Allgemeine molekularbiologische Methoden

3.2.1.1 Kultivierung und Konservierung von E. coli -Stämmen

Die Anzucht von E. coli-Stämmen erfolgte bei 37 °C in LB-Medium, dem bei p lasmidtra-genden Stämmen das entsprechende Antibiotikum zugesetzt wurde. Vorkulturen wurden mit Einzelkolonien von LB-Agar-Platten angeimpft. Zur dauerhaften Konservierung von Bakterienstämmen wurden 350 µl einer stationären Übernachtkultur mit 650 µl Glycerin (99 %) versetzt und bei - 80 °C aufbewahrt.

3.2.1.2 Transformation von E. coli mit Plasmid-DNA

Die Transformation von E. coli mit Plasmid-DNA erfolgte mit Hilfe der Calcium-Chlorid-Methode. Hierbei werden E. coli-Keime chemisch kompetent gemacht, indem sie unter definierten Bedingungen mit Calciumchlorid versetzt werden. Dadurch wird die Membran der Zellen nach Einwirkung von Hitze für eine kurze Zeit permeabel und die gewünschte Plasmid-DNA kann in die Bakterien penetrieren.

Es wurden jeweils 100 µl kompetente Zellen (3.1.5.1) mit der zu transformierenden Plas-mid-DNA versetzt (2 µl eines 10 µl Ligationsansatzes). Das Gemisch wurde nach 30-minütiger Inkubation auf Eis einem Hitzeschock unterzogen. Hierzu wurde es für 30 Se-kunden in ein 42 °C warmes Wasserbad verbracht. Nach Zug abe von 250 µl S.O.C.-Medium wurden die Bakterien bei 37 °C und 225 rpm fü r eine Stunde geschüttelt und an-schließend je 150 µl der Suspension auf einer LB-Agar-Platte ausplattiert, die das ent-sprechende Antibiotikum enthielt. Die Inkubation erfolgte über Nacht bei 37 °C.

Ange-wachsene Kolonien wurden am folgenden Tag gepickt und in je 2 ml LB-Medium zzgl. An-tibiotikum transferiert. Nach Übernachtkultur (37 °C, 2 25 rpm) wurde die Plasmid-DNA iso-liert (3.2.1.3).

3.2.1.3 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli

Um qualitativ besonders hochwertige Plasmid-DNA zu gewinnen, wurden Plasmide mit hoher Kopienzahl mit Hilfe des „QIAprep Miniprep Kit“ isoliert. Dieses Verfahren beruht auf der Methode der alkalischen Lyse mit einer sich anschließenden Adsorption der DNA an die Silikagelmembran einer Minisäule unter Hochsalzbedingungen. Die nachfolgende Elu-tion der DNA erfolgte unter Niedrigsalzbedingungen.

Für eine Standardplasmidisolierung wurden von 2 ml einer bei 37 °C über Nacht gewach-senen Kultur von E. coli 1,5 ml abgenommen und für 1 min bei 800 g abzentrifugiert. Die anschließende Plasmidisolierung erfolgte nach Angaben des QIAgen-Protokolls. Die iso-lierte Plasmid-DNA konnte direkt zur Spaltung durch Restriktionsendonukleasen einge-setzt werden (3.2.1.5).

Zur Isolierung von Plasmid-DNA im größeren Maßstab wurde der „QIAgen Plasmid Midi“

bzw. „Maxi Kit“ verwendet. Hierbei wurden aus einer 2 ml Vorkultur je nach Trübung 0,2 bis 1,0 ml Bakteriensuspension entnommen und für eine Übernachtkultur mit 50 bis 100 ml LB-Medium zzgl. Antibiotikum vermischt. Die Inkubation erfolgte bei 37 °C und 225 rpm auf einem Schüttler. Die DNA wurde am nächsten Tag entsprechend Herstellerprotokoll isoliert.

3.2.1.4 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von Nukleinsäuren

Das Absorptionsspektrum von doppel- und einzelsträngigen Nukleinsäuren hat sein Maxi-mum bei einer Wellenlänge von 260 nm. Zur Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäu-ren wurde deshalb deNukleinsäu-ren Extinktion (Optische Dichte, OD) mittels Spektralphotometer bei 260 nm in Quarzküvetten bestimmt und wie folgt errechnet:

Konzentration (dsDNA) [mg / ml] = OD₂₆₀ (dsDNA) x 50 x Verdünnung Konzentration (dsDNA) [mg / ml] = OD₂₆₀ (dsDNA) x 50 x Verdünnung

Verunreinigungen in Nukleinsäurepräparationen stellen neben den Fällungsreagenzien vornehmlich zelluläre Proteine dar. Da das Absorptionsmaximum von Proteinen bei einer

Wellenlänge von 280 nm liegt, ergibt sich aus dem Quotienten der Extinktionen bei λ =

260 nm und λ = 280 nm ein Parameter für die Reinheit der Nukleinsäurelösung. Üblicher-weise liegt der OD260 / OD280-Quotient für DNA-Präparationen bei 1,78.

