Generierung antigenspezifischer CD8 + T-Zellen aus Tumorpatienten

Es hat sich herausgestellt, dass eine Expansion antigenspezifischer Effektor-T-Zellen aus Krebspatienten mit Hilfe von autologen DCs nur eingeschränkt möglich ist. Dies liegt dar-an, dass die Funktionalität von professionellen APCs und / oder Lymphozyten einerseits aufgrund der Krebserkrankung selbst und andererseits aufgrund einer Behandlung der Patienten mit Chemotherapeutika eingeschränkt ist (GABRILOVICH, 2004; MACARY et al., 2006; ORMANDY et al., 2006). So beschrieben beispielsweise ROSKROW et al.

(1998) eine deutlich reduzierte Expansionsrate EBV-spezifischer T-Zellen aus PBMCs krebskranker Personen im Vergleich zu gesunden Spendern. Ausgehend hiervon wurden die hergestellten aAPCs auf ihre Fähigkeit überprüft, M1-spezifische T-Zellen aus PBMCs immunsupprimierter Patienten mit fortgeschrittenem, gastrointestinalen Karzinom zu gene-rieren.

Nach einwöchiger Inkubation mit Daudi M1-SC-Zellen konnten in der generierten Zellpo-pulation aller fünf getesteten Patienten M1-spezifische, CD8⁺ T-Zellen detektiert werden, wobei zwischen den Spendern deutliche Unterschiede bestanden (Abb. 45). Erwartungs-gemäß lag der Prozentanteil M1-spezifischer T-Zellen im Mittel unterhalb des Wertes, der bei gesunden Spendern durch Stimulation mit M1-beladenen, autologen PBMCs gemes-sen werden konnte (0,99 % versus 4,9 %). Daudi M1-SC-Zellen wiegemes-sen eine mit autologen DCs vergleichbare, wenn nicht sogar bessere, stimulatorische Kapazität auf. Dies konnte anhand zweier Krebspatienten nachgewiesen werden. Die generierten Effektorzellen zeig-ten ebenfalls Funktionalität in Form von IFN-γ-Sekretion (Abb. 46). Somit waren die Pep-tid-SC-Zellen in der Lage, M1-reaktive CTLs aus PBMCs schwer erkrankter, unter palliati-ver Chemotherapie stehender Spender zu generieren.

In den vorangegangenen Experimenten wurde gezeigt, dass die hergestellten aAPCs die Fähigkeit aufweisen, M1-spezifische Gedächtniszellen aus PBMCs gesunder sowie krebs-kranker, immunsupprimierter Spender effektiv zu stimulieren. Für eine erfolgreiche Tumor-Immuntherapie ist es allerdings wünschenswert, malignomreaktive Effektorzellen aus dem T-Zellrepertoire zur Expansion anzuregen. Dies hat sich in den vergangenen Jahren je-doch als große Herausforderung dargestellt, was zum einen auf eine sehr geringe Anzahl an tumorspezifischen Vorläuferzellen zurückzuführen ist. Diese Zellen werden durch die in der Ontogenese stattfindende, klonalen Deletion aus dem T-Zellpool entfernt. Zum ande-ren überleben im Rahmen der negativen Selektion zumeist nur solche T-Zellen, die eine geringe Affinität gegenüber dem Selbst-Antigen aufweisen (YEE et al., 1999). Da die po-tentiell tumorreaktiven T-Zellen häufig aus dem Gedächtnis-T-Zellpool abstammen, weisen sie zudem eine eingeschränkte, replikative Kapazität auf. Hieraus resultiert eine schwere Stimulierbarkeit in vitro und somit eine eingeschränkte Langzeit-Expansion dieser Zellen (VERRA et al., 2004). Um eine für den klinischen Einsatz ausreichende Anzahl malignom-reaktiver Lymphozyten mit hoher Spezifität, Affinität sowie Funktionalität zu generieren, müssen die verwendeten APCs eine hohe stimulatorische Kapazität aufweisen. Zudem müssen optimale in vitro-Bedingungen geschaffen werden.

In dieser Arbeit wurde versucht, tumorantigenspezifische T-Zellen aus Patienten mit hepa-tozellulärem Karzinom zu generieren. Dazu wurden aAPCs synthetisiert, die die tumoras-soziierten Antigene AFP bzw. NY-ESO-1 an ihrer Oberfläche exprimieren.

