoms sind (MADDOX-HYTTEL et al., 2001). Der zweite Schritt ist das Einbringen der Spenderzelle in den perivitellinen Raum der entkernten Oozyte. In den meisten Versuchen wurden Spenderzellen, die sich in der G0/G1-Phase des Zellzyklus befanden, verwendet. Der dritte Schritt ist die Fusion der entkernten Oozyte mit der somatischen Zelle. Dies wird durch einen
elektrischen Impuls induziert und durch einen zweiten Impuls, der je nach Tierart elektrisch oder chemisch erfolgt, aktiviert. Der vierte Schritt ist entweder der Embryotransfer, der unmittelbar nach der Aktivierung durchgeführt werden kann, um eine optimale Umgebung für die Entwicklung zu schaffen; oder die aktivierten Oozyten können unter Kulturbedingungen bis zur Blastozyste kultiviert werden.
Für die geringe Effizienz des Klonens nach somatischem Kerntransfer wird vornehmlich eine Aberration in der Entwicklung der Spenderzelle verantwortlich gemacht. Diese wird mit dem Differenzierungsgrad der Spenderzelle in Verbindung gebracht (JAENISCH, 2002). Um bei den erstellten Oozyten-Spenderzellkomplexen einen diploiden Chromosomensatz zu erhalten, müssen sich die Spenderzellen in der G0/G1-Phase des Zellzyklus befinden.
Eine wesentliche Limitation des somatischen Kerntransfers ist der hohe technische und zeitliche Aufwand. Zudem ist für die Mikromanipulationsschritte ein aufwändiges Training notwendig. Die Erfolgsaussichten aus einem rekonstruierten Embryo ein geborenes Klontier zu erhalten, liegen bei den meisten Säugerspezies bei ca. 3 %.
Nur beim Rind sind Erfolgsraten von 20-25 % reproduzierbar (KUES und NIEMANN, 2004).
2.1.3 Transiente Transgenese durch zirkuläre DNA-Plasmid-Injektion in Säugerembryonen bzw. intramuskuläre Injektion als DNA-Vakzine
Mit einem vereinfachten Injektionsverfahren für zirkuläre DNA in das Zytoplasma von Zygoten wurde eine effiziente Methode zur transienten Fremd-DNA-Expression in Säugerembryonen etabliert (IQBAL et al., 2009). Insbesondere für Zygoten von Rindern und Schweinen stellt diese Methode wegen der schlechten Sichtbarkeit der Vorkerne eine deutliche Verbesserung dar. Über die zytoplasmatische Injektion werden wesentlich bessere Expressionsraten als mit der Standardmethode, der Injektion in den Vorkern, erreicht. Nach Injektion eines linearen Oct4-GFP- Konstruktes in einen Vorkern von Rinderzygoten wurde eine maximale Erfolgsrate von 4 % erzielt (KIRCHHOF et al., 2000). Viele der erhaltenen Blastozysten wiesen eine Mosaikexpression auf. Das gleiche Oct4-Konstrukt wurde in zirkulärer Form ins Zytoplasma injiziert und die Erfolgsrate lag bei 40-60 % (IQBAL et al., 2009).
Die zytoplasmatische Plasmidinjektion führt meist nur zu einer transienten Transgenese, d.h. die injizierten Plasmide liegen episomal vor. Da die Plasmide in eukaryotischen Zellen nicht replizieren, kommt es bei jeder Zellteilung zu einem Verdünnungseffekt und spätestens nach 10 Zellteilungen sind die Zellen wieder weitgehend frei von Plasmiden. Für Untersuchungen in der frühen Embryogenese bis zur Blastozyste (je nach Spezies 6-8 Zellteilungen) ist die Methode daher gut geeignet.
Die ektopische Expression von zirkulären Plasmiden wird zur Zeit auch für die Entwicklung von DNA-Impfstoffen getestet, von denen die ersten für veterinär- medizinische Vakzinierungen zugelassen sind. Die DNA-Vakzinierung basiert auf dem Konzept, dass Fremd-DNA von Zellen aufgenommen und ihre Genprodukte dort exprimiert werden. Zur Immunisierung werden die ausgewählten Gene in Expressionsplasmide unter der Kontrolle starker eukaryotischer Promotoren kloniert.
In der Regel handelt es sich dabei um virale Promotoren (KOWALCZYK und ERTL, 1999). Die Plasmid-DNA wird in die Zellen aufgenommen und in den Zellkern transportiert. Die DNA wird in mRNA umgeschrieben und die Proteine anschließend wie bei einer natürlichen Infektion hergestellt (GERDTS und METTENLEITER, 2001).
Für die DNA-Vakzinierung ist es ausreichend, wenn die kodierende Sequenz für ein Pathogen transient exprimiert wird. Dies führt zu einer stimulierten Immunantwort bei dem behandelten Organismus. Die Projekte der Gensequenzierung werden laufend fortgeführt, dies bringt einen leichten Zugang zu pathologischen DNA-Sequenzen mit sich, was in Kombination mit leicht verfügbaren Methoden der rekombinanten DNA- Herstellung zu einer schnellen Verfügbarkeit solcher Vakzinen führen könnte. Die direkte Injektion von zirkulärer kovalent geschlossener (ccc)-Plasmid-DNA in die Sklettmuskulatur induziert die Produktion von ektopischen Proteinen (WOLFF et al., 1990). Innerhalb weniger Wochen degradiert die injizierte Plasmid-DNA (GRAVIER et al., 2007). Gegen die klassische Schweinepest wurde erstmals 2001 eine DNA- Vakzine entwickelt (YU et al., 2001). Eine der ersten DNA-Vakzinen, die zur Anwendung bei Pferden genehmigt wurde, war die Vakzine gegen das West Nil Virus (HALL und KHROMYKH, 2004). Ein großer Vorteil der DNA-Vakzinen ist, dass sie im Gegensatz zu attenuierten Impfstoffen nicht die Gefahr bergen, zu mutieren und
somit wieder pathogen zu werden. Als kritisch im Zusammenhang mit der DNA- Immunisierung ist zum einen die Gefahr einer Aktivierung von Onkogenen durch die starken Promotoren zu sehen (ULMER et al., 1993), zum anderen ist eine Integration der Plasmid-DNA ins Wirtszellgenom nicht ausschließbar (GERDTS und METTENLEITER, 2001). Allerdings kommt es durch die Immunantwort zur Phagozytose der plasmid-DNA-exprimierenden Zellen (entsprechend Lyse von pathogen-infizierten Zellen), so dass dieser Aspekt von untergeordneter Bedeutung sein dürfte.
