Klonierung von Peptid-SC pEGFP-Konstrukten

In dieser Arbeit wurden die beiden Peptid-SC-Konstrukte AFP-SC pEGFP und NY-ESO-SC pEGFP hergestellt. Sie unterscheiden sich anhand der Peptid-Sequenz, die am 3´-Ende über einen Aminosäure-Linker kovalent mit dem β2m des von GRETEN et al. (2002) etablierten, β2-Mikroglobulin-MHC-single-chain (SC)-Konstruktes verbunden ist (Abb. 1).

Zur Herstellung der beiden Peptid-SC-Konstrukte musste zunächst die DNA-Sequenz des tumorassoziierten Antigens AFP bzw. NY-ESO-1 in das rekombinante MHC-Klasse-I-Molekül integriert werden. Eine anschließende Ligation des erhaltenen DNA-Abschnitts mit dem Vektor pEGFP-N3 führte zur Entstehung eines Fusionsproteins aus Peptid-SC und EGFP (Abb. 3).

TM Cyto EGFP

(2002) etablierten, rekombinanten Peptid-SC-Konstruktes wird vergleichend mit dem in dieser Ar-beit konstruierten Peptid-SC pEGFP dargestellt (A;B). Durch eine 4-Step-PCR und anschließende Klonierung in den Vektor pEGFP wurde ein Peptid-SC-EGFP-Fusionsprotein mit ausgetauschter Peptidsequenz (AFP bzw. NY-ESO-1) und an die zytoplasmatische Domäne angehängtem EGFP hergestellt (B). Schematische Darstellung der DNA-Sequenz des Peptid-SC pEGFP-Konstruktes.

Zwischen dem 3`-Ende der zytoplasmatischen Domäne und dem 5´-Ende des EGFP befindet sich ein mutiertes Stopp-Kodon (C). β2m: β2-Mikroglobulin; S1 bzw. S2: AS-Linker; TM: transmembra-näre Region; Cyto: zytoplasmatische Domäne; EGFP: grünfluoreszierendes Protein.

Der erste Schritt der Klonierung beinhaltete die Durchführung einer 4-Step-PCR, die es ermöglicht, jedes beliebige MHC-Klasse-I-restringierte Peptid in das Peptid-SC-Konstrukt einzubauen. Hierfür mussten zunächst die DNA-Sequenzen der beiden Primer Oligo A und Oligo B bestimmt werden. Dies erfolgte mit Hilfe des in Abb. 4 dargestellten Schemas.

Die grau unterlegte Region stellt die DNA-Sequenz des Peptids dar, die dem 3´-Ende des β2m-Signalpeptids angehängt ist. Durch Austausch der Basenabfolge wurde sie dem ent-sprechenden Peptid angepasst und die Primer komplementär zu der dargestellten DNA-Sequenz konstruiert. Die Primer TG2, TG10 und Oligo 4 (3.1.10) konnten sowohl zur Her-stellung von AFP-SC pEGFP als auch von NY-ESO-SC pEGFP verwendet werden. In Primer TG10 wurde die Restriktionsschnittstelle Mlu I integriert.

ββββ₂m-Signal

Peptid-Sequenz Oligo A

Oligo B

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Peptid-Sequenz Oligo A

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Abb. 4: Schema zur Herstellung der Primer für die Klonierung von Peptid-SC-Konstrukten.

Durch Einfügen der Basenabfolge des gewünschten Peptids (grau unterlegte Region) können die DNA-Sequenzen von Primer Oligo A (rot) und Oligo B (blau) abgelesen werden.

Für den ersten PCR-Schritt wurde als Template der Vektor Tax-SC pCR II (3.1.8) einge-setzt. Durch Bindung der Primer TG10 und Oligo A an das 5´- bzw. 3´-Ende des β2 m-Signalpeptids konnte seine Gensequenz amplifiziert werden. Aufgrund des DNA-Überhangs am 5´-Ende des Oligo A-Primers wurde dem ersten PCR-Produkt außerdem der Anfangsabschnitt der gewünschten Peptid-Sequenz angehängt (Abb. 5A).

Im zweiten PCR-Schritt wurde das PCR-Produkt 1 als Template verwendet. Durch Zugabe von Primer TG10 und Oligo B wurde das Amplifikat um den am 5´-Ende des Oligo B-Primers befindlichen DNA-Abschnitt verlängert (Abb. 5B).

Die dritte PCR diente der Amplifikation des 3`-Endes des β2m-Genabschnitts (Abb. 5C).

