Aus der
Arbeitsgruppe Immunologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover und der Abteilung für Gastroenterologie der Medizinischen Hochschule Hannover
Herstellung artifizieller antigenpräsentierender Zellen zur adoptiven Immuntherapie bei Tumorpatienten
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Sonja Obermann, geb. Zieseniß
aus Hannover
Hannover 2007
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. H.-J. Schuberth
(Tierärztliche Hochschule Hannover) Apl. Prof. Dr. T. Greten
(Medizinische Hochschule Hannover)
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. H.-J. Schuberth 2. Gutachter: Prof. Dr. I. Nolte
Tag der mündlichen Prüfung: 29.05.2007
Die Arbeit wurde freundlicherweise durch Mittel der Fresenius Stiftung (AICR (04-269)) gefördert.
Für meine Eltern, die mir diesen Weg ermöglichten und für Arne, ohne den ich dieses Ziel nie erreicht hätte.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht... 3
2.1 MHC-Moleküle und Antigenprozessierung ... 4
2.1.1 MHC-Klasse-II-Moleküle... 5
2.1.2 MHC-Klasse-I-Moleküle... 5
2.1.3 Rekombinante MHC-Klasse-I-Moleküle... 7
2.2 Professionelle antigenpräsentierende Zellen... 9
2.3 T-Zellen ... 10
2.4 Manipulation von antigenspezifischen T-Zellen in vitro ... 12
2.4.1 Antigenunabhängige Amplifikation von T-Zellen ... 13
2.4.2 Antigenspezifische Expansion von T-Zellen ... 14
2.4.3 Expansion antigenspezifischer T-Zellen mit aAPCs ... 15
2.5 Nachweis von antigenspezifischen T-Zellen... 18
2.6 Tumorimmunologie... 19
2.6.1 Tumorantigene ... 20
2.6.2 Immuntherapie von Tumorerkrankungen... 24
2.6.2.1 Aktive Immunisierung und andere immuntherapeutische Verfahren ... 25
2.6.2.2 Adoptiver T-Zelltransfer ... 27
2.6.2.3 Therapieansätze in der Veterinärmedizin ... 29
2.6.3 Problematiken der Immuntherapie von Tumoren ... 31
3 Material und Methoden ... 33
3.1 Material... 33
3.1.1 Geräte ... 33
3.1.2 Plastik- und Glaswaren... 34
3.1.3 Reagenzien ... 35
3.1.4 Häufig verwendete Puffer ... 38
3.1.5 Biologische Materialien... 38
3.1.5.1 Bakterienstämme... 38
3.1.5.2 Eukaryontische Zellen ... 38
3.1.5.3 HLA-A2-positives Blut... 40
3.1.5.4 Mäuse... 41
3.1.6 Kulturmedien ... 41
3.1.6.1 Medien für Bakterien ... 42
3.1.6.2 Medien für die Zellkultur ... 42
3.1.6.3 Antibiotika... 43
3.1.7 Antikörper ... 44
3.1.8 Vektoren ... 45
3.1.9 Peptide ... 46
3.1.10 Primer... 47
3.2 Methoden ... 48
3.2.1 Allgemeine molekularbiologische Methoden ... 48
3.2.1.1 Kultivierung und Konservierung von E. coli -Stämmen... 48
3.2.1.2 Transformation von E. coli mit Plasmid-DNA... 48
3.2.1.3 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli ... 49
3.2.1.4 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von Nukleinsäuren ... 49
3.2.1.5 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen ... 50
3.2.1.6 Gelelektrophorese von DNA ... 50
3.2.1.7 Isolierung und Reinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen ... 51
3.2.1.8 Ethanol-DNA-Präzipitation... 51
3.2.1.9 Ligation von DNA-Fragmenten ... 51
3.2.1.10 Sequenzierung von Plasmid-DNA... 51
3.2.1.11 PCR ... 52
3.2.1.12 Aufreinigung von PCR-Produkten ... 53
3.2.2 Konstruktion der Expressionsvektoren ... 53
3.2.2.1 Klonierung von Peptid-SC pEGFP-Konstrukten ... 53
3.2.2.2 Expressionsvektor Influenza M1 pEGFP ... 57
3.2.3 Allgemeine Zellkulturmethoden ... 59
3.2.3.1 Kultivierung eukaryontischer Zellen... 59
3.2.3.2 Bestimmung der Zellzahl ... 60
3.2.3.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen ... 60
3.2.4 Spezielle Zellkulturmethoden ... 60
3.2.4.1 Gewinnung von Serum ... 60
3.2.4.2 Isolierung mononukleärer Zellen aus dem peripheren Blut ... 61
3.2.4.3 Gewinnung von Monozyten aus dem peripheren Blut ... 61
3.2.4.4 Transfektion eukaryontischer Zellen... 62
Elektroporation ... 62
Transfektion mittels Lipofektamin ... 63
3.2.4.5 Bestrahlung von Zellen... 64
3.2.4.6 Herstellung von PHA-Blasten ... 64
3.2.4.7 TCGF-Medium... 64
Herstellung ... 64
Prüfung des hergestellten TCGF-Mediums ... 65
3.2.4.8 Generierung peptidspezifischer CTLs ... 65
Generierung antigenspezifischer CTLs mit autologen PBMCs... 66
Generierung antigenspezifischer CTLs mit autologen MoDCs ... 66
Generierung antigenspezifischer CTLs mit aAPCs ... 67
3.2.5 Charakterisierung von Zellen... 68
3.2.5.1 Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie... 68
Untersuchung der Immunfluoreszenz mittels Fluoreszenzmikroskop... 68
Durchflusszytometrie ... 68
Oberflächen-FCM-Analyse ... 70
Bestimmung der Peptidspezifität mittels Pentamer-Färbung... 70
IFN-γ-Bestimmung mittels intrazellulärer FCM-Analyse ... 71
3.2.5.2 Bestimmung der GM-CSF-Konzentration mittels Zytokin-ELISA... 72
3.2.5.3 Proliferations-Assays... 73
CFSE-Assay... 74
[3H]-Thymidin-Assay... 74
3.2.5.4 51Cr release assay... 75
3.2.6 Tierexperimentelle Methoden ... 76
3.2.6.1 Injektion von Tumorzellen... 76
3.2.6.2 Adoptiver T-Zelltransfer ... 77
3.2.6.3 Entnahme und Charakterisierung von Maustumoren ... 77
3.2.7 Statistische Auswertung ... 77
4 Ergebnisse ... 79
4.1 Klonierung von Peptid-SC pEGFP-Konstrukten ... 79
4.2 Klonierung von Influenza M1 pEGFP ... 83
4.3 Methodische Vorarbeiten... 85
4.3.1 Prüfung des hergestellten TCGF-Mediums ... 85
4.3.2 Expressionsmodulation kostimulatorischer Moleküle ... 86
4.4 Generierung peptidspezifischer T-Zellen mit aAPCs... 88
4.4.1 Transfektion von Daudi-Zellen mit Peptid-SC pEGFP-Konstrukten... 88
4.4.2 Funktionalität von Daudi M1-SC-Zellen ... 89
4.4.2.1 Überprüfung der M1-Reaktivität gesunder Spender ... 89
4.4.2.2 Stimulation von M1-spezifischen T-Zellen mit Daudi M1-SC-Zellen ... 90
4.5 In vitro-Funktionalität der generierten M1-spezifischen T-Zellen ... 99
4.5.1 Zytokinsekretion ... 99
4.5.2 Proliferation ... 100
4.5.3 Zytotoxizität ... 103
4.5.4 Reaktivität gegenüber Influenza M1-transfizierten Tumorzellen... 105
4.5.4.1 Intrazelluläre IFN-γ-Analyse... 106
4.5.4.2 GM-CSF-ELISA ... 107
4.5.4.3 Zytotoxizität ... 108
4.6 Vergleich von aAPCs mit DCs... 109
4.7 Funktionalität von M1-spezifischen T-Zellen in vivo ... 116
4.8 Generierung M1-spezifischer T-Zellen aus Patienten mit fortgeschrittenen Karzinomen des Gastrointestinaltraktes unter palliativer Chemotherapie ... 118
4.9 Generierung tumorspezifischer T-Zellen aus Patienten mit hepatozellulärem Karzinom ... 120
5 Diskussion ... 123
5.1 Herstellung von Peptid-SC-Konstrukten mittels 4-Step-PCR ... 123
5.2 Transfektion von MHC-Klasse-I-negativen Zellen mit Peptid-SC-Konstrukten .... 124
5.3 Generierung M1-spezifischer CTLs mit Hilfe der aAPCs und Prüfung verschiedener Kulturbedingungen ... 126
5.4 Überprüfung der Funktionalität generierter Effektorzellen in vitro... 129
5.5 Vergleich von Daudi Peptid-SC-Zellen mit klassischen DCs und transfizierten
K562-Zellen ... 135
5.6 Überprüfung der Funktionalität generierter Effektorzellen in vivo ... 138
5.7 Generierung antigenspezifischer CD8+ T-Zellen aus Tumorpatienten ... 141
5.8 Relevanz der erhobenen Daten für die Tiermedizin ... 144
6 Zusammenfassung... 147
7 Summary... 150
8 Literaturverzeichnis ... 152
9 Anhang ... 181
9.1 Vorveröffentlichungen der Dissertation ... 181
9.2 Danksagung ... 182
9.3 Eidesstattliche Erklärung nach § 3 Abs. 2 Nr. 7 PromO ... 183