2.1.4 Transposon-vermittelte Transgenese
Transposons sind springende DNA-Elemente, die zuerst von Barbara McClintock im Mais beschrieben wurden (MCCLINTOCK, 1953). Sie identifizierte dabei aufgrund von Farbvariationen in Maiskörnern zwei ursächlich verantwortliche Faktoren, die als Dissociator (Ds) und Activator (Ac) bezeichnet wurden. Erst 25 Jahre später wurde als zugrundeliegender molekularer Mechanismus die DNA-Transposition der Ds- und Ac-Gene entdeckt. Sie werden als sog. Klasse-II-Transposons bezeichnet.
Transposons kommen in spezies-spezifischer Ausprägung in allen untersuchten Genomen von Pro- und Eukaryoten vor. Jedoch sind die meisten Transposons durch Mutationen inaktiviert (MATES et al., 2009; KAWAKAMI, 2007). Im Humangenom befinden sich ca. 16 % nicht-funktionelle Klasse-II-Transposons (DING et al., 2005).
Transposons wurden als alternatives Verfahren für die Transgenese in Fliegen, Fischen, Fröschen, Mäusen und Ratten entwickelt (IVICS et al., 2009; KAWAKAMI, 2007). DNA-basierte oder auch Klasse-II-Transposons bewegen sich mittels eines
„cut-and-paste“-Mechanismus im Wirtsgenom (ALBERTS et al., 2004 a). Die meisten DNA-Transposons sind einfach aufgebaut: Sie kodieren für ein Transposase-Protein, das von „inverted terminal repeats“ (ITRs) flankiert ist. Bei der Transposition schneidet die Transposase die DNA an beiden Enden der ITRs und trennt die gesamte Transposon-DNA von der benachbarten DNA. Anschließend wird das Transposon aktiv in eine neue Stelle eingefügt. Dafür ist keine Homologie zwischen dem transponierten Element und der Insertionsstelle erforderlich (ALBERTS et al., 2004 a). Der Mechanismus der Transposition ist in Abbildung 3 dargestellt.
Abb. 3: Transposition eines Klasse-II-Transposons
Die DNA-Transposons werden von dem Enzym Transposase an den invertierten DNA-Sequenz- Wiederholungen (ITR) an den Enden der Transposons erkannt. Die Translokation beginnt, indem die Transposase die beiden invertierten Sequenzen zusammenführt und so eine DNA-Schleife ausbildet und das ITR-flankierte Transposon herausschneidet. Die Insertion in das Zielchromosom erfolgt durch die Transposase an eine Erkennungssequenz, die in der Regel aus einer kurzen Basenabfolge besteht (dargestellt durch die roten Pfeile). (Abb. aus ALBERTS et al., 2004, S. 332).
Als Konsensussequenz für die Integrationsstelle sind für die meisten Transposons kurze Di- oder Oligonukleotidsequenzen (z.B. 5´-TA oder 5´-TTAA) ausreichend.
Allerdings erfolgt die Integration nicht zufallsmäßig, sondern bevorzugt in Euchromatin-Regionen des Genoms.
Der transpositionelle Prozess kann kontrolliert werden, indem die Transposase vom transposablen DNA-Element durch rekombinante DNA-Techniken separiert wird;
man kann so ein nicht-autonomes Transposon schaffen (IVICS et al., 2009). In einem solchen Zwei-Komponenten-System kann das Transposonelement nur bewegt werden, indem das Transposase-Protein supplementiert wird.
Die Transposons wurden erfolgreich zur Erstellung von Tiermodellen bei Invertebraten eingesetzt. Als Beispiel sind C. elegans und Drosophila für Transgenese mit anschließender insertioneller Mutagenese zu nennen (THIBAULT et al., 2004; ZWAAL et al., 1993). Aber bis zur Reaktivierung des Sleeping Beauty (SB) Transposonsystems 1997 gab es keinen Hinweis, dass es Klasse II-
Transposonsysteme bei Vertebraten gibt, die für diese Fragestellung ausreichend aktiv sind (IVICS et al., 1997).
Nachfolgend wurden eine Reihe weiterer Transposasen auf ihre Eignung für die Transgenese in verschiedenen Spezies untersucht. Mit dem Transposon Tol1 wurden transgene Zebrafische erzeugt (KOGA et al., 2008), mit dem Transposon Tol2 wurden transgene Zebrafische, Medakafische und Xenopus tropicalis produziert (KAWAKAMI, 2007; HAMLET et al., 2006). Das Gleiche gelang auch mit dem Transposon Sleeping Beauty (SB) (HERMANSON et al., 2004; DAVIDSON et al., 2003). Mit SB wurden auch transgene Mäuse erzeugt (DUPUY et al., 2002).
Kürzlich wurde durch kombinatorische Mutagenese eine hyperaktive SB- Transposase (SB100 x) entwickelt und in Maus-Zygoten eingebracht. Die zirkuläre Plasmid-DNA eines Venus-markierten Transposons wurde mit SB100 x- Transposase-mRNA in einen Vorkern von Mäusezygoten koinjiziert. C.a. 45 % der injizierten Embryonen zeigten am Tag 7 nach der Injektion eine Fluoreszenz. Nach Übertragung in eine Leihmutter waren 37 % der Nachkommen positiv (MATES et al., 2009). Im Schnitt wurden hier ein bis zwei integrierte Transposons pro Genom nachgewiesen.
Einige der Probleme der klassischen Methoden für Transgenese (geringe Effizienz, Transgen-Silencing, variegierte Expression) können offenbar überwunden werden, indem die Fremdgene über das Transposonsystem eingefügt werden. Dieses System erhöht die Effizienz der chromosomalen Integration und erleichtert Einfachintegrationen. Die Injektion in vitro-synthetisierter mRNA als Transposase- Quelle kann die Effizienz noch weiter erhöhen, da die Transposase schneller verfügbar ist. Aufgrund der bevorzugten Integration in Euchromatin-Regionen führt die DNA-Transposition nur selten zu stillgelegten Transgenen oder Transgenen mit variegierter Expression. Bisher wurde keine Transposon-vermittelte Transgenese bei Großtieren beschrieben.
2.1.5 Sonstige Methoden der Transgenese
Lentiviren, eine Unterklasse der Retroviren, haben sich als effektive Vektoren für den Gentransfer in Oozyten und Zygoten erwiesen (PARK, 2007). Retrovirale Vektoren
werden für die Transgenese verwendet, da sie die Fähigkeit haben, ein Genkonstrukt mit hoher Effizienz ins Wirtsgenom zu integrieren (NALDINI et al., 1996). Das Genom der Retroviren besteht aus zwei identischen Kopien einzelsträngiger RNA. Nachdem die Wirtszelle infiziert wurde, synthetisiert eine vom viralen Genom produzierte Reverse Transkriptase eine komplementäre doppelsträngige cDNA. Virale Vektoren tragen Long Terminal Repeats (LTRs). Diese sind zum einen wichtig für die Initiierung der reversen Transkription, zum anderen integrieren sie das virale Genom und regulieren die Transkription der viralen Gene in der Wirtszelle. Virale Gensequenzen sind dabei durch das Transgen-Konstrukt ersetzt worden. Dies führt zu replikativ defekten Virus-Partikeln (GELDERMANN, 2005). Lentiviral-vermittelter Gentransfer generiert sehr hohe Raten transgener Tiere, verbunden mit multiplen Integrationen. Im Jahr 2003 produzierten Hofmann et al. transgene Schweine, die das GFP-Reporter-Gen trugen, das durch einen lentiviralen Vektor vermittelt war.