3.2.1.5 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen

Im Restriktionsverdau werden Enzyme eingesetzt, die als Restriktionsendonukleasen be-zeichnet werden. Sie schneiden einen DNA-Abschnitt sequenzspezifisch an festgelegten Schnittstellen und produzieren hierdurch DNA-Fragmente definierter Länge.

Restriktionsanalysen wurden in einem Gesamtvolumen von 10 bis 20 µl durchgeführt. Für den analytischen Verdau wurden standardmäßig 0,2-1 µg Plasmid-DNA eingesetzt. Für DNA-Spaltungen im präparativen Maßstab wurden DNA-Mengen von 1-2 µg verwendet.

Dem Ansatz wurden 0,5-1,0 µl der entsprechenden Restriktionsendonukleasen sowie 1 bis 2 µl des vom Hersteller mitgelieferten 10-fach konzentrierten Reaktionspuffers zugesetzt.

Sofern vorgeschrieben wurde zusätzlich BSA (1-2 µl der 10-fach konzentrierten Lösung) zugegeben. Anschließend erfolgte eine mindestens 90-minütige Inkubation bei 37 °C im Wasserbad. Nach dem Verdau wurde die DNA auf einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt (3.2.1.6).

3.2.1.6 Gelelektrophorese von DNA

Zur elektrophoretischen Auftrennung von DNA mittels horizontaler Gelelektrophorese wur-den je nach Größe der erwarteten DNA-Bande 1-2 %-ige Agarosegele in TAE-Puffer ver-wendet. Nach Erhitzung wurde der Lösung 1 %-iges Ethidiumbromid (0,5 µl / 10 ml) zuge-setzt. Ethidiumbromid interkaliert mit der DNA, so dass nach Auftrennung der DNA im elektrischen Feld eine Betrachtung unter dem UV-Licht (UV-Transilluminator) möglich wird. Zur Probenvorbereitung wurde die DNA mit 1 / 10 ihres Volumens Auftragspuffer versetzt und anschließend auf einem Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei einer konstanten Spannung von 80-90 Volt durchgeführt. Mit Hilfe von Molekulargewichtsmar-kern (3.1.3) konnte die Größe der DNA-Fragmente ermittelt werden.

3.2.1.7 Isolierung und Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen

Nach elektrophoretischer Auftrennung von DNA-Fragmenten auf einem 1-2 %-igem Aga-rosegel wurde die gewünschte Bande unter UV-Licht ausgeschnitten und mit Hilfe des

„QIAquick Gel Extractionkit“ nach Protokoll des Herstellers aufgereinigt.

3.2.1.8 Ethanol-DNA-Präzipitation

Die Ethanol-Präzipitation wurde durchgeführt, um eine Konzentrierung extrahierter und aufgereinigter DNA zu erreichen. Hierzu wurden zwei Volumen Ethanol (99 %) sowie 0,8 mol / l LiCl bzw. 0,2 mol / l NaCl zur Probe gegeben. Zusätzlich wurden zum Ansatz 1-2 µl Glycogen pipettiert. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei -20 °C und anschließender Zentrifugation (10 min, 4 °C) wurde das Präzipitat m it Ethanol (70 % v / v in H2O) gewa-schen, bei Raumtemperatur getrocknet und in 5 µl H2O aufgenommen.

3.2.1.9 Ligation von DNA-Fragmenten

Nach Darstellung der Vektor- und Insert-DNA auf einem Agarosegel wurde mit Hilfe des λ−DNA / Hind III-Fragment-Leiters ihre ungefähre DNA-Konzentration abgeschätzt. Zur Kalkulation der für die Ligation benötigten Menge an Vektor- und Insert-DNA wurde nach-folgende Formel verwendet:

Masse_Insert[ng] = 5 x Masse_Vektor[ng] x Länge_Fragment[bp] / Länge_Vektor[bp]

Masse_Insert[ng] = 5 x Masse_Vektor[ng] x Länge_Fragment[bp] / Länge_Vektor[bp]

Bei einer standardmäßig eingesetzten Menge von 25 ng Vektor lautet die Formel:

Masse_Insert[ng] = 125 [ng] x Länge_Fragment[bp] / Länge_Vektor[bp]

Masse_Insert[ng] = 125 [ng] x Länge_Fragment[bp] / Länge_Vektor[bp]

Ligationen wurden in einem Gesamtvolumen von 10 µl durchgeführt. Initial wurden Vektor und Insert zusammen mit Wasser über einen Zeitraum von 5 min auf 45 °C erhitzt. An-schließend erfolgte die Zugabe von einer Einheit T4-DNA-Ligase sowie von 1 µl des vom Hersteller mitgelieferten Ligasepuffers (10-fach konzentriert). Die Inkubation des Ligation-sansatzes erfolgte bei 16 °C über Nacht. Für die anschli eßende Transformation von E. coli wurden 2 µl des Ligationsansatzes eingesetzt.