Abkürzungsverzeichnis
AS Aminosäure
7AAD 7-Amino-Actinomycin D
aAPC künstliche antigenpräsentierende Zelle (artificial APC)
Abb. Abbildung
AFP α-Fetoprotein
AK Antikörper
APC antigenpräsentierende Zelle (antigen presenting cell) Aquadest. einfach destilliertes Wasser (aqua destillata)
β2m beta2-Mikroglobulin
bp Basenpaar
Bq Becquerel (SI-Einheit für Radioaktivität) BSA Bovines Serumalbumin
bzgl. bezüglich
bzw. beziehungsweise CD cluster of differentiation
CFSE 5, 6-Carboxyfluorescein-Diacetat-Succinimidyl-Ester CLIP class II-associated invariant-chain peptide
cm Zentimeter
CMV Cytomegalievirus
CO2 Kohlenstoffdioxid
CpG Cytosin-Phosphat-Guanosin cpm counts per minute
DC Dendritische Zelle (dendritic cell) DMEM Dulbecco's modified eagle medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure dsDNA doppelsträngige DNA EBV Epstein-Barr-Virus E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EGFP enhanced green fluorescent protein ER endoplasmatisches Retikulum E:T Effektor:Target-Verhältnis
(Verhältnis zwischen Effektor- und Zielzellen) et al. und andere (latein: et alii)
F Farad (SI-Einheit für elektrische Kapazität) FACS fluorescence activated cell sorting
FACScalibur Fluoreszenzaktiviertes Zellmessgerät der Fa. Becton-Dickinson Fc Carboxy-terminales Fragment von Immunglobulinen
(fragment crystalline)
FCM Durchflusszytometer (flow cytometer) FCS Fetales Kälberserum
FITC Fluoreszeinisothiocyanat
FL-1, -2, -3, -4 Messkanäle des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz
FP forward primer
FSC Vorwartsstreulicht (forward scatter)
g Gramm
GFP green fluorescent protein
GM-CSF Granulozyten-Makrophagen-Koloniestimulierender Faktor Gy Gray (SI-Einheit für die Dosis radioaktiver Strahlung) h Stunde (latein: hora)
HCC hepatozelluläres Karzinom
HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-ethansulfonsäure HIV humanes Immundefizienzvirus
HLA human leukocyte antigen
HPLC high performance liquid chromatography HSP Hitze-Schock-Protein (heat shock protein)
ICAM interzelluläres Adhäsionsmolekül (intercellular adhesion molecule) i.d.R in der Regel
IFN Interferon
Ig Immunglobulin
IL Interleukin
i.v. intravenös
kg Kilogramm
L Ligand
l Liter
li invariante Kette (invariant chain) Lnn. Lymphknoten (latein: lymphonodii) LPS Lipopolysaccharid
µ mikro (x 10-6)
m milli (x 10-3)
MACS magnetic activated cell sorting mAK monoklonale(r) Antikörper MgCl Magnesiumchlorid
MHC Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex)
min Minute(n)
MoDCs aus CD14+ Zellen gereifte DCs (monocyte-derived DCs)
mRNA messenger RNA
n nano (x 10-9)
n = bei Berechnung des Mittelwertes die Anzahl der Einzelbeobachtungen NaCl Natriumchlorid
NK Natürliche Killerzelle NaN3 Natriumazid
Nr. Nummer
NOD-scid Non-Obese Diabetical Severe Combined Immunodeficiency NY-ESO-1 New York Esophageal-1
OD Optische Dichte
ODN Oligodesoxynukleotide
OVA Ovalbumin
p Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Da- tengruppen (probability)
PAMP Pathogen-assoziiertes molekulares Muster
(pathogen associated molecular pattern) PBMCs mononukleäre Zellen des peripheren Blutes
PBS phosphatgepufferte Kochsalzlösung (phosphate buffered saline) PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction)
PE Phycoerythrin
PHA Phythämagglutinin
PI Propidiumjodid
PMA Phorbol-12-Myristat-13-Acetat
RNA Ribonukleinsäure
RP reverse primer
rpm Drehungen pro Minute (rounds per minute)
RT Raumtemperatur
s.c. subkutan
scid schwerer kombinierter Immundefekt
SD Standardabweichung
SDS Natriumdodecylsulfat
SEREX serological analysis of recombinant cDNA expression libraries
sec Sekunde(n)
sog. so genannte(r)
SSC Seitwärtsstreulicht (side scatter)
TAP transporter associated with antigen processing
TCR T-Zellrezeptor
TCGF T-Zell-Wachstumsfaktor (T cell growth factor) TH1, TH2 Phänotyp einer T-Helfer-Zelle 1 oder 2
TILs Tumorinfiltrierende Lymphozyten TLR Toll-like-Rezeptor (toll-like receptor)
TNF Tumornekrosefaktor (tumor necrosis factor)
U Einheit (Unit)
u.a. unter anderem
V Volt (SI-Einheit für elektrische Spannung) v / v Volumen pro Volumen
1 Einleitung
Antigenspezifische T-Zellen nehmen eine zentrale Aufgabe in der Abwehr von Infektionen und der Kontrolle von Tumorerkrankungen ein. Diese funktionellen Eigenschaften lympha- tischer Zellen macht man sich bei der adoptiven Immuntherapie zunutze. Das Prinzip be- ruht darauf, dass Patienten mit einer viralen oder malignen Erkrankung ex vivo expandier- te, antigenspezifische T-Zellen appliziert werden, um eine Beseitigung infizierter oder ent- arteter Zellen in vivo zu erreichen.
Aufgrund des komplizierten Selektions- und Herstellungsprozesses spezifischer T- Zellklone und T-Zelllinien sowie einer meist geringen Zellausbeute sind antigenspezifische T-Zellen für den therapeutischen Einsatz bislang nur eingeschränkt nutzbar. Dennoch konnte die Wirksamkeit einer Therapie mit spezifischen T-Zellen in der Behandlung von EBV- sowie CMV-Infektionen nach allogener Knochenmarktransplantation nachgewiesen werden (HAQUE et al., 2002; PEGGS et al., 2003; RAUSER et al., 2004). Durch gezielte Selektion von T-Lymphozyten, die gegen tumorassoziierte Antigene gerichtet sind, kann die Einsatzmöglichkeit auf weitere Tumorentitäten ausgedehnt werden (YEE et al., 2002;
DUDLEY und ROSENBERG, 2003; GOTTSCHALK et al., 2003).
Die antigenspezifischen T-Zellen werden in vitro aus den mononukleären Zellen des peri- pheren Blutes (PBMCs) der jeweiligen Patienten generiert. Hierfür werden klassischerwei- se professionelle antigenpräsentierende Zellen (APCs) verwendet. Sie werden mit dem gewünschten Antigen beladen und können unter bestimmten Kulturbedingungen spezifi- sche T-Zellen zur Proliferation und Expansion anregen.
Da es sich bei dieser „klassischen“ Methode um ein sehr zeit- und kostenintensives Ver- fahren handelt, wurden alternative Strategien zur spezifischen T-Zellaktivierung entwickelt.
Diese beinhalten den Einsatz so genannter künstlicher antigenpräsentierender Zellen (aAPCs), welche die professionellen APCs möglichst gut imitieren sollen. So wurden Mo- leküle, die für die Stimulation von Effektor-T-Zellen in vivo bedeutsam sind, in nichtimmune Zellen eingebracht oder an magnetische Partikel oder Vesikel gebunden. Die generierten aAPCs waren unterschiedlich gut in der Lage, antigenspezifische T-Zellen in vitro zu sti- mulieren und zu expandieren (KIM et al., 2004; OELKE et al., 2005a; OELKE et al., 2005b).
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zellbasierte künstliche APCs zu generieren, die das so genannte Peptid-MHC-Fusionskonstrukt (Peptid-SC) an ihrer Oberfläche exprimieren.
Hierbei handelt es sich um genetisch veränderte MHC-Klasse-I-Moleküle, bei denen so- wohl das β2-Mikroglobulin als auch das jeweilige Peptid kovalent mit der schweren α-Kette des Moleküls verbunden sind. Diese Konstrukte sollten in MHC-Klasse-I-negative Zellen eingebracht werden, um aAPCs zu erhalten, die nur das gewünschte Peptid, nicht jedoch endosomal prozessierte Antigene an ihrer Oberfläche präsentieren. In den sich anschlie- ßenden Versuchen sollte die Fähigkeit der hergestellten aAPCs überprüft werden, anti- genspezifische CD8+ T-Zellen effektiv zu stimulieren und zu expandieren.
