Stimulation von M1-spezifischen T-Zellen mit Daudi M1-SC-Zellen

Für nachfolgende Versuche wurden PBMCs von Spendern verwendet, die eine Reaktivität aufwiesen, die mindestens oberhalb des cut-off-values lag. Die Stimulation M1-spezifischer Zellen erfolgte nach dem unter 3.2.4.8 beschriebenen Protokoll.

Abb. 20 und Abb. 21 zeigen Ergebnisse initialer Studien, bei denen PBMCs dreier Spender repetitiv mit Daudi M1-SC-Zellen stimuliert wurden. Die Frequenz M1-spezifischer Zellen wurde mittels Pentamer-Färbung (Abb. 20) bzw. intrazellulärer IFN-γ-Analyse (Abb. 21) bestimmt. Die in Abb. 20 dargestellten Ergebnisse zeigen die M1-Spezifität des Spenders 1907 nach dreiwöchiger Stimulation mit Daudi M1-SC-Zellen. 19,8 % aller gegateten Zel-len waren sowohl positiv für CD8 als auch für das M1-Pentamer. Unspezifische Bindungen von Zellen an das HLA-A2-Pentamer wurden durch eine Kontrollfärbung mit dem NY-ESO-Pentamer ausgeschlossen (Abb. 20; links).

0%

Abb. 20: Generierung M1-spezifischer T-Zellen mit Daudi M1-SC-Zellen; Pentamer-Färbung.

PBMCs des Spenders 1907 wurden mit Daudi M1-SC-Zellen in einem Verhältnis von 10:1 stimu-liert und die M1-Spezifität nach dreiwöchiger Inkubation mittels M1-Pentamer-Färbung bestimmt (rechts). Als Negativkontrolle wurde das NY-ESO-Pentamer eingesetzt (links). Gate: vitale Lym-phozyten.

In zwei weiteren Versuchen wurde ebenfalls eine dreiwöchige Stimulation mit aAPCs durchgeführt, die das M1-SC-Konstrukt an ihrer Oberfläche präsentierten. Sowohl in der gemischten Zellpopulation von Spender 1604 als auch von Spender 1570 konnten CD8⁺ Zellen detektiert werden, die nach sechsstündiger Stimulation mit M1-gekoppelten T2-Zellen IFN-γ sezernierten. Bei Spender 1604 lag der Prozentanteil M1-reaktiver CD8⁺ T-Zellen in der CD8⁺ Zellpopulation bei 4 % (3,3 % von 78,6 % CD8⁺ Zellen) (Abb. 21; oben rechts). Dieser Wert wurde von Spender 1570 deutlich übertroffen. So synthetisierten 66

% seiner CD8⁺ Zellen (33,5 % von 51 % CD8⁺ Zellen) IFN-γ nach Inkubation mit dem ent-sprechenden Peptid (Abb. 21; unten rechts). Eine Kontrollstimulation mit ungepulsten T2-Zellen erbrachte in beiden Fällen keine IFN-γ-positive Zellpopulation (Abb. 21; links).

T2 / (-)

Abb. 21: Stimulation M1-spezifischer T-Zellen mit Daudi M1-SC-Zellen; intrazellulärer Zytokin-Assay. PBMCs des Spenders 1604 (oben) bzw. 1570 (unten) wurden über drei Wochen mit Daudi M1-SC-Zellen inkubiert und der Prozentanteil IFN-γ-produzierender CD8⁺ T-Zellen mittels intrazellulärem Zytokin-Assay bestimmt. Zur Kontrolle wurden die Zellen mit unbeladenen T2-Zellen inkubiert (links). Dargestellt werden Dot Plots nach Ausschluss toter Zellen und Gate auf die Lymphozytenpopulation.

