Immunfluoreszenz und Durchflusszytometrie

Untersuchung der Immunfluoreszenz mittels Fluoreszenzmikroskop

In dieser Arbeit erfolgte die Transfektion eukaryontischer Zellen mit so genannten Fusi-onskonstrukten, bei denen die Peptid-SC- bzw. Influenza M1-Sequenz kovalent an EGFP gekoppelt wurde. EGFP ist ein grünfluoreszierendes Protein, das eine Variante des aus der Qualle Aequorea victoria isolierten GFP darstellt. Durch seine Verwendung können plasmidtragende Zellen als solche im Fluoreszenzmikroskop erkannt werden. Das Prinzip der Fluoreszenzmikroskopie besteht darin, dass der entsprechende Farbstoff durch Licht einer bestimmten Wellenlänge (495 nm) angeregt und das abgetrahlte Licht, das im Be-reich des sichtbaren Spektrums liegt, durch einen selektiven Filter zum Betrachter geleitet wird. Mit Hilfe einer Digitalkamera können die Bilder abfotografiert und auf einen Computer übertragen werden.

Durchflusszytometrie

Die fluoreszenzaktivierte Zellanalyse (FCM-Analyse) ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Oberflächenmolekülen und intrazellulären Proteinen. Grundlage ist die Antigen-Antikörper-Reaktion, die mit Fluoreszenzfarbstoff-markierten Antikörpern durchge-führt wird. Zur Analyse werden die Zellen in einer Einzelzellsuspension durch hydrodyna-mische Fokussierung an einem gebündelten Argonlaserstrahl vorbeigeleitet. Bei exakter Anregung der Elektronen des Fluoreszenzfarbstoffes durch den monochromatischen La-serstrahl werden diese auf ein höheres Energieniveau gehoben und fallen anschließend unter Abgabe von Energie in Form von Photonen auf ihr Ursprungsniveau zurück. Die emittierte Photonenkonzentration, die durch einen Photodetektor registriert und nach Ver-stärkung zuerst in ein elektrisches und anschließend in ein digitales Signal umgewandelt wird, verhält sich proportional zur Menge an gebundenen Antikörpern pro Zelle. Eine gleichzeitige Messung mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen ist möglich, weil sich die eingesetzten Farbstoffe zwar bei einer gemeinsamen Wellenlänge anregen lassen aber über unterschiedliche, für den jeweiligen Farbstoff charakteristische Emmissionsspektren

verfügen. Die Emission kann entsprechend ihrer Wellenlänge von vier verschiedenen Ka-nälen des FACSCalibur erfasst werden: Kanal 1 (Fl 1): Emissionsmaximum 530 nm (z. B.

FITC, GFP); Kanal 2 (Fl 2): Emissionsmaximum 585 nm (z. B. PE); Kanal 3 (Fl 3): Emissi-onsmaximum 670 nm (z. B. Cy5-PE, PI, 7AAD); Kanal 4 (Fl 4): EmissiEmissi-onsmaximum 661 nm (z. B. APC).

Zusätzlich werden durch die Lichtbeugung und -streuung Informationen über die Zellgröße und die Binnenstruktur der Zelle gewonnen, was eine Identifikation unterschiedlicher Zell-populationen (z.B. Lymphozyten, Makrophagen) ermöglicht. Das in einem geringen Winkel gestreute Licht wird als Vorwärtsstreuung (FSC) erfasst und durch die Zellgröße beein-flusst. Im rechten Winkel dazu kann die Seitwärtsstreuung (SSC) registriert werden, deren Stärke vom Grad der zellulären Granularität und Komplexität abhängig ist.

Mit Hilfe der Software „Cell Quest“ erfolgte die computergestützte Auswertung der Daten.

Die Ergebnisse wurden mehrparametrisch als korrelierte Punktediagramme (Dot Plots) oder Histogramme dargestellt. Zur Definition einzelner Untergruppen der Messereignisse (Events) wurden nach der Messung softwaregestützt elektronische „Fenster“ (Gates) ge-setzt und zum Teil mehrere Fenster logisch miteinander verknüpft. Anhand der Negativpo-pulation wurden im Dot Plot Quadranten festgelegt, wobei UR (upper right) die obere rech-te, UL (upper left) die obere linke, LR (lower right) die untere rechte und LL (lower left) die untere linke Population beschreibt.