Die Arbeit lässt sich in folgende Arbeitsschritte untergliedern:
1. Herstellung von Peptid-SC-Konstrukten mittels 4-Step-PCR.
2. Transfektion von MHC-Klasse-I-negativen Zellen mit den Peptid-SC-Konstrukten.
3. Generierung peptidspezifischer T-Zellen mit Hilfe der hergestellten aAPCs und Prüfung verschiedener Kulturbedingungen.
4. Überprüfung der Funktionalität generierter Effektorzellen in vitro und in vivo.
5. Vergleich der stimulatorischen Kapazität von Daudi Peptid-SC-Zellen mit klassischen DCs und transfizierten K562-Zellen.
6. Generierung antigenspezifischer CD8+ T-Zellen aus PBMCs von Tumorpatienten mit Hilfe der hergestellten aAPCs.
2 Literaturübersicht
Während der Evolution hat sich das Immunsystem zu einem hochkomplexen und effekti- ven Netzwerk entwickelt, welches in der Lage ist, Fremdkörper und Mikroorganismen wie z.B. Viren, Bakterien und Pilze, aber auch körpereigene, entartete Zellen zu erkennen und abzutöten. Aufgrund des komplexen Zusammenspiels von humoralen und zellulären Ab- wehrmechanismen ist das Immunsystem dabei in der Lage, zwischen körpereigenen und fremden Strukturen zu unterscheiden. Die Immunantwort kann in ein angeborenes und erworbenes Immunsystem unterteilt werden.
Das angeborene Immunsystem bildet eine erste Abwehrlinie des Organismus. Es zeichnet sich dadurch aus, dass es nach dem Eindringen von Pathogenen innerhalb kürzester Zeit reagiert. Die Erkennung fremder Strukturen erfolgt über so genannte PAMPs (pathogen- associated molecular patterns). Sie binden an spezifische Rezeptoren der Effektorzellen und induzieren somit eine Hochregulierung bestimmter Oberflächenmoleküle und eine Ausschüttung inflammatorischer Mediatoren. Dies führt zur Aktivierung von Zellen des er- worbenen Immunsystems. Einige Zellen des angeborenen Immunsystems sind außerdem in der Lage, Krankheitserreger direkt abzutöten. Komponenten der unspezifischen Abwehr sind inflammatorische Zellen wie Makrophagen, Granulozyten, Mastzellen, Natürliche Kil- lerzellen, Untergruppen von T- und B-Zellen (z.B. γ:δ T-Zellen und NK1.1+ NKT-Zellen) sowie das Komplementsystem.
Im Gegensatz zur angeborenen ist die adaptive Immunität hochspezifisch für das jeweilige Pathogen und stets antigenvermittelt. Sie zeichnet sich durch die vier Merkmale: Spezifi- tät, Diversität, Gedächtnis und Unterscheidung von selbst und fremd aus. Nach Aktivie- rung kommt es zur klonalen Selektion und Expansion antigenspezifischer T- und B- Lymphozyten. Die humorale Immunität wird von Antikörpern gebildet, die von B- Lymphozyten sezerniert werden. Sie schützt den Organismus vor extrazellulären Antige- nen und Toxinen durch die drei Mechanismen: Neutralisation, Opsonierung und Komple- mentaktivierung. Intrazelluläre Pathogene, wie z.B. Viren und einige Bakterien sowie Tu- morzellen werden von zytotoxischen T-Zellen und inflammatorischen TH1-Zellen bekämpft (zelluläre Immunität). T-Helferzellen sind zudem für die Koordination vieler Funktionen des Immunsystems zuständig. Die Aktivierung der Zellen des erworbenen Immunsystems ba- siert auf ihrer Interaktion mit professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APCs). APCs
spielen somit eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung von Immunität und stellen ein Bindeglied zwischen dem angeborenen und dem erworbenen Immunsystem dar.
2.1 MHC-Moleküle und Antigenprozessierung
Um naive T-Lymphozyten zu stimulieren, müssen ihnen Antigene über spezielle, mem- branständige Glykoproteine präsentiert werden (ZINKERNAGEL und DOHERTY, 1974).
Hierbei handelt es sich um Moleküle, die Peptide aus extrazellulären bzw. zytosolischen Proteinen binden können. Sie werden beim Menschen als human leukocyte antigens (HLA) bezeichnet und von Genen des Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) kodiert, der auf Chromosom 6 lokalisiert ist. Bei den Haustieren liegen diesbezüglich artspezifische Unterschiede vor. So befindet sich beispielsweise der ELA (equine leukocyte antigen)- Komplex auf Chromosom 20. Beim Schwein sind die Gene des MHC hingegen auf Chro- mosom 7, beim Rind auf Chromosom 23 und beim Hund auf Chromosom 12 lokalisiert.
Man unterscheidet zwei Arten von MHC-Molekülen, die als MHC-Klasse-I und MHC- Klasse-II bezeichnet werden. Für MHC-Klasse-I-Moleküle existieren beim Menschen je- weils drei Genorte: HLA-A, -B und -C. Die drei Genregionen für MHC-Klasse-II sind HLA- DP, -DQ und -DR. Diese Gene zeichnen sich durch einen außergewöhnlich starken Poly- morphismus aus, so dass die meisten Individuen für jeden Lokus heterozygot sind und wegen der kodominanten Expression der Gene der schweren Ketten bis zu sechs ver- schiedene MHC-Klasse-I- bzw. bis zu acht verschiedene MHC-Klasse-II-Moleküle besit- zen. Aufgrund der hohen Variation in den einzelnen Genorten existieren 489 unterschiedli- che Allele für HLA-A, 830 Allele für HLA-B und 266 Allele für HLA-C (IMGT/HLA Sequence Database; http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.html). Aufgrund seiner großen Häufigkeit in allen ethnischen Gruppen findet in vielen immunologischen Untersuchungen eine Fokus- sierung auf den HLA-A*0201 (HLA-A2)-Lokus statt. So tragen beispielsweise etwa 46 % der mitteleuropäischen Bevölkerung HLA-A2 als eines ihrer Allele (The Central Data Ana- lysis Committee. Section 6.3 Splits Combined (Five Loci). The Data Book of the 11th In- ternational Histocompatibility Workshop. Yokohama, Japan; 1991:807-814).
2.1.1 MHC-Klasse-II-Moleküle
Bei MHC-Klasse-II-Molekülen handelt es sich um heterodimere Glykoproteine, die aus zwei nichtkovalent assoziierten, membranständigen Ketten, der 34 kDa großen α- und der 29 kDa großen β-Kette, bestehen. Jede Kette lässt sich in zwei extrazelluläre Immunglo- bulindomänen (α1 und α2 bzw. β1 und β2), eine Transmembranregion und eine kurze zyto- solische Domäne unterteilen (BROWN et al., 1993). Die im Gegensatz zu MHC-Klasse-I- Molekülen an beiden Enden offene Peptidbindungsgrube wird von der α1- und β1-Domäne gebildet. Sie nimmt Liganden mit einer variablen Länge von 13-25 Aminosäuren auf (CHICZ et al., 1992). MHC-Klasse-II-Moleküle werden in der Regel nur von professionel- len APCs exprimiert. Sie präsentieren Liganden an ihrer Oberfläche, die aus dem endolysosomalen Zellkompartment abstammen (MORRISON et al., 1986). MHC-Klasse-II- Peptide werden durch saure Proteasen, wie z.B. Cathepsine, in den Endolysosomen ge- neriert. Nach Fusion mit Vesikeln, die MHC-Klasse-II-Moleküle enthalten, kommt es zur Verankerung der Peptide in der Peptidbindungsfurche. Die MHC-Klasse-II-Moleküle wer- den im ER mit Hilfe des Chaperons Calnexin synthetisiert (BRYANT und PLOEGH, 2004).
Durch Anlagerung der trimeren invarianten Kette (invariant chain, li) an die α- und β-Kette kommt es zunächst zu einem Schutz des Moleküls. Über den Golgi-Apparat gelangt der nonamere Komplex (li)3(α:β)3 zum späten endosomalen Kompartment. Aufgrund des dort vorherrschenden niedrigen pH-Wertes kommt es zur Spaltung der li durch saure Protea- sen. Zurück bleibt ein als CLIP (class II-associated invariant-chain peptide) bezeichnetes Fragment, das erst im nachfolgenden Schritt mit einem MHC-Klasse-II-Liganden ausge- tauscht wird. Dieser Vorgang wird durch das nicht-klassische MHC-Klasse-II-Molekül HLA- DM assistiert (SLOAN et al., 1995).