In nachfolgenden Experimenten wurde versucht, durch Veränderung der Kulturbedingun-gen eine möglichst optimale Stimulation M1-spezifischer T-Zellen zu erzielen. Hierzu wur-de zunächst das Verhältnis von PBMCs zu aAPCs ausgetestet. Zu Beginn wur-des Versuches wurden 2 x 10⁶ PBMCs zusammen mit Daudi M1-SC-Zellen in einem Verhältnis von 2:1, 5:1, 10:1, 25:1 und 50:1 ausplattiert. Zytokinzugabe (IL-2) und Restimulation erfolgten ge-mäß Protokoll (3.2.4.8). Die Auswertung wurde nach zweiwöchiger Inkubation durchge-führt. Aus Abb. 22 geht hervor, dass die Anzahl M1-reaktiver CD3⁺CD8⁺ T-Zellen ihr Ma-ximum bei einem Verhältnis von 10:1 erreichte. Insbesondere bei höheren PBMC:aAPC-Verhältnissen konnte keine weitere Erhöhung induziert werden. Auf Berechnung der Signi-fikanz wurde aufgrund zu geringer n-Zahlen verzichtet.

Um die Anzahl peptidspezifischer T-Zellen in der in vitro-Kultur zu steigern, wurde weiter-hin die Addition von Zytokinen ausgetestet. Hierzu wurde dem Medium TCGF, das aus

dem Überstand mitogenaktivierter Lymphozyten gewonnen wurde, in unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt. TCGF induzierte eine Proliferation und somit auch Expansion peptidspezifischer T-Zellen. Höhere TCGF-Konzentrationen (10-15 %) übten einen stärke-ren Einfluss aus als geringere Konzentrationen (1-5 %) (Daten nicht gezeigt).

0,0E+00

Abb. 22: Überprüfung des optimalen Verhältnisses von PBMCs zu aAPCs. PBMCs des Spen-ders 1813 wurden mit Daudi M1-SC-Zellen in unterschiedlichen Verhältnissen (2:1, 5:1, 10:1, 25:1 und 50:1) inkubiert und die Anzahl M1-spezifischer T-Zellen nach zweiwöchiger Inkubation mittels intrazellulärem IFN-γ-Assay bestimmt. Das Gate wurde auf die Lymphozytenpopulation, lebende Zellen und CD3⁺ T-Zellen gesetzt. Mittelwert ± SD aus n = 2.

Zusätzlich wurde überprüft, ob eine erhöhte Expression von kostimulatorischen Molekülen auf der Oberfläche von Daudi M1-SC-Zellen, ihre Eigenschaft, als antigenpräsentierende Zellen zu fungieren, verbessern kann. Hierzu wurden die aAPCs vor ihrer Verwendung mit LPS, IL-4 und CD40L stimuliert (4.3.2) und in einem Verhältnis von 1:10 zu PBMCs ge-sunder, HLA-A2-positiver Spender gegeben. Als Kontrolle wurden parallel PBMCs mit un-stimulierten Daudi M1-SC-Zellen inkubiert. Wöchentlich erfolgte eine Restimulation der Zellen mit aktivierten bzw. naiven Daudi M1-SC-Zellen.

Daudi M1-SC-Zellen, die aufgrund der Stimulation eine erhöhte Expression kostimulatori-scher Moleküle auf ihrer Oberfläche aufwiesen, induzierten eine signifikant höhere Anzahl

M1-spezifischer T-Zellen in der gemischten Kultur als naive Daudi M1-SC-Zellen (Abb.

23).

0,0E+00 7,0E+05 1,4E+06 2,1E+06

Daudi M1SC naive Daudi M1SC stim.

2,1x10⁶

1,4x10⁶

7,0x10⁵

++ Anzahl M1-spezifischer CD3CD8 T-Zellen 0

Daudi M1-SC (naiv)

Daudi M1-SC (stim.)

*

0,0E+00 7,0E+05 1,4E+06 2,1E+06

Daudi M1SC naive Daudi M1SC stim.

2,1x10⁶

1,4x10⁶

7,0x10⁵

++ Anzahl M1-spezifischer CD3CD8 T-Zellen 0

Daudi M1-SC (naiv)

Daudi M1-SC (stim.)

