Expansion antigenspezifischer T-Zellen mit aAPCs

Die unter 2.4.2 beschriebene Verwendung autologer APCs ist jedoch mit einigen Nachtei-len verbunden. So können DCs nur in einem extrem kosten- und zeitintensiven sowie schwer zu standardisierenden Verfahren aus Vorläuferzellen hergestellt werden (OELKE et al., 2005b). Für ihre Generierung wird eine große Blutmenge benötigt, die bei schwer erkrankten Personen häufig nicht zur Verfügung steht. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass die Anzahl und Qualität der in vitro generierten DCs infolge vorangegangener Thera-pien mit Chemotherapeutika und Immunsuppressiva hoch variabel ist. Zudem konnte eine Beeinträchtigung der Funktionalität dieser Zellen allein aufgrund der Krebserkrankung festgestellt werden (GABRILOVICH, 2004; ORMANDY et al., 2006). Schließlich muss noch erwähnt werden, dass APCs permanent endogen prozessierte Proteine über MHC-Klasse-I-Moleküle an ihrer Oberfläche präsentieren. Dies birgt die Gefahr, dass nicht nur T-Zellen mit der gewünschten Spezifität, sondern auch autoreaktive CTLs in vitro generiert werden (OELKE et al., 2005b).

Für eine Expansion autologer, antigenspezifischer T-Zellen im klinischen Maßstab sind DCs aus den oben genannten Gründen nur eingeschränkt nutzbar. Als Alternative wurden so genannte künstliche antigenpräsentierende Zellen (aAPCs) entwickelt. Sie sollen die Eigenschaften der DCs bzgl. Antigenprozessierung und -präsentation möglichst gut imitie-ren, um eine hohe Anzahl funktionsfähiger T-Zellen innerhalb kürzester Zeit zu generieren.

Im Gegensatz zu autologen DCs sollte ihre Herstellung und Anwendung kostengünstig, reproduzierbar und anpassungsfähig sein. Optimal wären „ready-to-use“ aAPCs, die bei

jedem Patienten eingesetzt werden können und zu einer selektiven Expansion spezifi-scher und therapeutisch potenter T-Zellen führen (KIM et al., 2004). Weiterhin wäre von Vorteil, wenn sie die für den klinischen Einsatz erforderlichen GMP-Richtlinien (good ma-nufacturing practices) erfüllen würden.

Mit aAPCs können T-Zellen einerseits antigenunspezifisch expandiert werden. So wurden Antikörper-beladene Beads oder transfizierte K562-Zellen für die Vermehrung von CD4⁺ bzw. CD8⁺ T-Zellen in vitro eingesetzt (2.4.1). Andererseits kann durch gezielte Modifikati-on der Substrate ebenfalls eine antigenspezifische ExpansiModifikati-on vModifikati-on Effektorzellen erreicht werden. Je nach verwendetem System können zellbasierte von azellulären aAPCs unter-schieden werden. Zelluläre Techniken wurden auf der Basis von Insektenzellen, Maus-fibroblasten und humanen leukämischen Zelllinien (K562-Zellen) entwickelt.

Ausgehend von der von SUN et al. (1996) abstammenden Idee, Insektenzellen als aAPCs zu verwenden, transfizierten MITCHELL et al. (2002) eine aus dem Insekt Drosophila me-lanogaster abstammende Zelllinie mit den Molekülen CD80, ICAM-1 und HLA-A2 und überprüften deren Funktionalität nach exogener Beladung mit dem Tumorantigen Tyrosi-nase. Sie konnten eine Expansion antigenspezifischer CTLs beobachten, die jedoch ab-hängig von der Anwesenheit zusätzlicher, autologer PBMCs war. Mausfibroblasten konn-ten ebenfalls in pokonn-tente aAPCs umgewandelt werden, indem sie mit den drei kostimulato-rischen Molekülen CD80, ICAM-1 und LFA-3 transduziert wurden. Die Expression von vi-ralen Peptiden (Influenza Matrixprotein) oder Tumorantigenen (MART-1, gp100) erfolgte nach intrazellulärer Beladung über HLA-A2-Moleküle (LATOUCHE und SADELAIN, 2000).