2.1.2 MHC-Klasse-I-Moleküle
MHC-Klasse-I-Moleküle sind ebenfalls heterodimere Glykoproteine, die in ihrer Struktur den MHC-Klasse-II-Molekülen ähneln. Sie werden von allen kernhaltigen Zellen bis auf Spermatozyten exprimiert. Sie bestehen aus einer 46 kDa großen α-Kette (schwere Ket- te), die nichtkovalent mit einem extrazellulären 12 kDa großen Polypeptid verbunden ist (MADDEN, 1995). Diesem, als β -Mikroglobulin (β m) bezeichneten Polypeptid, wird eine
wichtige Rolle beim intrazellulären Transport, der Peptidbindung sowie bei der Aufrechter- haltung der Konformationsstabilität zugeschrieben (HANSEN und LEE, 1997). Die α-Kette setzt sich aus einer kurzen zytoplasmatischen, einer transmembranären sowie drei extra- zellulären Domänen (α1-α3) zusammen. Die beiden C-terminalen Domänen α1 und α2 for- men eine längliche Peptidbindungsfurche, deren Boden von einer β-Faltblattstruktur gebil- det wird. Seitlich wird sie von zwei α-helikalen Bereichen begrenzt. Ein aus 8-10 Amino- säuren bestehendes Peptid ist über hydrophobe und ionische Wechselwirkungen nichtko- valent in der Peptidbindungsfurche verankert. Den größten Anteil an der Bindung nehmen Bereiche der α1-Helix ein, die mit so genannten „Ankeraminosäuren“ des Peptids in Wechselwirkung treten. Die Tatsache, dass die Peptidbindungsfurchen der einzelnen HLA-Allelprodukte jeweils charakteristische chemische Verhältnisse aufweisen, führt dazu, dass jedem Allel ein bestimmtes „Peptidmotiv“ zugewiesen werden kann (FALK et al., 1991). Die Peptide, die von MHC-Klasse-I-Molekülen präsentiert werden, sind vor allem zytosolischen Ursprungs. Sie werden aus den im Zytoplasma kontinuierlich synthetisierten Proteinen gebildet und stellen Spaltprodukte von ihnen dar (YORK et al., 1999). Auf ge- sunden Zellen handelt es sich demnach um Selbstpeptide, die den regulären zytoplasma- tischen Zellbestand widerspiegeln. Im Fall einer Infektion oder Tumorerkrankung werden dagegen auch Peptide mikrobiellen bzw. tumorösen Ursprungs auf der Zelloberfläche exprimiert.
Initial wird das zu degradierende Protein an Ubiquitin gebunden und zu dem im Zytoplas- ma lokalisierten Proteasom geleitet. Bei dem Proteasom handelt es sich um einen Multi- enzymkomplex, der aus einer katalytisch aktiven Komponente, dem 20S-Proteasom be- steht. Das 20S-Proteasom ist ein fassartiger Komplex aus vier übereinander liegenden Ringen mit je sieben α- (äußere Ringe) und β-Untereinheiten (innere Ringe), wobei je drei β-Untereinheiten enzymatisch aktive Zentren mit unterschiedlichen Schnittspezifitäten dar- stellen (GROLL et al., 1997). Unter dem Einfluss von IFN-γ, zum Beispiel im Zusammen- hang mit einer viralen Infektion, kommt es zum Austausch der β-Untereinheiten mit den proteasomalen Untereinheiten LMP2 und LMP7 sowie MECL-1 (GACZYNSKA et al., 1993; NANDI et al., 1996). Das konstitutive Proteasom konvertiert somit zum so genann- ten Immunoproteasom. Verglichen mit dem konstitutiven Proteasom weist das Immu- noproteasom typische Schnittmuster auf. So ergeben sich vermehrt Schnitte nach hydro-
phoben und weniger nach sauren Aminosäuren (TOES et al., 2001). Da alle bekannten Peptidmotive für humane MHC-Klasse-I-Moleküle C-terminal entweder hydrophobe oder basische Aminosäuren aufweisen, werden nun verstärkt Peptide generiert, die potentielle MHC-Klasse-I-Liganden darstellen. Die durch das Proteasom gebildeten Peptide gelangen nach weiterer N-terminaler Modifikation durch zytosolische Peptidasen über das heterodi- mere Transportprotein TAP ATP-abhängig in das endoplasmatische Retikulum (LANKAT- BUTTGEREIT und TAMPE, 2002). Dort werden sie an ein passendes, leeres Heterodimer, bestehend aus der schweren α-Kette und dem β2m, das zudem mit weiteren Molekülen wie dem transmembranären Glykoprotein Tapasin, dem Chaperon Calreticulin sowie der Proteindisulfidisomerase Erp57 interagiert, gebunden. Aus dem ER gelangt der trimere Komplex aus Peptid, α-Kette und β2m auf dem regulären Exozytoseweg für Membranpro- teine über den Golgi-Apparat und exozytotische Vesikel an die Zelloberfläche, wo er CD8+ T-Zellen präsentiert wird (BOUVIER, 2003).
2.1.3 Rekombinante MHC-Klasse-I-Moleküle
Die Tatsache, dass zytotoxischen T-Zellen eine wichtige Rolle bei der Kontrolle vieler Krankheiten zugesprochen wird, hat zur Entwicklung stabiler MHC-Klasse-I-Komplexe ge- führt, die für funktionelle und strukturelle Studien von Bedeutung sind. Durch den Einsatz multimerer MHC-Peptid-Komplexe kann beispielsweise die Spezifität und Affinität von T- Zellrezeptoren gegenüber ihrem Peptid-MHC-Liganden bestimmt werden. Weiterhin ist es möglich, antigenspezifische T-Zellen direkt zu detektieren, sie phänotypisch zu charakteri- sieren oder auch zu aktivieren (DENKBERG et al., 2000). Solche Untersuchungen setzen voraus, dass große und reproduzierbare Mengen an löslichen und funktionellen MHC- Peptid-Komplexen synthetisiert werden, was zur Generierung verschiedener, rekombinan- ter MHC-Moleküle geführt hat.
Erste Studien beinhalteten die Entwicklung rekombinanter MHC-Klasse-I-Moleküle, deren Komponenten schwere Kette und β2m separat voneinander in E. coli exprimiert wurden.
Die Faltung dieser Moleküle erfolgte anschließend in vitro unter Peptidanwesenheit (GARBOCZI et al., 1992). Da unter Kulturbedingungen in nur ca. einem Viertel der Fälle eine korrekte Assoziation der schweren Kette mit dem β2m stattfindet (HANSEN und LEE,
ααα α3 α αα α2
Peptid
α αα α1
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Peptid
TM Cyto ααα
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1997), wurde versucht, beide Polypeptidketten kovalent über einen Peptid-Linker mitein- ander zu verknüpfen (MOTTEZ et al., 1991; DENKBERG et al., 2000). Eine Beladung die- ser so genannten single-chain-Konstrukte mit gewünschten Peptiden erfolgte anschlie- ßend in vitro. In anderen Studien wurde das Peptid mit Hilfe eines flexiblen Aminosäure- Linkers an den N-Terminus der schweren α-Kette (MOTTEZ et al., 1995) oder auch direkt an das β2-Mikroglobulin gebunden (UGER und BARBER, 1998; WHITE et al., 1999).
Ein weiteres, rekombinantes MHC-Klasse-I-Molekül wurde im Jahre 2002 von GRETEN et al. beschrieben (Abb. 1). Hierbei handelt es sich um das so genannte Peptid-β2- Mikroglobulin-MHC-single-chain (SC)-Konstrukt (Peptid-SC), ein Fusionsmolekül, bei dem die drei Komponenten des humanen HLA-A2-Moleküls kovalent miteinander verbunden sind. Das bedeutet, dass die Assoziation zwischen der schweren α-Kette, dem β2m sowie dem Peptid nicht, wie natürlicherweise, über elektrostatische Wechselwirkungen erfolgt, sondern über flexible Aminosäuregruppen zustande kommt.
Abb. 1: Schematische Darstellung von MHC-Klasse-I- und Peptid-SC-Molekülen. Struktur eines MHC-Klasse-I-Moleküls, das aus zwei Polypeptidketten (α-Kette und β2m) besteht, die nicht- kovalent miteinander verbunden sind. In der von der α1- und α2-Domäne gebildeten Peptidbin- dungsfurche ist das 8-10 AS lange Peptid verankert (A). Beim rekombinanten Peptid-SC-Konstrukt befindet sich sowohl zwischen β2m und der α1-Domäne als auch zwischen β2m und dem Peptid ein AS-Linker, der aus Serin- und Glycin-Resten besteht (B). Schematische Darstellung der DNA- Sequenz des Peptid-SC-Konstruktes (C). β2m: β2-Mikroglobulin; S1 bzw. S2: AS-Linker; TM:
transmembranäre Region; Cyto: zytoplasmatische Domäne.
Wie aus Abb. 1 hervorgeht, befindet sich in dem Peptid-SC-Konstrukt jeweils ein aus Gly- cin- und Serin-Molekülen bestehender Aminosäure-Linker sowohl zwischen Peptid und β2m als auch zwischen β2m und der α1-Domäne der schweren Kette. Nach Fusion dieses Konstruktes mit einem murinen Immunglobulin-Molekül war es möglich, peptidspezifische T-Zellen zu detektieren und zu stimulieren. Das rekombinante Peptid-SC-Fusionsprotein war hierbei in der Lage, antigenspezifische T-Zellen mit hoher Spezifität und Sensibilität zu binden (GRETEN et al., 2002).