In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Zellen hinsichtlich ihrer Expression be-stimmter Oberflächenmoleküle sowie intrazellulärer Zytokine untersucht. Neben der Ober-flächen-FCM-Analyse wurde der zytoplasmatische Gehalt an IFN-γ mittels intrazellulärer FCM-Analyse bestimmt. Die bei den verschiedenen Messungen verwendeten Antikörper wurden unter 3.1.7 aufgelistet. Sie wurden vor Verwendung austitriert, um ihre optimale Konzentration zu ermitteln. Zur Bestimmung des Prozentanteils peptidspezifischer Zellen in der T-Zellpopulation sowie der Anzahl peptidspezifischer T-Zellen in der Gesamtpopula-tion wurden die nachfolgend aufgeführten Formeln eingesetzt:

UR=13,3%

5,8x10⁶ 19,6%

CD3+CD8+

IFN-γγγγ

% peptidspez. T-Zellen in CD3⁺CD8⁺ Zellpopulation= 100 / (UR (%) + LR (%)) x UR

Anzahl Peptid-spezifischer CD3⁺CD8⁺Zellen= Zellzahl (total) x UR (%) / 100 UR=13,3%

5,8x10⁶ 19,6%

CD3+CD8+

IFN-γγγγ

% peptidspez. T-Zellen in CD3⁺CD8⁺ Zellpopulation= 100 / (UR (%) + LR (%)) x UR

Anzahl Peptid-spezifischer CD3⁺CD8⁺Zellen= Zellzahl (total) x UR (%) / 100

Oberflächen-FCM-Analyse

Die FCM-Analyse von Zelloberflächenmolekülen wurde in 96-Rundbodenmikrotiterplatten durchgeführt. Nach Bestimmung der Zellzahl (pro Ansatz wurden in der Regel 1 x 10⁵ bis 5 x 10⁵ Zellen eingesetzt) wurden die Zellen zweimal mit FACS-Puffer gewaschen und anschließend mit den entsprechenden Antikörpern für 30 min im Dunkeln auf Eis inkubiert.

Nichtgekoppelte Antikörper wurden durch zweimaliges Waschen mit FACS-Puffer und an-schließende Zentrifugation (2 min, 400 x g) entfernt. Durch Verwendung von Isotypen-kontrollen wurden unspezifische Bindungen des jeweiligen Antikörpers ausgeschlossen.

Bei unkonjugierten, primären Antikörpern erfolgte nun die Zugabe des sekundären, fluo-reszierenden Anti-Immunglobulins zu den Zellen (indirekte Immunfluoreszenz). Hinter-grundfärbung wurde durch alleinige Addition des sekundären Antikörpers bestimmt. Nach 30-minütiger Inkubation wurden die Zellen erneut gewaschen und in je 200 µl FACS-Puffer überführt. Zum Ausschluss toter Zellen erfolgte anschließend die Zugabe von 7AAD zu den Proben.

Bestimmung der Peptidspezifität mittels Pentamer-Färbung

Bei der Färbung mit multimeren MHC-Molekülen handelt es sich um eine sensitive Metho-de zur IMetho-dentifizierung von antigenspezifischen T-Zellen (ALTMAN et al., 1996). Sie beruht auf der spezifischen Bindung von T-Zellen an ihren Peptid-MHC-Komplex. Durch die Ver-wendung von MHC-Multimeren können mehrere TCR-Moleküle gleichzeitig gebunden