70 % der Tiere waren transgen. Der Virus wurde in den perivitellinen Raum einzelner Zygoten injiziert (HOFMANN et al., 2003). Lentivirale Vektoren tragen aus Sicherheitsgründen niemals Gene, die für die Replikation erforderlich sind. Trotzdem gibt es einige Probleme im Zusammenhang mit diesen Vektoren. Z.B. kann es durch die multiplen Integrationen zu unerwünschten Nebeneffekten kommen, die durch eine Aktivierung von Oncogenen oder insertioneller Mutagenese hervorgerufen werden (THEMIS et al., 2005).
Seit 1989 wird auch der Spermien-vermittelte Gentransfer für die Produktion von transgenen Tieren genutzt. Diese Methode basiert auf der Fähigkeit der Spermien exogene DNA-Moleküle zu binden und zu internalisieren. Bei der Fertilisierung werden sie in die Oozyte verbracht und im Zygotenstadium ins Genom integriert (LAVITRANO et al., 1997). Transgene Spermien können für IVF oder künstliche Befruchtung eingesetzt werden, um transgene Tiere zu produzieren. Diese Methode wird als effektiv und kostengünstig beschrieben (LAVITRANO et al., 2002). Die Nachkommen müssen auf eine Integration der Fremd-DNA getestet werden.
Untersuchungen zeigen, dass der Spermien-vermittelte Gentransfer zwar brauchbar, aber nicht vorhersagbar ist (SMITH und SPADAFORA, 2005). Die Methode wurde erfolgreich bei verschiedenen Spezies, einschließlich Schwein und Rind,
angewendet (SCHELLANDER et al., 1995; SPERANDIO et al., 1996). Der Spermien vermittelte Gentransfer ist aber nicht robust genug für eine generelle Anwendung, da nur wenige Labore stabil-transgene Founder-Tiere mit dieser Methode produziert haben.
2.2 Aufbau und Zellzyklus eukaryotischer Zellen
Im Laufe der Evolution haben sich zwei verschiedene Gruppen von Organismen gebildet, die sich durch die Struktur ihrer Zellen stark unterscheiden, die Prokaryoten und die Eukaryoten.
2.2.1 Prokaryoten
Die Prokaryoten sind in der Regel einzellig. Die Zellen haben keinen Zellkern. Das genetische Material liegt als doppelsträngiges, ringförmiges DNA-Molekül vor. Es ist nicht durch eine Membran von der übrigen Zelle getrennt. Organellen wie Mitochondrien, Endoplasmatisches Retikulum und Golgi-Apparat fehlen.
Die Vermehrung der Prokaryoten geschieht durch einfache Zweiteilung. Bevor es zur Teilung kommt, wird die DNA repliziert, dafür muss die Doppelhelix geöffnet werden, damit die ungepaarten Basen freiliegen. Die Synthese beginnt am Replikationsursprung (Beginn der Helixöffnung). Die bakteriellen Chromosomen haben an ihrer ringförmigen DNA nur einen Replikationsursprung. Die beiden Replikationsgabeln laufen in entgegengesetzter Richtung um das Chromosom, bis sie sich auf halber Strecke treffen. Aufgrund dieser ringförmigen Struktur können die DNA-Polymerasen die DNA kontinuierlich ablesen. Genetische Informationen gehen nicht verloren (ALBERTS et al., 2004 b).
2.2.2 Eukaryoten
Zellen der Eukaryoten sind wesentlich komplexer aufgebaut als bei Prokaryoten. Sie haben zahlreiche Organellen, einen von einer Kernhülle umschlossenen Zellkern und in der Regel mehrere Chromosomen. Die Gesamtheit der vererbbaren Information
eines Organismus, die als DNA vorliegt, wird als Genom bezeichnet. Bei Eukaryoten liegt die doppelsträngige DNA als lineares Molekül vor.
Die Vermehrung eukaryotischer Zellen verläuft zyklisch in vier aufeinander folgenden Phasen (siehe Abb. 4). Der Zellzyklus umfasst die Gesamtheit aller biochemischen Vorgänge, die während der Teilung einer Zelle ablaufen. Eine grundlegende Funktion des Zellzyklus ist die orginalgetreue Verdopplung des Genoms und die anschließende gleichmäßige Aufteilung der Kopien auf die Tochterzelle (ALBERTS et al., 2004 c).
Für die Vermehrung der Eukaryoten sind zwei verschiedene Formen der Kernteilung von entscheidender Bedeutung.
2.2.2.1 Meiose
In der meiotischen Kernteilung wird die Anzahl der Chromosomen vom diploiden auf den haploiden Satz reduziert (HAMOIR, 1992). Dies ist für die geschlechtliche Vermehrung erforderlich, bei der die haploiden Kerne aus Ei und Spermium miteinander verschmelzen und ihre Chromosomen zum diploiden Chromosomensatz der Zygote kombinieren (ALBERTS et al., 2004 d).
2.2.2.2 Mitose
Für die Entwicklung eines Organismus ist eine Vielzahl mitotischer Zellteilungen notwendig. Darüber hinaus bleiben für die Erneuerung und Reparatur von Geweben Zellteilungen essentiell.
In der Interphase des Zellzyklus wird jedes Chromosom mit der darin enthaltenen DNA verdoppelt. Die sehr viel längeren eukaryotischen Chromosomen brauchen jeweils mehrere Replikationsursprünge (ALBERTS et al., 2000 b). Nach der Reduplikation besteht jedes Chromosom aus zwei identischen Chromatiden, die in der Telophase auf die Tochterkerne verteilt werden (FLEMMING, 1965).
Abb. 4: Die mitotische Zellvermehrung der Eukaryoten (Abb. aus ALBERTS, 2004, S. 1195)
2.2.3 Genomorganisation bei Eukaryoten
Das Genom hat die Aufgabe, das Programm der ontogenetischen Entwicklung eines Vielzellers zu definieren. Der größte Teil der genetischen Information einer Eukaryotenzelle ist auf mehrere Chromosomen verteilt und befindet sich im Kern, der durch eine doppelschichtige Membran vom Cytoplasma der Zelle getrennt ist.
Das Genom der meisten Eukaryoten ist sehr groß, wobei der Anteil nicht kodierender DNA meist größer ist als der Anteil codierender DNA. Ein Großteil der Gene im Eukaryoten-Genom codiert für Proteine, welche die Aktivität anderer Gene kontrollieren und koordinieren (ALBERTS et al, 2004 e).