*

Abb. 23: Stimulatorische Kapazität aktivierter Daudi M1-SC-Zellen. Zur Hochregulierung der kostimulatorischen Moleküle CD80, CD83 und CD86 wurden Daudi M1-SC-Zellen mit CD40L-exprimierenden NIH/3T3-Zellen, LPS und IL-4 über 24 h stimuliert und anschließend zur Generie-rung M1-spezifischer T-Zellen aus PBMCs des Spenders 3050 eingesetzt (rechts). Eine Restimu-lation der Zellen erfolgte in wöchentlichen Abständen unter den gleichen Bedingungen. Als Kon-trolle dienten naive aAPCs (links). Die Analyse der Zellen erfolgte nach dreiwöchiger Inkubation mittels intrazellulärem IFN-γ-Assay. Dargestellt wird die Anzahl M1-spezifischer CD3⁺CD8⁺ T-Zellen nach dreiwöchiger Inkubation. Mittelwert ± SD aus n = 3. * p ≤ 0,05.

In nachfolgenden Versuchen wurde aufgrund der Ergebnisse der Vorexperimente die Ge-nerierung M1-spezifischer T-Zellen mit Hilfe von Daudi M1-SC-Zellen nach folgendem Schema durchgeführt: 2 x 10⁶ PBMCs wurden in einem Verhältnis von 10:1 zusammen mit stimulierten Daudi M1-SC-Zellen ausplattiert. Als Medium wurde humanes T-Zellmedium verwendet, dem TCGF in einer Konzentration von 10 % zugesetzt wurde. Zur Förderung der Proliferation erfolgte die Zugabe von IL-2. Die generierten Effektorzellen wurden in Folgeexperimenten auf Spezifität und Funktionalität überprüft und die stimulatorische Ka-pazität der aAPCs zudem mit der autologer MoDCs verglichen. Abb. 24 gibt einen Über-blick über die Stimulationsbedingungen sowie durchgeführten Analysemethoden.

Abb. 24: Generierung M1-spezifischer Effektorzellen mit Daudi M1-SC-Zellen. Schematische Darstellung der Stimulationsbedingungen sowie nachfolgend durchgeführter Experimente.

Die Generierung M1-spezifischer T-Zellen aus PBMCs gesunder bzw. krebskranker HLA-A2-positiver Spender mit Daudi M1-SC-Zellen erfolgte nach einem einheitlichen Schema. Die expan-dierten Zellen wurden mit Hilfe verschiedener Analysemethoden auf Spezifität und Funktionalität überprüft. Die Abbildung gibt einen Überblick über die in dieser Arbeit durchgeführten Experimen-te.

Abb. 25 zeigt das Beispiel eines Spenders, dessen PBMCs über mehrere Wochen zu-sammen mit Daudi M1-SC-Zellen in Kultur gehalten wurden. Die Spezifität der generierten Zellen wurde wöchentlich in einem intrazellulären IFN-γ-Assay überprüft. Es konnte ein deutlicher Anstieg des Prozentanteils M1-reaktiver CD3⁺CD8⁺ T-Zellen in der Gesamtkul-tur beobachtet werden.

PBMC

Stimulation mit Daudi M1-SC

- 2x10⁶ PBMCs + 2x10⁵ stimulierte aAPCs Kapazität von aAPCs mit

autolo-gen MoDCs

Testen der Spezifität und Funktionalität generierter M1-präsentierenden Targetzellen

- nach exogener Beladung m. M1-Peptid

(siehe 4.5.1 und 4.5.4.2)

(siehe 4.4.2.2, 4.5.4.1, 4.6 und 4.8)

Zytotoxizität

Proliferation Affinität

(siehe 4.5.3 und 4.5.4.3)

(siehe 4.5.3)

(siehe 4.5.2)

in vivo

(siehe 4.7)

0 %

Abb. 25: Langzeitstimulation von Zellen des Spenders 1798 mit Daudi M1-SC-Zellen. Zu 2 x 10⁶ PBMCs wurden initial 2 x 10⁵ Daudi M1-SC-Zellen gegeben. Die Inkubation erfolgte über einen Zeitraum von sieben Wochen. Wöchentlich erfolgte eine Restimulation der Zellen. Die M1-Spezifität wurde mittels intrazellulärer IFN-γ-Analyse nach drei (oben rechts), fünf (Mitte links), sechs (Mitte rechts) und sieben Wochen (unten) bestimmt. Oben links werden als Ausgangswert unstimulierte PBMCs dargestellt. Ein Beispiel einer Kontrollstimulation (T2-Zellen plus irrelevantes Peptid) ist unten rechts abgebildet. Gate: vitale Lymphozyten und CD3⁺ T-Zellen.