AFP wird zur Gruppe der onkofetalen Proteine gerechnet (2.6.1). Seine Expression konnte in 80 % aller HCC-Patienten nachgewiesen werden (BUTTERFIELD et al., 2003). Bislang wurden vier immundominante, HLA-A2-restringierte Epitope identifiziert, mit denen AFP-spezifische T-Zellen aus PBMCs gesunder Spender stimuliert werden konnten (BUTTERFIELD et al., 1999; BUTTERFIELD et al., 2001). Dies gibt einen Hinweis darauf, dass, trotz hoher Plasmalevel während der Embryogenese, keine vollständige klonale De-letion potentiell AFP-spezifischer T-Zellen aus dem T-Zellpool stattfindet (BUTTERFIELD et al., 2003). VOLLMER et al. (1999) gelang es, durch DNA-Vakzinierung eine AFP-spezifische Immunantwort in Mäusen zu induzieren.

NY-ESO-1 ist ein Tumor / Testis-Antigen (2.6.1), das von 30 % aller HCC-Tumoren expri-miert wird (CHEN et al., 2001). In einer signifikanten Anzahl von HCC-Patienten konnte sowohl eine zelluläre als auch humurale, NY-ESO-1-spezifische Immunantwort detektiert werden (KORANGY et al., 2004). Durch einwöchige in vitro-Stimulation mit autologen, peptidbeladenen PBMCs gelang es der gleichen Gruppe, NY-ESO-1-reaktive, CD8⁺ T-Zellen aus fünf von sechs NY-ESO-1-serumpositiven HCC-Patienten zu generieren.

Die synthetisierten aAPCs wurden in dieser Arbeit mit PBMCs verschiedener HCC-Patienten inkubiert, wobei deren AFP- bzw. NY-ESO-1-Serumlevel nicht bekannt war.

Nach einwöchiger Stimulation solcher PBMCs mit Daudi AFP-SC-Zellen konnte in zwei von neun getesteten HCC-Patienten eine AFP-spezifische T-Zellantwort hervorgerufen werden. Die generierten CD3⁺CD8⁺ T-Zellen wiesen die Fähigkeit auf, nach Antigenkon-takt spezifisch IFN-γ zu sezernieren. Eine solche, tumorantigenspezifische Immunreaktion konnte ebenfalls in einem von vier getesteten Krebspatienten durch einwöchige Inkubation mit Daudi NY-ESO-SC-Zellen nachgewiesen werden. Der Anteil NY-ESO-reaktiver CTLs erhöhte sich deutlich, wenn die Zellen über weitere zwei Wochen mit denselben aAPCs stimuliert wurden. Die hohe IFN-γ-Sekretion CD3⁺CD8^- T-Zellen in diesem Experiment ist auf die Verwendung von Daudi Peptid-SC-Zellen als Targets im intrazellulären Zytokin-Assay zurückzuführen. Sie lässt sich durch eine unspezifische Stimulierung von in der gemischten Kultur befindlichen Effektorzellen durch Daudi M1-SC- bzw. Daudi AFP-SC-Zellen erklären.

Aus diesen Ergebnissen lässt sich schließen, dass die hergestellten aAPCs in der Lage waren, eine Aktivierung und Expansion von AFP- bzw. NY-ESO-1-spezifischen T-Zellen

zu induzieren. Allerdings konnte lediglich in einem geringen Anteil der getesteten Perso-nen eine schwache, antigenspezifische Immunantwort induziert werden. Eine Erklärung hierfür könnte sein, dass nicht alle Patienten Reaktivität gegenüber den tumorassoziierten Antigenen AFP und NY-ESO-1 aufweisen. So konnte eine Expression dieser tumorassozi-ierten Antigene nur in 80 % bzw. 30 % aller HCC-Patienten nachgewiesen werden. In NY-ESO-1-serumnegativen Krebspatienten sowie gesunden Spendern konnte hingegen keine antigenspezifische Immunantwort detektiert werden (KORANGY et al., 2004).

Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass die gestesteten Patienten entweder eine zu weit fortgeschrittene Tumorerkrankung aufwiesen oder, bei serumpositiven Patienten, eine NY-ESO-1-spezifische Immunantwort gegen ein anderes Eptitop ausgebildet hatten (KORANGY et al., 2004).

Da für eine adäquate Stimulierung von CTLs mit geringer Affinität hochpotente APCs be-nötigt werden, könnte der Grund für den relativ geringen Prozentanteil an tumorspezifi-schen T-Zellen nach Inkubation mit Daudi Peptid-SC-Zellen ebenfalls in einer zu geringen stimulatorischen Kapazität dieser aAPCs gelegen haben. Allerdings muss in diesem Zu-sammenhanghang berücksichtigt werden, dass eine Expansion tumorreaktiver T-Zellen aus den oben genannten Gründen sehr schwierig ist, und bislang keinerlei Veröffentli-chungen über eine für den adoptiven Transfer ausreichende Aktivierung und Expansion AFP- bzw. NY-ESO-1-spezifischer CTLs aus HCC-Patienten vorliegen.