Bei Eukaryoten müssen auch Gene, deren Produkte eine Einheit bilden, individuell reguliert werden. Häufig sind diese Gene sogar auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert. Diese individuelle Regulation hat den Vorteil einer höheren Flexibilität.
Anders als bei Prokaryoten sind die kodierenden Bereiche der eukaryotischen DNA (Exons) immer wieder durch nicht-codierende Bereiche (Introns) unterbrochen. Diese nicht-codierenden DNA-Bereiche werden zunächst auch transkribiert, d.h. in mRNA übersetzt. Sie müssen aber später aus der mRNA durch Spleißen wieder entfernt werden, bevor die mRNA als reife mRNA vom Kern ins Cytoplasma der Zelle transportiert wird. Die Anzahl an Introns variiert beträchtlich; während manche Gene über 50 Introns haben, fehlen diese bei anderen Genen völlig. Die reife mRNA der
Eukaryoten ist am 5'- und am 3'-Ende prozessiert und enthält im Gegensatz zur Vorläufer-mRNA keine Introns mehr (CAMPELL et al., 2000).
2.3 Kurzer Abriss der Embryonalentwicklung beim Säuger
Während der Oogenese sind die Stadien bei den verschiedenen Spezies ähnlich. Die angelegten Urgeschlechtszellen wandern in die sich bildenden Gonaden und werden zu Oogonien. Während dieser Phase machen sie in relativ kurzer Zeit zahlreiche mitotische Teilungen durch. Dieser Vermehrungsprozeß ist bei den meisten Arten bereits vor der Geburt abgeschlossen (SCHNORR, 2001 a). Es folgt eine erste Wachstumsperiode, in der sich die Oogonien zu Oozyten 1. Ordnung weiter entwickeln. Diese haben die Prophase der ersten Reifeteilung bis zum späten Diplotän durchlaufen. In diesem Stadium kommt es zur Arretierung der meiotischen Teilung. Diese wird durch Arretierungssubstanzen und das Fehlen von Substanzen, die für die Meiose nötig wären, aufrechterhalten (FULKA, Jr., 1985; BALAKIER, 1978). Die Gesamtzahl der Keimzellen beim weiblichen Individuum ist zu diesem Zeitpunkt festgelegt und wird durch Ovulation und Atresie nur verringert. Die Eizelle wird von einem einschichtigen Plattenepithel umgeben und bildet mit diesem zusammen den sog. Primordialfolikel (SCHNORR, 2001 a). Der Beginn der Geschlechtsreife variiert tierartlich beträchtlich. Mäuse erreichen sie bereits mit ca. 4 Wochen, Schweine hingegen erst mit ca. 7 Monaten. Mit Beginn der Geschlechtsreife tritt ein Teil der Primordialfollikel in die zweite Wachstumsperiode ein, und die Oozyten erreichen ihre endgültige Größe (RACOWSKY et al., 1989).
Nicht alle Oozyten, die ihre vollständige Größe erreicht haben, gelangen zur Ovulation. Die Mehrzahl der Oozyten und der sie umgebenden Follikel atresiert und degeneriert (BYSKOV, 1978). Während der Reifung der Oozyten, die in Wellen mit Eintritt der Geschlechtsreife erfolgt, beendet die primäre Oozyte ihre erste meiotische Teilung. Durch eine ungleiche Zytokinese entsteht am Ende der 1. Teilung die sekundäre Oozyte mit einem Polkörper. In diesem Stadium wird sie meist spontan aus dem sog. Graafschen Follikel freigesetzt, eine Ausnahme bilden z.B. Hasen und Kaninchen hier erfolgt eine induzierte Ovulation (SCHNORR, 2001 a). Nach der Bildung des ersten Polkörpers erfolgt direkt die zweite Reifeteilung. Mit Erreichen des
Metaphasestadiums wird der Zellzyklus erneut arretiert. Mit der Oozytenreifung erlangt die Oozyte schließlich ihre Befruchtungskompetenz. Die Einleitung der Reifung erfolgt durch einen präovulatorischen Anstieg des luteinisierenden Hormons (LH) (TSAFRIRI et al., 1976). Das Ergebnis der Kernreifung ist ein haploider Chromosomensatz. Die die Eizelle umgebenden Kumuluszellen expandieren, diese Auflockerung des Zellverbandes ist ein Kriterium für die erfolgte Reifung der Oozyte (MOTLIK et al., 1984). Die Freisetzung der befruchtungskompetenten Oozyte während des Ovulationsvorganges erfolgt tierartlich verschieden, z.B. zwischen 25 Stunden beim Schaf und 40 Stunden beim Schwein, nach Auftreten des LH Peaks (NIEMANN und MEINECKE, 1993 a). Die Oozyten bleiben im weiblichen Genitaltrakt etwa 8-15 Stunden befruchtungsfähig, die Spermien bis zu 48 Stunden (SCHNORR, 2001 b). Die Befruchtung der durch die Ovulation freigesetzten Ooyzte erfolgt in der sog. Eileiterampulle. Die bei der Ejakulation ausgestoßenen Spermien erlangen im weiblichen Genitaltrakt ihre Befruchtungsfähigkeit (SCHNORR, 2001 c).
Die Befruchtungsfähigkeit der Spermien erfolgt durch die sog. Kapazitation. Die Dauer der Kapazitation liegt beim Schaf bei etwa 1 Stunde, beim Rind bei 4 Stunden (NIEMANN und MEINECKE, 1993 b). Wenn das Spermium die Oozyte penetriert, kommt es zur Aktivierung der Oozyte. Zirka 3 Stunden nach Eindringen des Spermiums beendet die Oozyte ihre zweite meiotische Teilung und der zweite Polkörper wird ausgeschleust. Es folgt eine Zonareaktion, die das Eindringen weiterer Spermien verhindert (BRACKETT et al., 1980). Etwa 4-8 Stunden nach der Penetration dekondensiert der Spermienkopf und bildet den größeren männlichen Vorkern. Der kleinere weibliche Vorkern wird 5-9 Stunden nach Eindringen des Spermiums gebildet (HOWLETT und BOLTON, 1985). Die Vorkerne nehmen an Größe zu und wandern in das Zentrum der Oozyte, wo sie fusionieren. Diese Phase dauert beim Säuger etwa 12-18 Stunden (FLEMING und JOHNSON, 1988).
Zusammen mit dem Wachstum erfolgt die Replikation des Genmaterials als Vorbereitung auf die erste Furchungsteilung. Die Syngamie beginnt 18-21 Stunden nach Penetration des Spermiums mit der Auflösung der Kernmembran. Die kondensierten Chromosomen vermischen sich und ordnen sich in der Äquatorialebene an. Mit der Syngamie ist eine Zygote mit diploidem
Chromosomensatz entstanden (SCHNORR, 2001 b). Die Prophase der ersten mitotischen Furchungsteilung ist erreicht.