2.2 Professionelle antigenpräsentierende Zellen
Hochspezialisierte Zellen, die Proteinantigene zerlegen und die Peptidfragmente gemein- sam mit MHC-Klasse-I- oder MHC-Klasse-II-Moleküle auf ihrer Oberfläche darbieten kön- nen, werden als professionelle APCs bezeichnet. Sie sind in der Lage, CD4+ bzw. CD8+ T- Zellen zu stimulieren und stellen ein Bindeglied zwischen dem angeborenen und dem adaptiven Immunsystem dar. Typische APCs sind B-Zellen, Monozyten, Makrophagen und DCs, wobei Letztere die potentesten Zellen dieser Gruppe darstellen. Sie wurden in den 70er Jahren von Ralph Steinman entdeckt (STEINMAN und COHN, 1973). Es handelt sich hierbei um eine heterogene Zellpopulation, die laufend von Knochenmarkstammzellen nachgebildet wird. Man unterscheidet zwei humane DC-Linien: myeloide DCs, die aus myeloiden Monozyten hervorgehen und durch Produktion von IL-12 eine TH1-Antwort in- duzieren sowie lymphoide DCs, deren Vorläufer als plasmazytoide DCs bezeichnet wer- den und die die Immunreaktion in Richtung TH2 lenken (LIU et al., 2001). DCs besitzen die Eigenschaft, Antigene in hohem Maße aufzunehmen und zu prozessieren. Durch mikro- bielle Produkte (z.B. LPS, unmethylierte CpG-DNA oder doppelsträngige RNA), proinflammatorische Zytokine (z.B. TNF-α oder IL-1β) und / oder Bindung von CD40L werden sie aktiviert und wandern, aus den peripheren Geweben kommend, über die affe- renten Lymphgefäße zu den drainierenden Lymphknoten (kurz: homing). Dort treten sie in den T-Zellbereichen als interdigitierende, retikuläre Zellen in Erscheinung (STEINMAN, 1991). Als Konsequenz ihrer Reifung kommt es zur Hochregulierung von MHC-Klasse-I- und Klasse-II-Molekülen (CELLA et al., 1997), zu einem erhöhten Level an kostimulatori-
schen Molekülen (SHARPE und FREEMAN, 2002) und einer Exposition von CD83 auf ihrer Oberfläche (ZHOU und TEDDER, 1996; BANCHEREAU und STEINMAN, 1998).
CD80 und CD86 stellen klassische, kostimulatorische Moleküle dar. Sie werden von allen professionellen aAPCs exprimiert und spielen als so genanntes Signal 2 eine entschei- dende Rolle bei der Aktivierung von T-Lymphozyten. CD83 ist ein transmembranäres Gly- koprotein, das zur Immunglobulin-Superfamilie gerechnet wird. Beim Menschen wird die- ses Membranprotein als Differenzierungsmarker reifer DCs eingesetzt. Neben DCs wird es auch von aktivierten Lymphozyten exprimiert. Obwohl seine Funktion bislang noch nicht vollständig geklärt werden konnte, wird vermutet, dass es Interaktionen von DCs und T- Zellen beeinflusst (SCHOLLER et al., 2001).
Nach Einwanderung in den Lymphknoten sind die nun reifen DCs nicht mehr in der Lage, Antigene zu phagozytieren und zu prozessieren. Dafür verfügen sie über die ausgeprägte Fähigkeit, T-Zellen zu stimulieren. Dies geschieht über die Ausbildung einer stabilen Ver- bindung, die auch als immunologische Synapse bezeichnet wird. Folgende molekulare Interaktionen sind in diesem Zusammenhang zwischen DC und T-Zelle von Bedeutung:
Peptid-MHC / TCR, kostimulatorische Moleküle wie CD80 und CD86 / CD28, CD40 / CD40L, Adhäsionsmoleküle wie LFA-3 / CD2 sowie ICAM-1 / LFA-1 (LANZAVECCHIA und SALLUSTO, 2001).
2.3 T-Zellen
Im peripheren Blut eines gesunden Menschen befinden sich ca. 70% T-Lymphozyten, 15% B-Lymphozyten und ungefähr 15% NK-Zellen. Der Anteil an CD3+CD4+ T-Zellen liegt im Mittel bei 44 (28-57) %. CD3+CD8+ T-Zellen stellen 24 (10-39) % der gesamten Lym- phozytenpopulation dar (COMANS-BITTER et al., 1997). Beim Haustier existieren diesbe- züglich deutliche individuelle Unterschiede. Zusammenfassend nehmen B-Zellen im Blut einen prozentualen Anteil von 40-80 % ein. Der Anteil an T-Zellen liegt je nach Tierart in einem Bereich von 31-89 %, wobei 8-49 % auf die CD3+CD4+ und 4-39 % auf die CD3+CD8+ Zellfraktion fallen (TIZARD, 2004).
T-Zellen tragen auf ihrer Oberfläche einen Rezeptor, der als T-Zellrezeptor (TCR) be- zeichnet wird. Er besteht aus zwei membranständigen Polypeptidketten, der α- und der β- Kette (α:β-T-Zellen) bzw. γ- und δ-Kette (γ:δ T-Zellen). Jede Kette kann in zwei Immunglo- bulin-ähnliche Domänen, eine aminoterminale variable und eine konstante Region, einge- teilt werden. Die Antigenbindungsstelle wird von den variablen Regionen der beiden Ket- ten gebildet. Auf der Oberfläche der T-Zelle ist der α:β T-Zellrezeptor Teil eines Rezeptor- komplexes, der zusätzlich aus akzessorischen Molekülen besteht. Hierbei handelt es sich z.B. um die Korezeptoren CD4 oder CD8, die direkt mit den MHC-Klasse-I- bzw. -II- Molekülen interagieren. Die akzessorischen Ketten CD3δ, CD3ε und CD3ζ spielen eine wichtige Rolle bei der Induktion einer intrazellulären Signalkaskade (HUANG und WANGE, 2004).
Entsprechend der von BRETSCHER und COHN (1970) eingeführten Hypothese benötigt eine naive T-Zelle zur Aktivierung zwei Signale. Signal 1 entsteht durch die Interaktion des TCR mit einem Peptid-MHC-Molekül. Signal 2, auch als kostimulatorisches Signal be- zeichnet, stellt klassischerweise die Bindung von CD28 auf der T-Zelle an die kostimulato- rischen Moleküle CD80 und CD86 auf den APCs dar (SHARPE und FREEMAN, 2002).
Bleibt das zweite Signal aus, tritt die T-Zelle in den Zustand der Anergie über (APPLEMAN und BOUSSIOTIS, 2003). Bei einer adäquaten Stimulierung kommt es hingegen in der T- Zelle zu einer massiven Phosphorylierung intrazellulärer Tyrosinreste, woraus eine Aktivie- rung multipler Signalkaskaden resultiert. Dies führt wiederum zur Expression weiterer ak- zessorischer Moleküle auf ihrer Oberfläche, wie z.B. 4-1BB, CD40L, ICOS und OX40, die durch Bindung an 4-1BBL, CD40, LICOS bzw. OX40L auf den APCs zu einer Verstärkung der Immunreaktion führen können (CURTSINGER et al., 1999). Das Molekül CTLA-4 bin- det an CD80 bzw. CD86 und stellt einen negativen Regulator der Signalkaskade dar. Er- folgreich aktivierte CD4+ und CD8+ T-Zellen expandieren, erhöhen die Expression an Akti- vierungsmarkern wie CD69 und CD25 (α-Kette des IL-2-Rezeptors) und synthetisieren den autokrinen Wachstumsfaktor IL-2. Sie wandern in den inflammatorischen Bereich ein, um dort spezifische Effektorfunktionen auszuüben. Eine kleine Fraktion proliferierter T- Zellen entwickelt sich zu den so genannten Gedächtnis-T-Zellen.
Zytotoxische T-Zellen binden spezifisch über ihren TCR an Peptid-MHC-Klasse-I- Komplexe auf infizierten oder auch entarteten Zellen und zerstören diese mittels Induktion
von Apoptose. Dies kann durch die Expression von FasL auf ihrer Oberfläche erfolgen, der an Fas-Rezeptoren auf den Targetzellen bindet. Eine weitere Möglichkeit besteht in der Sekretion zytotoxischer Moleküle wie Perforin und Granzym, die eine Degradierung der DNA in den Zielzellen hervorrufen (SHRESTA et al., 1998).
CD4+ T-Zellen üben in erster Linie Helferfunktionen aus und unterhalten somit die spezifi- sche Immunantwort. Das Zytokinprofil, das durch aktivierte T-Zellen und durch Zellen in der direkten Umgebung der Entzündung gebildet wird, ist ausschlaggebend für die Art der Immunreaktion. Man unterscheidet eine TH1- von einer TH2-gerichteten Immunantwort.
TH1-Zellen synthetisieren IL-2, IL-12, IFN-γ und TNF-β und sind direkt in eine T-Zell- vermittelte Immunreaktion involviert, in deren Zusammenhang es zur Bildung von zytotoxi- schen T-Zellen kommt. Im Gegensatz dazu bilden TH2-Zellen IL-4, IL-5 und IL-10 und in- duzieren eine humorale, B-Zell-vermittelte Immunantwort. Durch die Bildung von IL-12 bzw. IL-10 üben beide Immunreaktionen einen negativen Einfluss aufeinander aus. Des Weiteren kann es durch regulatorische T-Zellen zur Hemmung von Effektor-T-Zellen kommen (REIS E SOUSA, 2001).
