humanes TERT (ein protein-kodierendes Gen) mittels zytoplasmatischer Plasmidinjektion in bovinen Zygoten exprimiert werden können. Der Nachweis der Transkipte erfolgte mittels spezies-spezischer Primer in der RT-PCR. Zusätzlich wurde eine tendenziell erhöhte Telomerase-Aktivität in behandelten Blastozysten gemessen. Die Expression sowohl von hTERC allein als auch die Expression des gesamten Holoenzyms führte zu einer signifikanten Verlängerung der Telomeren in den Blastozystenstadien. Die Expression des gesamten Enzyms zeigte keine weiter gesteigerte Verlängerung im Vergleich zur alleinigen Expression von hTERC. In beiden Gruppen konnte eine tendenzielle Erhöhung der Telomeraseaktivität nachgewiesen werden.
Während der frühen Embryonalentwicklung ist die Telomeraseaktivität streng reguliert. In der ungereiften Oozyte ist eine hohe Telomeraseaktivität vorhanden, die bei humanen Zygoten unter die Nachweisgrenze abfällt, um dann im Blastozystenstadium wieder anzusteigen (WRIGHT et al., 2001; XU und YANG, 2000). In der Embryonalentwicklung gibt es zwei unterschiedliche Mechanismen der Telomerenverlängerung. Die eine ist telomerase-unabhängig und tritt direkt nach der Fertilisierung während des ersten Zellzyklus auf. Diese Art der Telomeren-Verlängerung wird entweder über DNA-Rekombination oder über ein „Alternative Lengthening of Telomeres“ (ALT) vermittelt (LIU et al., 2007). Der andere Mechanismus wurde beim Rind und bei der Maus im Übergang vom Morula- zum Blastozystenstadium nachgewiesen. Dieses Telomeren-Verlängerungsprogramm ist Telomerase abhängig, da es bei Telomerase-knockout Mäusen nicht nachzuweisen war (SCHAETZLEIN et al., 2004).
Bei Mäusen wird das komplette Fehlen der Telomeraseaktivität über mehrere Generationen toleriert, ohne dass pathologische Begleiterscheinungen auftreten.
Beim Menschen ist eine reduzierte Telomeraseaktivität mit
Knochenmarks-erkrankungen, Lungenfibrose, Tumorbildung und anderen Krankheitsbildern verbunden (LANSDORP, 2009). Telomeren stehen im Zusammenhang mit Regeneration, Alterung und Tumorbildung (DJOJOSUBROTO et al., 2003). Wenn Telomeren kritisch verkürzt sind, kommt es zur Seneszenz und zum Zelltod (LUNDBLAD, 1997). Bei Telomerase knockout Mäusen wurde gezeigt, dass bei ihnen schon im Alter von 18 Monaten Defekte im Zusammenhang mit einer verfrühten Alterung auftreten (BLASCO et al., 1999). Verschiedene chronische Erkrankungen, die mit einem erhöhtem Zellumsatz einhergehen, wie z.B.
Leberzirrhose und unterschiedliche Formen der Anämie, stehen im Zusammenhang mit einer beschleunigten Verkürzung der Telomeren (BRUMMENDORF et al., 2001).