In den ersten 5-8 Tagen nach der Fertilisation durchläuft der Embryo mehrere für die Entwicklung entscheidende Phasen: Die ersten Furchungen erfolgen, es findet die Kompaktierung zur Morula statt und schließlich kommt es zur Bildung der Blastozyste mit Ausbildung des Embryonalknotens (Innere Zellmasse, ICM) und des Trophoblasts (TB) (KIDDER, 1992).
Die ersten drei Furchungen finden im Eileiter statt. Im 8-Zell-Stadium gelangt der Embryo über den Eileiteristhmus in die Uterushornspitze. Von dort gelangt der Embryo als geschlüpfte Blastozyste zum Ort der Implantation in der Gebärmutter.
Aus der ICM entwickelt sich später der Fetus, während Amnion- und Chorionepithel (Teile der Fruchthüllen) aus dem TB hervorgehen (RÜSSE, 1999). Wegen der unterschiedlichen Tragezeiten ist die präimplantatorische Entwicklung bei den verschiedenen Säugern von der befruchteten Eizelle bis zur Implantation im zeitlichen Ablauf verschieden (siehe Tabelle 2). Z.B. erfolgt die Implantation bei der Maus schon an Tag 4, beim Rind hingegen erst an Tag 18.
Mensch und Rind haben sehr ähnliche Tragzeiten, deshalb ist das Rindermodell auch gut für die Erforschung der Embryonalentwicklung beim Menschen geeignet.
Tab. 2: Frühembryonale Entwicklung bei verschiedenen Säugern von der befruchteten Eizelle bis zur Implantation und Trächtigkeitsdauer.
Spezies Zygoten Zwei- zeller
Vier- zeller
Acht-
zeller Morula Blasto- zyste
Implanta- tion (Beginn)
Trächtig- keitsdauer Maus
Befruch- tung Tag 0
12 h 24 h 48 h 60 h 3. Tag 4. Tag 4. Tag 21 Tage Schwein 12 h 24 h 48 h 56 h 5. Tag 6. Tag 14.-17.
Tag 114 Tage
Rind 24 h 48 h 96 h 120
h 6. Tag 7.-8.
Tag 18. Tag 280 Tage Mensch 20 h 30 h 40 h 50 h 3.
Tag 5. Tag 15.Tag 280 Tage
2.4 Telomeren
2.4.1 Telomeren als Funktionseinheit der Chromosomen
Telomeren sind hochspezialisierte Strukturen an den Enden eukaryotischer Chromosomen (BLACKBURN, 1991; GREIDER, 1991). Sie bestehen aus hoch repetitiven DNA-Elementen und speziellen DNA-bindenden Proteinen (SMOGORZEWSKA und DE LANGE, 2004). Der Begriff Telomeren wurde 1938 von Hermann Muller eingeführt. Er leitet sich aus den griechischen Wörtern „telos“ für Ende und „meros“ für Teil ab. Abbildung 5 zeigt den schematischen Aufbau der Chromosomen mit den Telomeren als sog. Kappenstruktur an den Chromosomenenden.
Abb. 5: Schematische Darstellung der Struktur der Chromosomen, mit den Telomeren (Abb. aus GREIDER und BLACKBURN, 1998)
Bei der Arbeit mit Drosophila stellte Muller fest, dass von Röntgenstrahlen induzierte chromosomale Schäden nie die Chromosomenenden betrafen, was auf einen besonderen Schutz schließen ließ (MULLER et al., 1937). Das Phänomen, dass die Enden der Chromosomen aus besonderen Strukturen bestehen und sich anders als das restliche Chromatin verhalten, wurde von McClintock durch Arbeiten an Maischromosomen in den vierziger Jahren bestätigt (MCCLINTOCK, 1942;
MCCLINTOCK, 1941). Obwohl die Telomeren in einem Genom aus denselben Sequenzen bestehen, variieren die Sequenzen bei verschiedenen Spezies (DE
LANGE et al., 1990). Die Sequenz der Telomeren wurde zuerst bei dem Ciliaten Tetrahymena entschlüsselt (5´TTGGGG) (YAO et al., 1981). In Säugerzellen bestehen diese terminalen DNA-Strukturen aus guaninreichen hexameren Wieder- holungen der Nukleotid Sequenz 5´-TTAGGG-3´ (GREIDER, 1996; MOYZIS et al., 1988). Die Länge der Telomeren variiert spezies-spezifisch. Bei Rindern, Menschen und Wildmäusen liegt sie bei 10-15 kb (HEMANN und GREIDER, 2000). Bei ingezüchtenen Labormäuselinien kann die Telomerenlänge zwischen 30-150 kb variieren (HEMANN und GREIDER, 2000). Die Hauptfunktion der Telomeren besteht darin, die DNA-Enden zu schützen (BLACKBURN, 2001) und von Doppelstrangbrüchen innerhalb der Chromosomen zu unterscheiden. Dadurch verhindern die Telomeren eine Aktivierung der DNA-Reparaturmechanismen, die Bildung chromosomaler Fusionen sowie die Entstehung von chromosomaler Instabilität (HANDE et al., 1999; COUNTER et al., 1992). Schon frühzeitig wurde erkannt, dass die Telomeren die doppelsträngigen DNA-Enden vor Degradierung, Fusion und Rekombination mit chromosomeninterner DNA verhindern (MCCLINTOCK, 1941). Telomeren verhindern also nicht nur die End-zu-End-Fusion, sondern sowohl fehlerhafte Rekombination zwischen den Chromosomenenden während des Zellzyklus (D´ADDA Di FAGAGNA et al., 2003; HABER und THORBURN, 1984) als auch die Auslösung der DNA-Schadensreparations- maschinerie. Sie schützen die DNA desweiteren vor enzymatischen Angriffen (VERDUN und KARLSEDER, 2007; ZAKIAN, 1997).
Am äußeren Chromosomen-Ende bilden die Telomeren einen G-reichen etwa 200 Basenpaare langen einzelsträngigen 3´Überhang, der mit den Telomer bindenden Proteinen interagiert (WRIGHT et al., 1997; HENDERSON und BLACKBURN, 1989).
Diesen 3´Einzelstrang-Überhang gibt es bei Menschen und anderen Vertebraten (MAKAROV et al., 1997). Das sogenannte T-Loop Modell besagt, dass dieser 3´Überhang sich zurückfaltet, eine lassoähnliche Struktur ausbildet und in weiter proximal gelegenen Abschnitten mit doppelsträngiger Telomersequenz inseriert (STANSEL et al., 2001; GRIFFITH et al., 1999).