3.2.1.10 Sequenzierung von Plasmid-DNA

Die Bestimmung der Basenabfolge von Plasmid-DNA erfolgte gemäß der Kettenabbruch-

methode nach SANGER. Sie wurde bei der Firma GATC in Auftrag gegeben.

3.2.1.11 PCR

Die in vitro-Amplifikation von DNA mit Hilfe der PCR nach MULLIS (MULLIS et al., 1986) wurde mit der Taq-Polymerase durchgeführt. Als Matrize diente Plasmid-DNA (3.1.8) oder isolierte DNA. Die verwendeten Primer wurden in Abschnitt 3.1.10 aufgelistet. Sie variier-ten in ihrer Länge zwischen 29 und 46 Basen. Für die Amplifikation eines spezifischen DNA-Abschnittes wurden die beiden Primer, die diesen Bereich einschlossen, möglichst so gewählt, dass sie annähernd gleiche Hybridschmelzpunkte aufwiesen. Der Schmelz-punkt wurde mit Hilfe eines Programms von Promega.com / Biotech ermittelt. Die PCR wurde in einem Thermocycler mit beheiztem Deckel durchgeführt. Der Reaktionsansatz setzte sich standardmäßig folgendermaßen zusammen:

MgCl (1,5 mmol / l), dNTP-Mix (0,8 mmol / l), Primer A (0,4 mmol / l), Primer B (0,4 mmol / l), cDNA (0,4 ng), Taq-Polymerase (0,125 µl) und H2Obidest. ad 25 µl.

Als Negativkontrolle diente ein PCR-Ansatz, dem keine Template-DNA (cDNA) zugefügt wurde. Die Komponenten wurden auf Eis in ein Eppendorfgefäß (0,5 ml) pipettiert. Die PCR wurde in 31 Zyklen durchgeführt. Für die Herstellung der Konstrukte Influenza M1 pEGFP und Peptid-SC pEGFP wurden verschiedene PCR-Programme benötigt (Tabelle 9).

Tabelle 9: PCR-Programme zur Herstellung von Influenza M1 pEGFP und Peptid-SC pEGFP

Influenza M1 pEGFP Peptid-SC pEGFP

1. Denaturierung (95 °C, 5 min) 1. Denaturierung (9 4°C, 1 min 30) 2. Denaturierung (95 °C, 1 min) 2. Denaturierung (9 2 °C, 30 sec)

3. Anlagerung der Primer (60 °C, 30 sec) 3. Anlagerun g der Primer (65 °C, 30 sec) 4. Polymerisation (74 °C, 30 sec) 4. Polymerisation (74 °C, 1 min 30)

Schritt 4 an Schritt 2 (30 Zyklen) Schritt 4 an Schritt 2 (30 Zyklen) 5. Endsynthese (16 °C, 7 min 30) 5. Endsynthese (16 ° C, 10 min)

6. Pause (16 °C) 6. Pause (16 °C)

Die Anlagerungstemperatur der Primer war abhängig von ihrer jeweiligen Schmelztempe-ratur. Im Regelfall lag sie 2-5 °C unterhalb der Schm elztemperatur des Primers mit der niedrigeren Schmelztemperatur. Nach Abschluss der PCR wurde der Ansatz auf Eis gehalten. Ein Aliquot von 5 µl wurde elektrophoretisch aufgetrennt (3.2.1.6), um die Ampli-fikation zu überprüfen. Wies die amplifizierte DNA die korrekte Größe auf, wurde sie an-schließend nach präparativer Elektrophorese aus dem Gel isoliert (3.2.1.7). Eine andere Möglichkeit bestand in der Aufreinigung der Probe mittels „PCR-Purification Kit“. Bei Ver-wendung der amplifizierten DNA als Template für einen nächsten PCR-Schritt wurde auf eine Extraktion verzichtet und direkt ein Aliquot von 0,5-2,0 µl aus der Probe entnommen.

3.2.1.12 Aufreinigung von PCR-Produkten

Das „QIAquick PCR Purification Kit“ dient der direkten Aufreinigung von doppel- oder ein-zelsträngigen PCR-Produkten, die eine Größe von 100 bp - 10 kb aufweisen. Das Proto-koll wurde entsprechend Herstellerangaben durchgeführt.