Beim Menschen treten Telomerenverkürzungen vor allem in hochproliferativen Geweben auf (ALLSOPP et al., 1995). Auch starker Stress kann zu einer beschleunigten Telomerenverkürzung führen (EPEL et al., 2004). Bei einer Reihe chronischer humaner Erkrankungen wurde in verschiedenen Organen eine Telomerenverkürzung nachgewiesen. Bei Patienten mit chronischen Lebererkrankungen ließ sich dies in den Hepatozyten nachweisen (AIKATA et al., 2000), bei Atheriosklerose in den Endothelzellen (SAMANI et al., 2001) und bei unterschiedlichen Knochenmarkserkrankungen in peripheren Blutzellen (BRUMMENDORF et al., 2001). Beim Werner Syndrom handelt es sich um eine autosomal rezessive Erkrankung. Dabei ist vor allem mesodermales Gewebe betroffen. Die Erkrankung tritt in der Lebensmitte als massiv einsetzender Alterungsprozess auf. Im Vordergrund stehen außer vorzeitigem Altern, Symptome wie erhöhte genetische Instabilität und erhöhtes Tumorrisiko. Diese Symptome stehen ebenfalls in engem Zusammenhang mit verkürzten Telomeren (CHANG et al., 2004). Kinder, die mit Progeria, einem vorzeitigen Alterungssyndrom, geboren werden, haben ebenfalls kürzere Telomeren (ALLSOPP et al., 1992). Im Zusammenhang mit Tumorbildung spielt die Telomerase eine wichtige Rolle. In 90 % der Tumorzellen ist eine erhöhte Telomerase-Expression und -Aktivität nachweisbar (SHAY und BACCHETTI, 1997). Ein Screening der meisten humanen Krebsarten hat eine starke Assoziation zwischen Telomeraseaktivität und dem Grad der Malignität
der Krebszellen ergeben. Die Telomerase ist deshalb zum gebräuchlichen Tumormarker geworden (SHAY und WRIGHT, 1996).
Die Transfektion von TERT in Telomerase-negativen Zellen stellt die Telomeraseaktivität wieder her und führt zu einer verlängerten Proliferation der Zellen. Die Wiederherstellung der Telomeraseaktivität wiederum ist mit verlängerten Telomeren, aber ohne Transformation oder maligne Veränderungen verbunden (YANG et al., 1999; BODNAR et al., 1998). Studien mit kultivierten Zellen haben gezeigt, dass die transiente Aktivierung der Telomerase durch ektopische Expression von TERT mit einer stark gesteigerten Proliferationsfähigkeit verbunden ist (STEINERT et al., 2000). In murinen embryonalen Stammzellen führt die Überexpression der Telomerase zu einer erhöhten Selbsterneuerung (Self Renewal) und Differenzierung. Die Proliferation ist verstärkt und die Resistenz gegenüber Apoptose ist erhöht. Die Zellen haben einen Wachstumsvorteil, zeigen erhöhte Stressresistenz und eine verbesserte Differenzierung in Richtung hämatopoetischer Zellen (ARMSTRONG et al., 2005). Bovine microvaskuläre Endothelzellen, die mit hTERT immortalisiert wurden, zeigten eine Proliferationsrate von 40-45 Passagen, während die Wildtyp-Kontrollgruppe nicht mehr als 20-22 Passagen durchlief (BUSER et al., 2006). Die Telomerase ist erforderlich für die verlangsamte Telomerenverkürzung und verlängert die replikative Spanne hämatopoetischer Stammzellen bei Serien-Transplantationen (ALLSOPP et al., 2003). Die ektopische Expression von hTERT kann die Telomeraseaktivität induzieren und damit die Lebensspanne zahlreicher Zelltypen verlängern (YANG et al., 1999).
In dieser Arbeit wurden die Auswirkungen der induzierten Expression der RNA Komponente zum einen und der gesamten humanen Telomerase zum anderen auf die Physiologie und Entwicklung boviner Embryonen untersucht. Außerdem wurden die Telomerenlänge sowie die Telomeraseaktivität in der Blastozyste untersucht.
Die Entwicklungsraten der injizierten Gruppen fielen im Vergleich zu den Kulturkontrollen, deutlich geringer aus. Solche Beobachtungen wurden auch in anderen Untersuchungen an mikroinjizierten Rinderzygoten gemacht (KRIMPENFORT et al., 1991). Für das Einstechen der Injektionspipette durch die Zona pellucida in das Zytoplasma wurde von Peura et al. kein schädigendender
Einfluss auf die Entwicklung gefunden (PEURA et al., 1994). Bei den Versuchen in dieser Arbeit wurde bei etwa 20 % der injizierten Zygoten eine Lyse direkt am Anschluss der Mikroinjektion beobachtet. Die verminderten Entwicklungsraten lassen sich daher z.T. durch injektionsbedingte Schädigungen der Zygoten erklären.