Die Mausfibroblasten waren außerdem in der Lage, Proteine, wie z.B. das CMV-Protein pp65, intrazellulär zu prozessieren und an ihrer Oberfläche über HLA-A2 zu präsentieren.

Mit diesen aAPCs konnte eine rapide Expansion CMV-spezifischer T-Zellen erzielt werden (PAPANICOLAOU et al., 2003).

Ausgehend von der Idee, synthetische Oberflächen mit bestimmten Molekülen zu beladen und anschließend als künstliche APCs einzusetzen (GOLDSTEIN und MESCHER, 1986), wurden verschiedene, azelluläre Technologien entwickelt, um T-Zellen in vitro zur Expan-sion anzuregen. Unter anderem handelt es sich hierbei um Beads, Vesikel und Exosomen.

Eine Bead-basierte Methode wurde von THAM et al. (2001) veröffentlicht. Sie koppelten die kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 zusammen mit einem murinen

MHC-Klasse-I-single chain-Konstrukt an die Oberfläche von Latex-Mikrosphären. Nach Bindung des Peptids Ovalbumin (OVA) wurde in einem transgenen Mausmodell gezeigt, dass die-se aAPCs in der Lage sind, OVA-spezifische T-Zellen zu stimulieren.

Die von OELKE et al. (2003) entwickelten aAPCs wiesen als Grundgerüst magnetische Partikel auf, an die, neben Anti-CD28-Antikörpern, MHC-Klasse-I-Immunglobulin-Fusions-Moleküle (HLA-A2-Ig) gebunden wurden. Mit diesen Partikeln war es möglich, nach exter-ner Beladung mit Peptiden, CD8⁺ T-Zellen zu amplifizieren. Die generierten CTLs wiesen eine hohe Spezifität gegenüber den klinisch relevanten Peptiden CMVpp65 und MART-1 auf. Verglichen mit Anti-CD3 / Anti-CD28-beladenen Beads, die in der Lage waren, zuvor isolierte, antigenspezifische CTLs zu expandieren, besaßen diese peptidbeladenen Beads eine größere stimulatorische Kapazität (OELKE et al., 2005b).

WALTER et al. (2003) koppelten rekombinante MHC-Moleküle zusammen mit Anti-CD28-Ig biochemisch an Mikrosphären und konnten durch genaue Kontrolle der MHC-Dichte antigenspezifische CTLs mit unterschiedlich hoher Avidität erzeugen.

Die Idee, Liposomen oder Exosomen als aAPCs zu benutzen, geht auf die Beobachtung zurück, dass eine flexible biologische Zellmembran für die Ausbildung einer immunologi-schen Synapse essentiell ist (KIM et al., 2004). PRAKKEN et al. (2000) integrierten MHC-Klasse-II-Moleküle in aus Cholesterol und Phospholipiden bestehende Liposome. Durch Bindung relevanter Peptide konnten antigenspezifische, murine CD4⁺ T-Zellen zur Prolife-ration angeregt werden.

Exosomen sind von Zellen abstammende Vesikel, die nach der Fusion von Endosomen mit der Zellmembran freigesetzt werden. Je nach Ursprungszelle können sie MHC-Klasse-I- und / oder -Klasse-IMHC-Klasse-I- sowie kostimulatorische Moleküle enthalten. Eine Stimulation von T-Zellen durch exogene Beladung aufgereinigter Exosomen mit Peptiden konnte gezeigt werden (HWANG et al., 2003; CHAPUT et al., 2005).

Mittels aAPCs generierte T-Zellen wurden bereits in einigen klinischen Studien eingesetzt (KIM et al., 2004).