γ:δ T-Zellen werden zum unspezifischen Immunsystem gerechnet und bilden einen Anteil von 1-5 % aller Lymphozyten im peripheren Blut gesunder Personen. Der überwiegende Teil an γ:δ T-Zellen setzt sich aus einer Subpopulation von Zellen zusammen, die den γ9:δ2 TCR exprimiert. Die Reaktivität von γ:δ T-Zellen ist meist nicht MHC-restringiert und richtet sich gegen ein breites Spektrum an Antigenen. Hierzu zählen lösliche Liganden, die nicht von Peptiden abstammen, wie z.B. Phosphoantigene, Aminobiphosphonate und Al- kylamine, sowie aktivierte, viral infizierte oder maligne entartete Zellen (ESPINOSA et al., 2002).
2.4 Manipulation von antigenspezifischen T-Zellen in vitro
Eine in vitro-Amplifikation von antigenspezifischen T-Zellen kann einerseits ihrer Detekti- on, Quantifizierung und / oder näheren Charakterisierung dienen. Andererseits kann sie durchgeführt werden, um Effektorzellen z.B. für den klinischen Einsatz in der adoptiven Immuntherapie zu generieren (2.6.2.2).
Es ist möglich, Immunzellen spezifisch oder unspezifisch zur Proliferation anzuregen. Un- abhängig von der Art der Methode können als Ausgangsmaterial entweder gemischte Zellpopulationen oder zuvor aufgereinigte, spezifische T-Zellen eingesetzt werden.
Für die Aufreinigung werden verschiedene Methoden angewandt, die die Vitalität der Zel- len nicht beeinträchtigen dürfen. Eine Möglichkeit, lebende, antigenspezifische Zellen zu isolieren, besteht darin, sie mit dem gewünschten Antigen zu stimulieren. Die hierdurch hervorgerufene Hochregulierung von Aktivierungsmarkern, Sekretion von Zytokinen oder Degranulation kann dazu genutzt werden, antigenspezifische T-Zellen mittels funktioneller Assays zu detektieren. Eine andere Möglichkeit besteht in der Markierung spezifischer T- Effektorzellen mit Hilfe von MHC-Multimeren. Die anschließende Sortierung der detektier- ten T-Zellen erfolgt in beiden Fällen mittels FACS oder magnetischer Zellseparation (MACS). Die Durchführung von Verdünnungsreihen (limiting dilution assay) kann ebenfalls dazu genutzt werden, spezifische Zellklone aus einer gemischten Zellpopulation zu isolie- ren. Hierbei werden die Zellen zunächst vereinzelt und durch gezielte Stimulation zur Proli- feration angeregt. Angewachsene Zellklone können anschließend isoliert werden.
2.4.1 Antigenunabhängige Amplifikation von T-Zellen
Durch Zugabe mitogener Substanzen wie z.B. Phythämagglutinin (PHA) oder Concanava- lin A zur Zellkultur kann eine Vernetzung von Glykoproteinen an der Zelloberfläche und somit eine polyklonale, antigenunabhängige Aktivierung von Leukozyten induziert werden.
Eine weitere Möglichkeit, T-Zellen unspezifisch zu stimulieren, besteht in der Verwendung von Antikörpern, die gegen das T-Zellrezeptorkomplex-Molekül CD3 gerichtet sind. Sie werden häufig in Kombination mit Antikörpern eingesetzt, die an kostimulatorische Antige- ne, wie z.B. CD28, binden. Die Antikörper können sowohl in löslicher Form (RIDDELL und GREENBERG, 1990) als auch gebunden an feste Substrate wie Zellkulturplatten, Mikro- sphären oder Zellen eingesetzt werden, um eine optimale Quervernetzung der Zielstruktu- ren auf den Lymphozyten zu bewirken. Durch den Einsatz von hochdosiertem IL-2 in Kombination mit Anti-CD3-Antikörpern sowie feeder-Zellen (sog. „rapid expansion proto- col“) konnte eine ausreichende Anzahl an tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs) für den klinischen Einsatz gewonnen werden (DUDLEY et al., 2002). LEVINE et al. (1998) erziel- ten eine unspezifische Expansion von TIL-Kulturen und MHC-Tetramer-aufgereinigten T-
Lymphozyten durch Bindung muriner Anti-CD3- und Anti-CD28-Immunglobuline an mag- netische Partikel (Beads). Die Proliferation war jedoch primär auf CD4+ T-Zellen begrenzt, wohingegen CD8+ T-Zellen nur eingeschränkt expandierten und zudem nach zweiwöchi- ger Kultur bis zu 90 % ihrer Spezifität einbüßten (OELKE et al., 2003). GARLIE et al.
(1999) berichteten von einer Anreicherung von sowohl CD4+ als auch CD8+ T-Zellen nach Stimulation mit Antikörper-beladenen Beads.
In den Arbeiten von THOMAS et al. (2002) wurde anstelle von Beads die MHC-Klasse-I- negative Tumorzelllinie K562 eingesetzt. Durch Kopplung von Anti-CD28- und Anti-CD3- Antikörpern an den Fcγ-Rezeptor CD32, mit dem die Zellen zuvor transduziert wurden, konnte eine rapide und langanhaltende Expansion von CD4+ T-Zellen erreicht werden.
Durch zusätzliche Expression des kostimulatorischen Moleküls 4-1BBL an der Zelloberflä- che war ebenfalls eine Amplifikation zuvor aufgereinigter, antigenspezifischer CTLs mög- lich (MAUS et al., 2002). YAN et al. (2004) transfizierten humane K562- sowie murine Yac- 1-Zellen mit CD32 und 4-1BBL und konnten nach Beladung dieser Zellen mit Anti-Maus- CD3- und Anti-Maus-CD28-Antikörpern murine CD8+ T-Zellen unspezifisch zur Proliferati- on anregen.
2.4.2 Antigenspezifische Expansion von T-Zellen
Für den Erfolg einer adoptiven Immuntherapie spielt die Antigenspezifität transferierter T- Zellen eine entscheidende Rolle. In vivo wird eine Aktivierung naiver T-Zellen hervorgeru- fen, indem der T-Zellrezeptor spezifisch an einen Peptid-MHC-Komplex auf der Oberflä- che von professionellen APCs bindet. Um eine Proliferation antigenspezifischer T-Zellen in vitro zu erreichen, muss dieser in vivo ablaufende Prozess möglichst gut nachgeahmt werden. Hierfür bietet sich der Einsatz von DCs an. Sie können direkt aus dem Blut isoliert oder aus autologen Monozyten durch Inkubation mit spezifischen Zytokinen, wie IL-4 und GM-CSF, generiert werden (so genannte MoDCs). Nach Reifung und Beladung mit dem gewünschten Peptid können sie Effektor-T-Zellen spezifisch zur Expansion anregen (BANCHEREAU und STEINMAN, 1998; MACKENSEN et al., 2000; OELKE et al., 2000;
SANTIN et al., 2002; KASS et al., 2003; MEIDENBAUER et al., 2003).
Eine weitere Möglichkeit besteht im Einsatz autologer, aktivierter bzw. virustransduzierter B-Zellen (SCHULTZE et al., 1997; SUN et al., 2000; HOOGENDOORN et al., 2004) oder
in der Verwendung autologer T-Zellen. Letztere werden zwar nicht zu den professionellen APCs gezählt, sie weisen aber einige kostimulatorische Moleküle an ihrer Oberfläche auf (GAGLIARDI et al., 1995). Werden für die Gewinnung peptidspezifischer T-Zellen als Aus- gangsmaterial PBMCs eingesetzt, kann ebenfalls durch direkte Zugabe von Peptiden oder Proteinen eine gezielte Stimulation und Expansion erreicht werden (MANNERING et al., 1998; NOLTE et al., 2003). Für die hierbei erzielte Aktivierung antigenspezifischer T-Zellen scheinen DCs verantwortlich zu sein, die in geringen Mengen in den PBMCs enthalten sind. Zusätzlich wird von einer Beteiligung „fakultativer“ APCs, wie B-Zellen oder Monozy- ten, ausgegangen (MANNERING et al., 1998).
2.4.3 Expansion antigenspezifischer T-Zellen mit aAPCs
Die unter 2.4.2 beschriebene Verwendung autologer APCs ist jedoch mit einigen Nachtei- len verbunden. So können DCs nur in einem extrem kosten- und zeitintensiven sowie schwer zu standardisierenden Verfahren aus Vorläuferzellen hergestellt werden (OELKE et al., 2005b). Für ihre Generierung wird eine große Blutmenge benötigt, die bei schwer erkrankten Personen häufig nicht zur Verfügung steht. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass die Anzahl und Qualität der in vitro generierten DCs infolge vorangegangener Thera- pien mit Chemotherapeutika und Immunsuppressiva hoch variabel ist. Zudem konnte eine Beeinträchtigung der Funktionalität dieser Zellen allein aufgrund der Krebserkrankung festgestellt werden (GABRILOVICH, 2004; ORMANDY et al., 2006). Schließlich muss noch erwähnt werden, dass APCs permanent endogen prozessierte Proteine über MHC- Klasse-I-Moleküle an ihrer Oberfläche präsentieren. Dies birgt die Gefahr, dass nicht nur T-Zellen mit der gewünschten Spezifität, sondern auch autoreaktive CTLs in vitro generiert werden (OELKE et al., 2005b).