Der Anteil M1-spezifischer CD3⁺CD8⁺ T-Zellen in der CD8⁺ Zellpopulation betrug in der Ausgangspopulation 0,07 %. Nach drei Wochen lag er bei 23,3 % (3,4 % von 14,6 % CD3⁺CD8⁺ Zellen) und erhöhte sich auf 32,4 % (5,7 % von 17,6 % CD3⁺CD8⁺ Zellen) nach fünfwöchiger Stimulation. Nach sechs Wochen waren 78,3 % (14,8 % von 18,9 %) aller CD3⁺CD8⁺ T-Zellen spezifisch für M1 und eine Woche später stieg ihr Prozentanteil nochmals um 3 % an. Die totale Anzahl peptidspezifischer Zellen stieg innerhalb von drei Wochen von ca. 200 zu Beginn der Stimulation auf 7,1 x 10⁵. Sie erhöhte sich also unge-fähr um den Faktor 3500. Nach sieben Wochen waren von 5,2 x 10⁷ Zellen 35 %

spezi-fisch für M1. Das entspricht einer Anzahl von 1,8 x 10⁷ Zellen. Bezogen auf M1-reaktive Zellen betrug der Faktor der Vermehrung somit 90000.

Auch die Inkubation zweier weiterer Spender mit Daudi M1-SC-Zellen führte nach mehr-wöchiger Inkubation zu einem prozentualen Anstieg M1-spezifischer T-Zellen in der Kultur (Abb. 26A und B). Die Bestimmung der M1-Spezifität erfolgte mittels MHC-Pentamer-Färbung (3.2.5.1).

Der Prozentanteil peptidspezifischer CD8⁺ T-Zellen in der CD8⁺ Zellpopulation stieg inner-halb der ersten Woche bei Spender 1907 von 0 % auf 11,8 % (1,1 % von 9,3 % CD8⁺ Zel-len) an. Nach 2 Wochen waren 42,6 % (19,4 % von 45,5 % CD8⁺ Zellen) und nach 3 Wo-chen 59 % (43,7 % von 74,7 %) seiner CD8⁺ T-Zellen positiv für das M1-Peptid. Die An-zahl M1-spezifischer T-Zellen stieg in diesem Zeitraum auf 2,3 x 10⁶. Das entspricht einer Vermehrung der Zellen um den Faktor 2300.

Bei Spender 3050 war nach einwöchiger Stimulation ein Anstieg M1-spezifischer CD8⁺ T-Zellen von 0,2 % auf 34,9 % (9,5 % von 27,2 % CD8⁺ Zellen) detektierbar. Nach drei Wo-chen wiesen 64,8 % (25,9 % von 40 %) all seiner CD8⁺ T-Zellen M1-Reaktivität auf. Es konnte eine Vermehrung M1-spezifischer Zellen von 800 in der Ausgangspopulation auf 2,5 x 10⁷ festgestellt werden (Faktor von 31000).

M1-spezifische T-Zellen der Spender 1593, 1570 und 1813 konnten nach dreiwöchiger Stimulation um den Faktor 143, 360 bzw. 933 expandiert werden. Eine 450-fache Amplifi-kation wurde mit Zellen des Spenders 1619 nach zweiwöchiger Inkubation mit Daudi M1-SC-Zellen erreicht (Daten nicht gezeigt).

0%

Abb. 26: Pentamer-Färbung nach dreiwöchiger Stimulation von PBMCs zweier Spender mit Daudi M1-SC-Zellen. Zellen der Spender 1907 (A) und 3050 (B) wurden über einen Zeitraum von drei Wochen mit Daudi M1-SC-Zellen stimuliert und die M1-Spezifität nach ein- (A und B; oben rechts), zwei- (A; unten links) bzw. dreiwöchiger Inkubation (A und B; unten rechts bzw. links) be-stimmt. Zur Kontrolle erfolgte eine Färbung der Zellen mit dem NY-ESO-Pentamer (B; unten rechts). Gate: vitale Lymphozyten. Dargestellt wird ein repräsentatives Ergebnis von mehrfach durchgeführten Experimenten mit PBMCs unterschiedlicher Spender.