Denkbar sind zudem mögliche toxische Wirkungen der injizierten Fremd-DNA. Mit einer steigenden Fremd-DNA Konzentration gingen bei mikroinjizierten Mäusezygoten Furchungs- und Entwicklungsraten zurück (PAGE et al., 1995;
BRINSTER et al., 1985). Diese Auswirkungen der Mikroinjektion auf die Furchungs- und Entwicklungsraten wurde auch bei bovinen Embryonen beobachtet (GAGNĚ et al., 1997). In Bezug auf die Toxizität ist auch die Intensität der GFP-Expression, besonders in den stehengebliebenen Stadien zu erwähnen, die zumeist eine extrem starke Fluoreszenz aufwiesen. Hier ist davon auszugehen, dass eine sehr hohe Dosis der Plasmidlösung injiziert wurde, so dass es dadurch zu irreversiblen Schäden kam, die einen Entwicklungsstopp zur Folge hatten.
Über die zytoplasmatische Injektion können wesentlich bessere Expressionsraten als mit der Standardmethode, der Injektion in einen Vorkern, erreicht werden. So wurden in einer früheren Versuchsreihe nach Injektion eines linearen Oct4-GFP-Konstruktes in einen Vorkern von Rinderzygoten maximal 4 % Erfolg erzielt (KIRCHHOF et al., 2000), viele der erhaltenen Blastozysten wiesen zudem eine Mosaikexpression auf.
Nach zytoplasmatischer Injektion des gleichen Konstruktes in zirkulärer Form lag die Erfolgsrate bei 40-60 % (IQBAL et al., 2009), wobei die Hälfte der Embryonen eine homogene Expression in allen Zellen aufwies. Da die hier injizierten ccc-Plasmide zu einer transienten Expression führen und episomal persistieren, sich aber nicht replizieren, ist die Mosaikexpression sehr wahrscheinlich auf ungleichmäßige Segregation der Plasmide bei den Furchungsteilungen zurückzuführen.
Es wurde gezeigt, dass der Beginn der Expression der Plasmid-kodierten Gene durch eine in vitro-Methylierung von CG-Dinukleotiden gezielt auf bestimmte Entwicklungsstadien abgestimmt werden kann (IQBAL et al., 2009). Bei Injektion von methyliertem hTERT wurde eine Expression im Blastozystenstadium erreicht.
Vorangegangene Studien haben gezeigt, dass die katalytische Untereinheit TERT nur in Zellen der Keimbahn, frühen Blastomeren und einigen somatischen
Stammzellen exprimiert wird und damit als limitierender Faktor für die Telomeraseaktivität gilt, während TERC ubiquitär exprimiert wird und deshalb wenig Einfluss auf die Telomerase-Aktivität haben sollte (MEYERSON et al., 1997;
NAKAMURA et al., 1997). Bei verschiedenen Zelltypen wurde gezeigt, dass die Telomeraseaktivität mit der TERT-mRNA Expression korreliert (BLASCO et al., 1999). Die Transfektion von TERT in Telomerase-negativen Zellen führt zur verlängerten Proliferation der Zellen und zu verlängerten Telomeren ohne Transformation oder maligne Veränderungen (YANG et al., 1999; BODNAR et al., 1998; VAZIRI und BENCHIMOL, 1998).