Für eine Expansion autologer, antigenspezifischer T-Zellen im klinischen Maßstab sind DCs aus den oben genannten Gründen nur eingeschränkt nutzbar. Als Alternative wurden so genannte künstliche antigenpräsentierende Zellen (aAPCs) entwickelt. Sie sollen die Eigenschaften der DCs bzgl. Antigenprozessierung und -präsentation möglichst gut imitie- ren, um eine hohe Anzahl funktionsfähiger T-Zellen innerhalb kürzester Zeit zu generieren.
Im Gegensatz zu autologen DCs sollte ihre Herstellung und Anwendung kostengünstig, reproduzierbar und anpassungsfähig sein. Optimal wären „ready-to-use“ aAPCs, die bei
jedem Patienten eingesetzt werden können und zu einer selektiven Expansion spezifi- scher und therapeutisch potenter T-Zellen führen (KIM et al., 2004). Weiterhin wäre von Vorteil, wenn sie die für den klinischen Einsatz erforderlichen GMP-Richtlinien (good ma- nufacturing practices) erfüllen würden.
Mit aAPCs können T-Zellen einerseits antigenunspezifisch expandiert werden. So wurden Antikörper-beladene Beads oder transfizierte K562-Zellen für die Vermehrung von CD4+ bzw. CD8+ T-Zellen in vitro eingesetzt (2.4.1). Andererseits kann durch gezielte Modifikati- on der Substrate ebenfalls eine antigenspezifische Expansion von Effektorzellen erreicht werden. Je nach verwendetem System können zellbasierte von azellulären aAPCs unter- schieden werden. Zelluläre Techniken wurden auf der Basis von Insektenzellen, Maus- fibroblasten und humanen leukämischen Zelllinien (K562-Zellen) entwickelt.
Ausgehend von der von SUN et al. (1996) abstammenden Idee, Insektenzellen als aAPCs zu verwenden, transfizierten MITCHELL et al. (2002) eine aus dem Insekt Drosophila me- lanogaster abstammende Zelllinie mit den Molekülen CD80, ICAM-1 und HLA-A2 und überprüften deren Funktionalität nach exogener Beladung mit dem Tumorantigen Tyrosi- nase. Sie konnten eine Expansion antigenspezifischer CTLs beobachten, die jedoch ab- hängig von der Anwesenheit zusätzlicher, autologer PBMCs war. Mausfibroblasten konn- ten ebenfalls in potente aAPCs umgewandelt werden, indem sie mit den drei kostimulato- rischen Molekülen CD80, ICAM-1 und LFA-3 transduziert wurden. Die Expression von vi- ralen Peptiden (Influenza Matrixprotein) oder Tumorantigenen (MART-1, gp100) erfolgte nach intrazellulärer Beladung über HLA-A2-Moleküle (LATOUCHE und SADELAIN, 2000).
Die Mausfibroblasten waren außerdem in der Lage, Proteine, wie z.B. das CMV-Protein pp65, intrazellulär zu prozessieren und an ihrer Oberfläche über HLA-A2 zu präsentieren.
Mit diesen aAPCs konnte eine rapide Expansion CMV-spezifischer T-Zellen erzielt werden (PAPANICOLAOU et al., 2003).
Ausgehend von der Idee, synthetische Oberflächen mit bestimmten Molekülen zu beladen und anschließend als künstliche APCs einzusetzen (GOLDSTEIN und MESCHER, 1986), wurden verschiedene, azelluläre Technologien entwickelt, um T-Zellen in vitro zur Expan- sion anzuregen. Unter anderem handelt es sich hierbei um Beads, Vesikel und Exosomen.
Eine Bead-basierte Methode wurde von THAM et al. (2001) veröffentlicht. Sie koppelten die kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 zusammen mit einem murinen MHC-
Klasse-I-single chain-Konstrukt an die Oberfläche von Latex-Mikrosphären. Nach Bindung des Peptids Ovalbumin (OVA) wurde in einem transgenen Mausmodell gezeigt, dass die- se aAPCs in der Lage sind, OVA-spezifische T-Zellen zu stimulieren.
Die von OELKE et al. (2003) entwickelten aAPCs wiesen als Grundgerüst magnetische Partikel auf, an die, neben Anti-CD28-Antikörpern, MHC-Klasse-I-Immunglobulin-Fusions- Moleküle (HLA-A2-Ig) gebunden wurden. Mit diesen Partikeln war es möglich, nach exter- ner Beladung mit Peptiden, CD8+ T-Zellen zu amplifizieren. Die generierten CTLs wiesen eine hohe Spezifität gegenüber den klinisch relevanten Peptiden CMVpp65 und MART-1 auf. Verglichen mit Anti-CD3 / Anti-CD28-beladenen Beads, die in der Lage waren, zuvor isolierte, antigenspezifische CTLs zu expandieren, besaßen diese peptidbeladenen Beads eine größere stimulatorische Kapazität (OELKE et al., 2005b).
WALTER et al. (2003) koppelten rekombinante MHC-Moleküle zusammen mit Anti-CD28- Ig biochemisch an Mikrosphären und konnten durch genaue Kontrolle der MHC-Dichte antigenspezifische CTLs mit unterschiedlich hoher Avidität erzeugen.
Die Idee, Liposomen oder Exosomen als aAPCs zu benutzen, geht auf die Beobachtung zurück, dass eine flexible biologische Zellmembran für die Ausbildung einer immunologi- schen Synapse essentiell ist (KIM et al., 2004). PRAKKEN et al. (2000) integrierten MHC- Klasse-II-Moleküle in aus Cholesterol und Phospholipiden bestehende Liposome. Durch Bindung relevanter Peptide konnten antigenspezifische, murine CD4+ T-Zellen zur Prolife- ration angeregt werden.
Exosomen sind von Zellen abstammende Vesikel, die nach der Fusion von Endosomen mit der Zellmembran freigesetzt werden. Je nach Ursprungszelle können sie MHC-Klasse- I- und / oder -Klasse-II- sowie kostimulatorische Moleküle enthalten. Eine Stimulation von T-Zellen durch exogene Beladung aufgereinigter Exosomen mit Peptiden konnte gezeigt werden (HWANG et al., 2003; CHAPUT et al., 2005).
Mittels aAPCs generierte T-Zellen wurden bereits in einigen klinischen Studien eingesetzt (KIM et al., 2004).
2.5 Nachweis von antigenspezifischen T-Zellen
T-Zellen, denen das Antigen über MHC-Komplexe präsentiert wird, werden spezifisch akti- viert und reagieren mit einer messbaren T-Zellantwort. Diese äußert sich in Form von Ex- pression bestimmter Aktivierungsmarker auf der Zelloberfläche, Synthese von Zytokinen, Proliferation, Degranulation, Zytotoxizität und / oder trogocytosis (siehe unten) und kann mittels funktioneller Testverfahren erfasst werden. Hierzu gehört der Nachweis der Aktivie- rungsmarker CD25, CD69 sowie, im Fall humaner Lymphozyten, HLA-DR mittels Immun- fluoreszenz. Synthetisierte Zytokine, wie z.B. IFN-γ, können quantitativ mittels Sandwich- ELISA oder auf mRNA-Ebene mittels real time PCR nachgewiesen werden.
Methoden, um die von antigenspezifischen T-Zellen sezernierten Proteine nach Antigen- kontakt auf Einzelzellebene zu detektieren, sind der ELISPOT (enzyme-linked immu- nospot)-Assay, der intrazelluläre Zytokin-Assay sowie der capture assay.
Die Zellproliferation stellt ebenfalls einen sehr wichtigen in vitro-Parameter für die in vivo- Funktionalität zytotoxischer T-Zellen dar. Ihre Bestimmung kann unter anderem mit Hilfe eines Thymidin- oder CFSE-Assays erfolgen.
Zur Untersuchung der zytotoxischen Aktivität generierter Effektor-T-Zellen eignet sich der
51Chromium-Freisetzungsversuch (51Cr release assay). Weiterhin kann die Degranulation antigenspezifischer CTLs als Parameter zur Bestimmung ihrer Funktionalität dienen. Frei- gesetztes Perforin oder Granzym sowie an der Oberfläche exprimierte Proteine wie CD107a/b können mittels Durchflusszytometrie detektiert werden.
Bei dem als trogocytosis bezeichneten Phänomen findet ein Transfer von Membranbe- standteilen der APC auf die T-Zelle statt. Durch Kopplung von GFP an die HLA-Moleküle der Targetzelle können somit antigenspezifische T-Zellen erkannt werden (TOMARU et al., 2003).