Hierfür wurde erneut der Vektor Tax-SC pCR II als Template verwendet, an den sich die Primer Oligo 4 und TG2 anlagern konnten. Im letzten PCR-Schritt erfolgte die Synthese und Vervielfachung des Endproduktes, das sich aus dem β2m-Signal-Genabschnitt, der gewünschten Peptid-Sequenz und dem Anfangsbereich des humanen β2m zusammen-setzte. Hierfür wurden die Primer TG10 und TG2 zusammen mit den PCR-Produkten aus der zweiten und dritten PCR als Template eingesetzt (Abb. 5D).

Abb. 5: Schematische Darstellung der 4-Step-PCR. Anlagerung der Primer TG10 und Oligo A an die DNA-Sequenz des β2m-Signalpeptids (A). Durch Primer Oligo A wird der amplifizierten Se-quenz am 3`-Ende der erste Abschnitt des gewünschten Peptids angehängt (grau untermalte Re-gion). Darstellung des zweiten PCR-Schritts (B). Primer TG10 und Oligo B sorgen für eine Amplifi-kation des β2m-Signalpeptids, an dessen 3`-Ende sich die komplette Sequenz des gewünschten Peptids befindet. Amplifikation der β2m-Region durch die beiden Primer Oligo 4 und TG2 (C).

Durch den Einsatz von PCR-Produkt 2 und 3 als Template sowie TG10 und TG2 als Primer im vierten PCR-Schritt kommt es zur Amplifikation des gewünschten PCR-Endproduktes (D).

Zur Überprüfung der Zwischenprodukte erfolgte nach jedem PCR-Schritt der Auftrag von 5 µl der amplifizierten DNA auf ein Elektrophoresegel. Entsprach die Größe der DNA-Bande der Größe des jeweils erwarteten PCR-Produktes, wurde ein 0,5-2,0 µl großes Aliquot aus der PCR-Probe entnommen und direkt als Template für den nächsten PCR-Schritt einge-setzt. Das PCR-Endprodukt wurde nach elektrophoretischer Auftrennung aus dem Gel herausgeschnitten, eluiert (3.2.1.7) und als Template in einer weiteren PCR eingesetzt, die seiner zusätzlichen Amplifikation diente. Es wurden dieselben Primer wie in PCR-Schritt 4 verwendet. Die erhaltene DNA wurde aufgereinigt (3.2.1.12) und nach Verdau mit den Re-striktionsenzymen Mlu I, Eco RI und Bam HI in den Vektor M1-SC pCDNA 3 ligiert, der zuvor mit den beiden Enzymen Mlu I und Eco RI geschnitten wurde. Der Einsatz des En-zyms Bam HI war notwendig, um eine Unterscheidung des aus der Spaltung mit Mlu I und Eco RI hervorgehenden, zweiten DNA-Fragmentes (309 bp) von dem Zielfragment (338 bp) zu ermöglichen. Die Plasmid-DNA wurde in E. coli vermehrt, aufgereinigt und auf den korrekten Einbau des Inserts überprüft. Anschließend wurde ein 1 kb großer

DNA-Peptid-Sequenz Endprodukt

TG2

TG10 PCR-Produkt 3

PCR-Produkt 2 TG10

Oligo B PCR-Produkt 1

Peptid-Sequenz

B D

TG2 PCR-Produkt 3 Oligo 4

β2m-Signal TG10

Oligo A β2m-Signal

A C

Peptid Peptid

β2m β2m

β2m-Signal β2m

PCR- Pro-dukt 2

Abschnitt herausgeschnitten, der von den Restriktionsschnittstellen Bgl II und Kpn I flan-kiert wurde. Das Insert wurde in den Zielvektor HLA-A2 pEGFP-N3 kloniert, der zuvor ebenfalls mit Bgl II und Kpn I verdaut wurde (Abb. 6).

Peptid-SC

Abb. 6: Klonierungsstrategie von Peptid-SC pEGFP-Konstrukten. Nach Verdau des PCR-Endproduktes mit den Enzymen Mlu I, Eco RI und Bam HI (A; oben) erfolgte die Ligation des ca.

340 bp großen DNA-Fragmentes in den Vektor M1-SC pCDNA 3 (A; Mitte). Ein von den beiden Restriktionsschnittstellen Bgl II und Kpn I flankierter, 1 kb großer Abschnitt wurde anschließend herausgeschnitten und in den Vektor HLA-A2 pEGFP-N3 eingebracht, um ein Fusionskonstrukt aus Peptid-SC und EGFP zu erhalten (A; unten). Darstellung des Endproduktes Peptid-SC pEGFP, das aus dem Peptid-SC-Abschnitt mit gewünschter Peptidsequenz und dem HLA-A2 pEGFP-N3-Fusionskonstrukt besteht (B).