2.4.2 Telomeren als molekularer Zähler von Zellteilungen
Eine besondere Rolle spielen die Telomeren im Zusammenhang mit dem Endreplikationsproblem (WATSON, 1972). Für die DNA-Replikation sind die DNA Polymerasen und sowie die Primase, ein Enzym, das den RNA-Primer synthetisiert, notwendig. Da der RNA-Primer am äußeren Telomerenende abgebaut wird, ohne in DNA umgeschrieben zu werden, kommt es bei jeder Replikation zu einer Telomerenverkürzung. Hayflick beschrieb 1961, dass es bei humanen Fibroblasten im Gegensatz zu Tumorzellen nur zu einer begrenzten Anzahl von Zellteilungen kommt (HAYFLICK und MOORHEAD, 1961). Später wurde postuliert, dass sich die Chromosomen bei jeder Zellteilung verkürzen (OLOVNIKOV, 1971) und dadurch eine „biologische Uhr“ des Alterns bzw. der erfolgten Zellteilungen darstellen. Im Zusammenhang mit zellulärer Seneszenz wurde die Telomeren- verkürzung als erster molekularer Mechanismus beschrieben (HARLEY et al., 1990).
Durch das Endreplikationsproblem kommt es in somatischen Zellen zu einer Verkürzung der Telomeren bei jeder Zellteilung, da die Primer an den Enden nicht mehr genau binden können (ALLSOPP et al., 1992; HARLEY et al., 1990). In somatischen Zellen kommt es zu einer Verkürzung der Telomeren um 50-100 bp bei jeder Zellteilung (MEYERSON et al., 1997). Nach einer bestimmten Anzahl von Zellteilungen kommt es zu einer kritischen Verkürzung der Telomeren. Die Zellen erreichen das Stadium der Seneszenz (Zellalterung) (LUNDBLAD, 1997; HARLEY et al., 1990). Dabei wird das Tumorsuppressor Protein p53 aktiviert, das die Zellteilung unterdrückt. Nur wenige kritisch verkürzte Telomeren pro Zellkern sind nötig, um zelluläre Seneszenz auszulösen (CAMPISI und D´ADDA DI FAGAGNA, 2007).
Wegen der kritischen Verkürzung der Telomeren ist die Teilungsfähigkeit primärer humaner Zellen in vitro auf etwa 60-80 Teilungen begrenzt (WRIGHT und SHAY, 1992). Die ausschlaggebende Rolle von Telomeren in Zellteilung und Alterung wird deutlich bei Patienten mit nur 50 % desTelomerase-Spiegels, die von einer Mutation einer oder mehrerer Telomerase-Gene herrühren. Dieses führt zu verschiedensten Erkrankungen, wie z.B. Knochenmarkserkrankungen (AUBERT und LANSDORP, 2008).
2.4.3 Telomerenverkürzung während des Alterns
Beim Menschen konnte in utero gezeigt werden, dass die Telomeren in verschiedenen fetalen Geweben gleich waren, während es zwischen verschiedenen Feten erhebliche Unterschiede gab (YOUNGREN et al., 1998). Einige genetische Krankheiten, wie z.B. das Werner Syndrom, führen zu einer beschleunigten Rate der Telomerenverkürzung und lösen somit eine frühzeitige Alterung aus (BLASCO, 2005). Die Lebensdauer somatischer Zellen ist durch die Verkürzung der Telomeren bei Fehlen von Telomerase-Aktivität beschränkt (ALLSOPP et al., 1992). Wenn es zu einer kritischen Verkürzung der Telomeren kommt, verlieren diese ihre Schutzfunktion; es kommt zur Seneszenz und die DNA-Schädigungssignalwege werden aktiviert (VAZIRI et al., 1993). Bei mitotisch inaktiven Organen, wie z.B. Herz und Gehirn, bleibt die Telomerenlänge während der Alterung relativ stabil, während mitotisch aktive Organe stark von der Telomerenverkürzung betroffen sind (TAKUBO et al., 2002). Bei Blutzellen scheint die Telomerenverkürzung postnatal nicht linear zu verlaufen. Es kommt während der ersten beiden Lebensjahre zu einer stärkeren Verkürzung (FRENCK, Jr. et al., 1998). Bei Frauen wurde ein Zusammenhang zwischen Telomerenlänge und altersabhängiger meiotischer Dysfunktion hergestellt.
Bei Mäusen mit verkürzten Telomeren zeigte sich der gleiche Phänotyp wie bei der reproduktiven Alterung der Frau (KEEFE et al., 2007).
2.4.4 Telomeren assoziierte-Krankheiten
Bei verschiedenen chronischen Erkrankungen mit erhöhtem Zellumsatz, wie z.B.
Leberzirrhose und unterschiedliche Formen der Anämie, kommt es zu einer beschleunigten Verkürzung der Telomeren (BRUMMENDORF et al., 2001). Beim Menschen treten Telomerenverkürzungen in der Seneszenz vor allem in hochproliferativen Geweben auf (ALLSOPP et al., 1995). Auch Stress wurde mit einer beschleunigten Telomerenverkürzung in Zusammenhang gebracht (EPEL et al., 2004).
Bei einer Reihe chronischer Humanerkrankungen wurde in verschiedenen betroffenen Organen eine starke Telomerenverkürzung nachgewiesen. Bei Patienten mit chronischen Lebererkrankungen (AIKATA et al., 2000) ließ sich dieses in den
Hepatozyten nachweisen, in den Endothelzellen bei Atheriosklerose (SAMANI et al., 2001) und bei unterschiedlichen Knochenmarkserkrankungen in den peripheren Blutzellen (BRUMMENDORF et al., 2001). Beim Werner Syndrom handelt es sich um eine autosomal rezessive Erkrankung, bei der vor allem mesodermales Gewebe betroffen ist. Die Erkrankung tritt in der Lebensmitte als massiv einsetzender Alterungsprozess auf. Im Vordergrund stehen außer vorzeitigem Altern, Symptome wie erhöhte genetische Instabilität und erhöhtes Tumorrisiko. Diese stehen in engem Zusammenhang mit verkürzten Telomeren (CHANG et al., 2004). Auch die Dysceratosis congenita ist eine Krankheit, die im Zusammenhang mit Funktionsstörungen der Telomeren steht. Hauptsymptome bei Patienten mit Dyskeratosis congenita sind Knochenmarksdefekte, Lungenfibrosen und das Auftreten von Krebs (LANSDORP, 2009). Bei der X-chromosomal gebundenen Form der Dyskeratosis congenita ist die niedrige TERC-Expression der limitierende Faktor für eine ausreichende Telomerase-Aktivität, was wiederum mit einer reduzierten Telomerenlänge verbunden ist (WONG und COLLINS, 2006). Auch bei der autosomal dominanten Form der Dysceratosis congenita wurden Mutationen von TERC gefunden (VULLIAMY et al., 2001). Schließlich wurden auch bei der aplastischen Anämie Mutationen der TERC Komponente gefunden (YAMAGUCHI et al., 2003).