Zur reinen Bestimmung der Antigenspezifität von Effektor-T-Zellen finden multimere MHC- Peptid-Moleküle Anwendung. Hierzu gehören z.B. MHC-Tetramere, die antigenspezifische CTLs mit hoher Affinität binden können.
2.6 Tumorimmunologie
In der westlichen Welt stellen Tumoren nach Erkrankungen des Herzkreislaufsystems beim Menschen die Haupttodesursache dar. Auch in der Veterinärmedizin hat die Onkolo- gie aufgrund der erhöhten Lebenserwartung der in der Obhut des Menschen lebenden Haustiere zunehmend an Bedeutung gewonnen. Die Ätiologie der Krebserkrankungen ist vielfältiger Natur. So spielen neben exogenen Faktoren wie chemische, physikalische und infektiöse (virale) Noxen auch endogene Faktoren wie z.B. Alter, Geschlecht sowie familiä- re Disposition eine entscheidene Rolle. Die klassischen Behandlungsmethoden sind Che- motherapie, Bestrahlung und chirurgische Entfernung der Geschwulst. Ein großer Nachteil dieser Therapien besteht darin, dass sie mit extremen Nebenwirkungen verbunden sind.
Weiterhin ist der Behandlungserfolg in vielen Fällen nur unzureichend. Aufgrund dieser Problematiken wird nach neuen Strategien gesucht, Tumoren zu bekämpfen. Große Hoff- nung wird dabei auf die Tumorimmunologie gesetzt. Sie befasst sich mit der Erforschung von Immunreaktionen gegen Malignome. Ihr Ursprung geht auf den Chirurgen WILHELM COLEY zurück, der im späten 19. Jahrhundert feststellte, dass die Stimulation des Im- munsystems mit pyogenen Bakterien zu einer Regression von Tumoren führen kann (COLEY, 1893). PAUL EHRLICH stellte als Erster die Vermutung auf, dass das Immun- system den Wirt vor der Entstehung von Neoplasien schützen kann. Diese Vorstellung wurde mehr als 50 Jahre später formal als Immunüberwachungs-Hypothese bezeichnet (THOMAS, 1959; BURNET, 1970). Sie beinhaltet, dass Krebserkrankungen mit einer ähn- lichen Häufigkeit wie Infektionen mit pathogenen Erregern auftreten und dass das Immun- system diese entarteten Zellen aufgrund der Expression von tumorassoziierten Antigenen erkennen und eliminieren kann. Trotz anfänglich starker Debatten unterstützen Ergebnisse neuerer Studien mehr und mehr die Ansicht von THOMAS und BURNET, dass das Im- munsystem eine wichtige Rolle bei der Kontrolle maligner Erkrankungen spielt (SHANKARAN et al., 2001b; DUNN et al., 2002; DARNELL und POSNER, 2003). So konnten vereinzelt spontane Regressionen von Tumoren in immunkompetenten Individuen beobachtet werden. Immunkompromitierte Organismen wiesen hingegen eine erhöhte In- zidenz an Krebserkrankungen auf. Weiterhin konnten in experimentellen Mausmodellen Immunreaktionen gegen Tumoren demonstriert werden. Beispielsweise ist die Empfäng- lichkeit von Mäusen mit definierten immunologischen Defekten gegenüber spontanen oder
induzierten Tumoren deutlich erhöht. Werden solche Tumorzellen in normale Tiere (Wild- typ-Mäuse) transplantiert, kommt es in der Regel zu ihrer Abstoßung (SHANKARAN et al., 2001a). Die gegen die Immunüberwachungs-Hypothese sprechende Tatsache, dass Nacktmäuse, die ein defizientes adaptives Immunsystem aufweisen, keine erhöhte Tumo- rinzidenz aufweisen (STUTMAN, 1974), konnte inzwischen durch das Vorhandensein IFN- γ-produzierender Zellen des angeborenen Immunsystems, wie z.B. NK-Zellen, in diesen Tieren erklärt werden (DUNN et al., 2004). ZHANG et al. (2003) stellten fest, dass eine Akkumulation von Immunzellen im Bereich des Tumors mit einer verbesserten Prognose für den Patienten korreliert. Schließlich konnten durch verbesserte Technologien Immun- reaktionen gegen Tumoren direkt am Patienten nachgewiesen werden. Zusammenfas- send sprechen zahlreiche bisherige Untersuchungen dafür, dass die Tumorentwicklung durch Komponenten des Immunsystems kontrolliert oder wenigstens beeinflusst werden kann. Die Induktion einer tumorspezifischen Immunantwort resultiert aus dem komplexen Zusammenspiel von APCs, CTLs, T-Helferzellen, Antikörper-produzierenden B-Zellen und Effektorzellen des angeborenen Immunsystems wie NK-Zellen, NKT und γ:δ T-Zellen, die transformierte Zellen erkennen und zerstören können (SMYTH et al., 2001). T-Zellen wird hierbei eine dominierende Rolle zugesprochen. So konnte gezeigt werden, dass ein Groß- teil aller humanen Tumoren von TILs infiltriert wird.
2.6.1 Tumorantigene
Arbeiten von PREHN und MAIN Ende der 50er Jahre schufen die Grundlage für die Hoff- nung, T-Zellen im Kampf gegen Tumoren einsetzen zu können. Sie zeigten, dass Mali- gnome spezifisch von CD8+ T-Zellen abgestoßen werden können, indem sie Tumorzellen, die aus Mäusen mit chemisch induzierten Karzinomen isolierte wurden, subkutan in syn- gene Tiere transplantierten. In Rezipienten kam es zum Auswachsen des Transplantati- onstumors, während er im Donor abgestoßen wurde. Wurden jedoch vor Injektion der Tu- morzellen CD8+ T-Zellen der Donormäuse in die syngenen Tiere transferiert, kam es zur Abstoßung der Tumorzellen. Diese Protektion war tumorspezifisch (PREHN und MAIN, 1957). Daraus resultierend wurde vermutet, dass Tumoren Antigene exprimieren, die von tumorspezifischen T-Zellen erkannt werden können. Diese Antigene wurden als Tumoran-
tigene bezeichnet. Sie werden sowohl von den Tumorzellen selbst als auch von speziali- sierten, antigenpräsentierenden Zellen präsentiert. Welche Antigene T-Zellen auf Tumoren erkennen, wurde erst Anfang der 90er Jahre entdeckt (PARDOLL, 1994; TSOMIDES und EISEN, 1994; BOON et al., 1995; VAN DEN EYNDE und VAN DER BRUGGEN, 1997).
Ihre Identifizierung erfolgte zumeist entweder mit der biochemischen oder der genetischen Methode. Grundlage hierfür waren tumorspezifische T-Zellklone, die als sensitives Detek- tionsmittel dienten. Sie wurden generiert, indem T-Zellen aus Blut, Lymphknoten oder Tu- moren isoliert und mit Tumorzellen desselben Patienten kokultiviert wurden.
Beim biochemischen Ansatz (COX et al., 1994) wird durch Säurebehandlung eine Elution der Peptide vom MHC-Klasse-I-Molekül der Tumorzellen bewirkt und der Peptid-Pool nach Fraktionierung mittels HPLC auf Zielzellen geladen, die ein passendes MHC-Molekül tra- gen. Durch den anschließenden Einsatz von tumorspezifischen T-Zellklonen kann über- prüft werden, ob die Zielzellen durch die Peptidbeladung sensitiv für eine Lyse geworden sind. Die AS-Sequenz kann anschließend durch Massenspektroskopie festgestellt werden.
Die genetische Methode (BOON et al., 1989; VAN DER BRUGGEN et al., 1991) beruht auf der Herstellung einer cDNA-Bibliothek von einer Tumorzelle. Die cDNA-Pools werden nachfolgend in Zielzellen eingebracht, die die entsprechenden MHC-Allele exprimieren.
Eine Lyse der Transfektanten durch in vitro generierte, autologe CTLs kann nach Subfrak- tionierung zur Isolierung einer einzelnen cDNA führen.
Eine alternative Technik zur Identifizierung von Tumorantigenen stellt die serologische Analyse von rekombinanten cDNA-Expressionsbibliotheken mit autologen Antikörpern (SEREX) dar (SAHIN et al., 1995). Ein Tumorantigen, das auf diese Weise identifiziert werden konnte, ist das zuerst beim Oesophaguskarzinom entdeckte Antigen NY-ESO-1 (CHEN et al., 1997b; GRETEN und JAFFEE, 1999).
Eine Analyse des Genprofils überexprimierter DNA-Produkte in neoplastischen Zellen durch Microarray-basierte Studien ist eine weitere Möglichkeit zur Identifikation potentieller Zielantigene in Tumoren unterschiedlichen Ursprungs (MOHR et al., 2002).
Tumorantigene können grob in zwei Klassen unterteilt werden. Zur ersten Klasse werden Antigene gerechnet, die selektiv auf Tumorzellen, nicht jedoch auf normalen, somatischen Zellen exprimiert werden. Sie sind streng tumorspezifisch und werden in mutierte Antigene sowie von Viren abstammende Antigene eingeteilt. Erstere gehen aus Punktmutationen