Interessant ist, dass auch bei der Gruppe, die nur mit humanem TERC injiziert wurde, eine signifikante Verlängerung der Telomeren im Vergleich zur nicht injizierten Kulturkontrolle erreicht werden konnte. Es scheint, das bei bovinen Embryonen der TERC Level limitierend für die Aktivität der Telomerase ist. Die Fremd-DNA, die durch Mikroinjektion in die Zygote gebracht wurde, hatte per se keinen Einfluss auf die Telomerenlänge. Dies wurde mit der nur mit GFP injizierten Gruppe bewiesen, in der es zu keiner nachweisbaren Verlängerung der Telomeren kam. Es wurde schon in früheren Arbeiten gezeigt, dass sich mit spezies-fremden Telomer-Komponenten, eine vollständige Telomerasefunktion herstellen läßt. So wurde in Linsenepithelzellen vom Kaninchen die hTERT-Komponente exprimiert, sie führte zusammen mit dem endogenen TERC zur Telomeraseaktivität (XIANG et al., 2000). Es gibt aber auch Anzeichen, dass die TERC-RNA doch ein limitierender Faktor für die Telomerase-Aktivität ist. Sowohl TERT als auch TERC schienen essentiell für die Aufrechterhaltung und Verlängerung der Telomeren zu sein, aber die Anzahl der Genkopien und transkriptionelle Regulation von TERC war limitierend für die Telomeraseaktivität in vivo (CHIANG et al., 2004). Auch bei der X-Chromosomal gebundenen Form der Dyskeratosis congenita ist der Telomerase-RNA-Gehalt für die Telomeren Instandsetzung der limitierende Faktor, weil ohne ein ausreichendes Angebot der RNA-Komponente die Telomerasefunktion herabgesetzt ist (WONG und COLLINS, 2006). Also scheint die TERC Komponente in Rinderembryonen ebenfalls ein limitierender Faktor für die Telomeraseaktivität zu sein.
Die Injektion der beiden humanen Telomerase-Gene (hTERC mit hTERT) ergab eine signifikante Verlängerung der Telomeren in der Blastozyste. Die beiden Gruppen (nur hTERC injiziert gegenüber hTERC und hTERT injiziert) konnten statistisch nicht direkt miteinander verglichen werden. Offenbar ergibt sich aber durch die Ko-Injektion keine weitere Telomerenverlängerung. Beide Komponenten scheinen also im bovinen Embryo limitierend zu sein. Mit der Expression der einzelnen Telomerasekomponenten konnte sehr wahrscheinlich bereits eine Maximalkapazität erreicht werden, so dass die Expression der gesamten Telomerase keine weitere Verbesserung der Ergebnisse bringt.
In zahlreiche Studien, in denen TERT ektopisch exprimiert wurde, wurde bei Mäusen eine erhöhte Anfälligkeit gegenüber Tumoren und neoplastischen Veränderungen beobachtet (ARTANDI et al., 2002). Mäuse, die die TERT Komponente überexprimierten, waren anfälliger gegenüber chemischer Karzinogenese als ihre Wildtyp-Artgenossen (GONZALEZ-SUAREZ et al., 2001). Auch die konstitutive Expression von TERT in Thymocyten führte zu einem erhöhten Auftreten von T-Zell Lymphomen (CANELA et al., 2004). Ob und ggf. in welcher Form die Telomerase auch als Onkogen fungieren kann, ist noch nicht abschließend geklärt. Bei zahlreichen Untersuchungen kam es zu keiner tumorösen Entartung; bei manchen Untersuchungen wurde aber ein erhöhtes Auftreten von Tumoren beobachtet. Es gibt bislang keine eindeutigen Hinweise, dass die Telomerase durch Einfluss auf den Zellzyklus oder die invasiven Eigenschaften der Tumoren als Onkogen fungieren kann (HARLEY, 2002). Es scheint, dass in den meisten Fällen, in denen die Telomeraseaktivität wieder hergestellt oder erhöht wird, die Regelmechansimen in der Zelle noch funktionieren und sie sich deshalb normal teilen kann, ohne zu entarten. Die Telomerase scheint somit per se kein Onkogen zu sein (HARLEY, 2002).
Zusammenfassend ist festzuhalten, dass mit der hier beschriebenen Methodik zuverlässig Embryonen mit veränderten Telomerenlängen erzeugt werden konnten, die einen wichtigen Schritt zur Entwicklung eines Bos Taurus Modells für die Alterungsforschung darstellen.