2.4.5 Telomerenregulation bei Nachkommen aus somatischem Kerntransfer Da die Telomerlängen Einfluss auf Regeneration und Alterung haben, besteht ein mögliches Problem des Klonens in der Telomerenverkürzung, da für das Klonen Zellkerne somatischer Zellen verwendet werden, die i.d.R. kürzere Telomeren haben als Keimzellen (ALLSOPP et al., 1992; DE LANGE et al., 1990). Beim Schaf „Dolly“, das aus einer Euterepithelzelle geklont wurde, konnte eine Verkürzung der Telomeren im Vergleich zu altersgleichen Kontrollen festgestellt werden (SHIELS et al., 1999). Andere geklonte Tiere wie z.B. Rinder wiesen hingegen Telomeren gleicher Länge wie altersgleiche Kontrollen auf (SCHAETZLEIN et al., 2004). In einer Arbeit wurden bei der Verwendung seneszenter Donorzellen jedoch bei den resultierenden Klonrindern Verlängerungen der Telomeren im Bezug auf die
Ausgangszellen ermittelt (LANZA et. al, 2000). Die Telomerenlänge nach somatischem Klonen wurde bei einer vergleichenden Studie im Wesentlichen von der Art der verwendeten Spenderzelle beeinflusst. Klonnachkommen (Rind) aus fetalen Zellen, Muskelzellen oder Fibroblasten wiesen eine normale Telomerenlänge auf, während die Telomeren aus Epithelzellen im Vergleich zu altersgleichen Kontrolltieren verkürzt waren (MIYASHITA et al., 2002).
2.5 Telomeren-Regeneration durch die reverse Transkriptase Telomerase 2.5.1 Entdeckung der Telomerase
Die Telomerase ist in der Lage, Nukleotidsequenzen an den Enden der Telomeren anzufügen und damit die Telomerenlänge wieder aufzubauen. Die Telomerase wurde 1985 von Greider und Blackburn im Cilaten Tetrahymena erstmals beschrieben (BLACKBURN, 1991; GREIDER und BLACKBURN, 1985).
2.5.2 Aufbau des Telomerase-Enzyms
Die Telomerase ist ein Holoenzym, das aus zwei Untereinheiten besteht, dem katalytischen Protein der Telomerase Reverse Transkriptase (TERT) und der Telomerase-RNA-Komponente (TERC), die als Matrize für die Telomerensynthese dient (MEYERSON et al., 1997; NAKAMURA et al., 1997). Die Telomerase verlängert das 3´Ende der DNA direkt (Abb.6), wobei ihre RNA-Komponente als Matrize genutzt wird (NAKAMURA und CECH, 1998; COLLINS et al., 1995). Die Telomerase verlängert dann den Leitstrang in 5´-3´-Richtung in einer RNA- abhängigen DNA-Synthese (GREIDER und BLACKBURN, 1985). Nach der Verlängerung des 3´-Endes wird der Folgestrang mittels einer DNA-Polymerase vervollständigt. Es bleibt ein 3´-Überhang bestehen, der die sog. Haarnadelstruktur ausbildet (LIU et al., 2002).
Abb. 6: Verlängerung der Telomeren durch das Telomerase-Holoenzym
Telomerase vermittelte Telomerenverlängerung. 1. Telomerase bindet an das 3´OH Ende und . synthetisiert komplementär zur RNA-Matrize neue Telomersequenzen. 2. Die Telomerase dissoziiert, um am neu entstandenen Ende wieder zu binden und 3. den DNA-Strang erneut zu verlängern. Nach Abschluss der Verlängerung dissoziiert die Telomerase und die DNA-Polymerase synthetisiert den Folgestrang. TP1 und Dyskerin sind assoziierte Proteine. (Abb. aus GREIDER, 1996).
2.5.3 Zelltyp-spezifische Expression der Telomerase
In den meisten einzelligen Eukaryoten wird die Telomerase konstitutiv exprimiert. Bei Säugetieren hingegen ist die Aktivität der Telomerase streng reguliert (KIM et al., 1999; MEYERSON et al., 1997). Die Telomerase ist nur während der Embryogenese (WRIGHT et al., 1996), in Zellen der Keimbahn sowie in Stammzellen aktiv (HIYAMA und HIYAMA, 2007). Die meisten Krebszellen weisen ebenfalls Telomeraseaktivität auf (COUNTER et al., 1995; BLACKBURN, 1991). In den meisten somatischen Geweben kommt es postnatal zur Unterdrückung der Telomeraseaktivität (WRIGHT et al., 1996).
2.5.4 Telomeraseaktivität in der Embryogenese und in Keimzellen
Die Aktivtät der Telomerase in humanen Geweben ist streng reguliert. Die Expression ist auf Stamm- und Progenitorzellen sowie unreife Keimzellen beschränkt (KIM et al., 1999; WRIGHT et al., 1996). An Keimzellen konnte gezeigt werden, dass sie längere Telomeren als somatische Zellen haben. Es wird vermutet, dass eine Expression der Telomerase in Keimzellen eine Telomeren-Reserve für die nachfolgende Generation sicherstellen soll (ALLSOPP et al., 1992; DE LANGE et al., 1990).
Während der Embryonalentwicklung sind in der ungereiften Oozyte hohe Telomeraseaktivitäten vorhanden, die bei humanen Zygoten unter die Nachweisgrenze abfallen, um dann im Blastozystenstadium wieder anzusteigen (WRIGHT et al., 2001; XU und YANG, 2000). Eine Übersicht über die Telomeraseaktivität in der Ontogenese zeigt Abbildung 7.
Abb. 7: Übersicht der Telomeraseaktivität in der Ontogenese von der Fertilisierung bis zum Blastozystenstadium (BEKAERT et al., 2004)
In geklonten und parthenogenetisch erzeugten Embryonen wurde ein ähnliches Aktivitätsmuster nachgewiesen (XU und YANG, 2001). Dies zeigt, dass bereits in der frühen Emryonalentwicklung wesentliche Elemente der Telomerenregulation aktiv
sind. Bei Rind und Maus wurde ein Telomerenverlängerungsprogramm im Übergang vom Morula- zum Blastozystenstadium nachgewiesen. Dieses ist Telomerase- abhängig, da es in Telomerase-knock out Mäusen nicht nachzuweisen war (SCHAETZLEIN et al., 2004). Jedoch scheint es zwei Phasen der Telomerenverlängerung in der Embryonalentwicklung zu geben. Die erste Phase ist Telomerase-unabhängig und tritt direkt nach der Fertilisierung während des ersten Zellzyklus auf. Dieser Schritt der Telomeren-Verlängerung wird entweder über DNA Rekombination oder über ein „Alternative Lengthening of Telomeres“ (ALT) vermittelt (siehe 2.5.6) (LIU et al., 2007).
2.5.5 Telomeraseaktivität in Tumorzellen
Zelluläre Senezenz tritt auf, wenn die Telomeren kritisch verkürzt sind. Dieses Phänomen ist noch nicht vollständig aufgeklärt, aber Tumor-Suppressor-Gene und Zellzyklus Kontrollgene (p53 und RB/p16) sind sehr wahrscheinlich involviert (SHAY et al., 1991; HARA et al., 1991). Zellen brauchen etwa 4-6 Mutationen um malignant zu werden (CAIRNS, 1975). Die Telomeraseaktivität in Krebszellen korreliert mit einer Stabilisierung der Telomerenlänge und einer damit einhergehenden Immortalisierung (SHAY und BACCHETTI, 1997; KIM et al., 1994). In der Mehrheit der Tumorzellen ist Telomerase-Expression und -Aktivität nachweisbar (SHAY und BACCHETTI, 1997). Ein Screening der meisten humanen Krebsarten hat eine starke Assoziation zwischen der Telomeraseaktivität und dem Grad der Malignität der Krebszellen ergeben. 90 % aller Tumore weisen Telomerase-Expression auf. Die Telomerase ist deshalb zum gebräuchlichen Tumormarker geworden (SHAY und WRIGHT, 1996).
Die Telomerase ist aus diesem Grund ein primäres Ziel für die Forschung an Tumorarzneimitteln (SHAY und WRIGHT, 2006). Die Inhibierung der Telomerase führt zur Telomerenverkürzung und zum Zelltod der Tumorzelle (HAHN et al., 1999).
Mäuse, die die TERT-Komponente überexprimieren, sind anfälliger gegenüber chemischer Karzinogenese als ihre Wildtyp-Artgenossen (GONZALEZ-SUAREZ et al., 2001). Die Telomerase ist aber per se kein Onkogen (HARLEY, 2002).
2.5.6 Telomerase unabhängige Telomerenverlängerung
Die Telomerenverlängerung tritt in manchen humanen Zelllinien und Tumorzellen auch in Abwesenheit von Telomerase auf. Diese Zellen nutzen den Alternativen Mechanismus der Telomerenverlängerung: Alternative lengthening of Telomeres (ALT). Der molekulare Mechanismus von ALT ist noch nicht vollständig bekannt, es wird aber davon ausgegangen, dass er auf homologer Rekombination zwischen den Chromosomen beruht (HENSON et al., 2002). Charakteristisch für solche Zellen sind extrem heterogene Telomeren und das Auftreten von ALT assoziierten promyelocytic leukemia bodies (DUNHAM et al., 2000).
2.5.7 Phänotypen von über- bzw. unterexprimierten Telomerase-Genen
Das komplette Fehlen von Telomeraseaktivität wird bei der Maus über mehrere Generationen ohne pathologische Begleiterscheinungen toleriert. Beim Menschen jedoch führt eine reduzierte Telomeraseaktivität zu Knochenmarkserkrankungen, Lungenfibrose, Tumorbildung und anderen Krankheitsbildern (LANSDORP, 2009).
Die katalytische Untereinheit TERT wird nicht konstitutiv exprimiert und scheint der limitierende Faktor für die Erhaltung der Telomerenlänge zu sein. Bei verschiedenen Zelltypen wurde gezeigt, dass die Telomeraseaktivität mit der TERT-mRNA Expression korreliert (BLASCO et al., 1999). Die Transfektion von TERT in Telomerase-negativen Zellen führt zu einer verlängerten Proliferation der Zellen und zu verlängerten Telomeren ohne Transformation oder maligne Veränderung (YANG et al., 1999; BODNAR et al., 1998). In Fibroblasten, die aus Patienten mit dem Werner Syndrom gewonnen wurden, verhindert eine Expression der Telomerase ebenfalls die beschleunigte Zellalterung (WYLLIE et al., 2000). Bei Lymphozyten, die von Dysceratosis congenita Patienten gewonnen wurden, ist es allein mit exogenem TERC gelungen, das proliferative Potential, Telomeraseaktivität und die Telomerenlänge zu erhöhen (KIRWAN et al., 2008). Bei Zellen, die von Patienten mit der autosomal dominanten Form der Dysceratosis congenita gewonnen wurden, gab es die besten Resultate mit der Expression beider Komponenten (WESTIN et al., 2007). Die meisten somatischen Zellen exprimieren nur TERC, aber nicht TERT, so
dass TERT als limitierendem Faktor für die katalytische Aktivität der Telomerase fungiert (BODNAR et al., 1998). Deshalb verkürzt sich in den meisten somatischen Zellen die Telomerenlänge während der Proliferation.
Somatische Zellen aktivieren nur vorübergehend die Telomerase. Studien mit kultivierten Zellen haben gezeigt, dass die transiente Aktivierung der Telomerase durch ektopische Expression von TERT mit einer stark gesteigerten Proliferationsfähigkeit verbunden ist (STEINERT et al., 2000).
Bei der an das X-Chromosom gebundenen Form der Dyskeratosis congenita ist der Telomerase-RNA-Gehalt für die Telomeren-Instandsetzung der limitierende Faktor, weil ohne ein ausreichendes Angebot der RNA-Komponente die Telomerasefunktion herabgesetzt ist (WONG und COLLINS, 2006). Sowohl TERT als auch TERC sind essentiell für die Aufrechterhaltung und Verlängerung der Telomeren (CHIANG et al., 2004). Somit können sowohl TERT als auch TERC als funktionale Ziele für die Telomerasemodulation dienen.
2.5.7.1 Überexpression in somatischen Zellen und Keimzellen
Die Transfektion von TERT in Telomerase-negative Zellen führte zu verlängerten Telomeren und zu einer deutlich verlängerten Proliferation der transfizierten Zellen (BODNAR et al., 1998). Die ektopische Expression von hTERT induziert die Telomeraseaktivität wieder und verlängert damit die Lebensspanne zahlreicher Zelltypen (YANG et al., 1999).
In murinen embryonalen Stammzellen führt die Überexpression der Telomerase zu einer erhöhten Selbsterneuerung und Differenzierung. Die Proliferation ist verstärkt und die Resistenz gegenüber Apoptose ist erhöht. Desweiteren kommt es zu einem Wachstumsvorteil, erhöhter Stressresistenz und einer verbesserten Differenzierung in Richtung hämatopoetischer Zellen (ARMSTRONG et al., 2005).
Bovine microvasculäre Endothelzellen, die mit hTERT immortalisiert wurden, zeigten eine Proliferationsrate über 40-45 Passagen, während die Kontrollgruppe nicht mehr als 20-22 Passagen durchlief (BUSER et al., 2006). Die konstitutive Expression von TERT in Thymocyten führte zu einem erhöhten Auftreten von T-Zell Lymphomen (CANELA et al., 2004).