werden, was zu einer stabilen Interaktion mit der Effektor-T-Zelle führt. Klassischerweise werden für die Quantifizierung von peptidspezifischen T-Zellen so genannte MHC-Tetramere eingesetzt. Sie werden hergestellt, indem lösliche, humane MHC-Klasse-I-Moleküle mit unterschiedlichen Systemen exprimiert und nach Reinigung, Anreicherung und Biotinylierung mit antigenspezifischen Peptiden gekoppelt werden. Anschließend er-folgt eine Tetramerisierung mit Hilfe von Streptavidin. Die entstandenen, peptidspezifi-schen MHC-Tetramere können mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert und direkt für die Analyse im Durchlußzytometer eingesetzt werden. Die in dieser Arbeit verwendeten MHC-Pentamere stellen eine Weiterentwicklung der tetrameren Moleküle dar. Sie bestehen aus fünf MHC-Peptid-Komplexen, die über eine spezifische Domäne multimerisiert werden.

Durch ihre spezielle Konfiguration sind alle fünf MHC-Peptid-Komplexe in der Lage, an einen TCR zu binden. Dies führt zu einer stabilen Interaktion mit hoher Avidität.

Pro Ansatz wurden 3 x 10⁵ Zellen in FACS-Puffer aufgenommen, zentrifugiert und an-schließend das Pellet mit 30 µl des verdünnten, fluoreszenzmarkierten MHC-Peptid-Pentamer-Komplexes versetzt. Nach einer 15-minütigen Inkubation im Dunkeln bei RT wurden die Zellen zweimal gewaschen und nachfolgend mit einem gegen humanes CD8 gerichteten, verdünnten Oberflächen-Antikörper gefärbt. Das Färbevolumen betrug eben-falls 30 µl. Nach 20-minütiger Inkubation bei 4 °C w urden die Zellen gewaschen, in 180 µl FACS-Puffer aufgenommen und im FACSCalibur-Durchflusszytometer analysiert. Der Ausschluss toter Zellen erfolgte mit Hilfe von 7AAD.

IFN-γ-Bestimmung mittels intrazellulärer FCM-Analyse

Die Durchflusszytometrie bietet zusammen mit neuen Techniken für intrazelluläre Zytoki-nanfärbung die Möglichkeit, antigenspezifische T-Zellen genauer zu charakterisieren (JUNG et al., 1993). T-Zellen, die spezifisch aktiviert werden, produzieren nach Erkennung ihres Antigens verschiedene Zytokine, wie z.B. IFN-γ. Diese Reaktion stellt einen ersten Schritt in der zellulär vermittelten Immunantwort dar. Mittels Durchflußzytometrie können die antigenspezifischen T-Zellen phänotypisch auf Einzelzellebene charakterisiert werden.

Die zu testenden Zellen werden zunächst zur spezifischen Zytokinproduktion angeregt, indem sie mit antigenpräsentierenden Targetzellen, die das entsprechende Peptid an ihrer Oberfläche tragen, stimuliert werden. Während der Inkubation wird dem Medium Brefeldin

A zugefügt. Brefeldin A bewirkt eine Hemmung des Proteintransportes in der Zelle und induziert somit eine intrazelluläre Anreicherung synthetisierter Zytokine. Durch Parafor-maldehyd werden die Zellen nachfolgend fixiert und Saponin sorgt dafür, dass die Memb-ran für Antikörper permeabel wird. In dieser Arbeit wurde der Nachweis des intrazellulär synthetisierten Zytokins IFN-γ mittels BD Cytofix / Cytoperm™-Kit entsprechend Herstel-lerangaben durchgeführt.

In einer initialen Stimulationsphase wurden zunächst jeweils 1 x 10⁶ Effektorzellen / ml humanes T-Zellmedium eingestellt und mit T2-Zellen in einem Verhältnis von 1:1 ge-mischt. Das entsprechende Peptid wurde in einer Konzentration von 1 µg / ml hinzugege-ben. Als Negativkontrolle erfolgte die Inkubation der Effektorzellen mit T2-Zellen, die mit einem irrelevanten Peptid beladen wurden. Für die Postitivkontrolle wurden die Zellen un-spezifisch mit einer Kombination aus PMA (50 ng / ml) und Ionomycin (1 µg / ml) stimuliert.

Nach einstündiger Inkubation bei 37 °C wurde zu jedem Ansatz 1 µl / ml Brefeldin A (Gol-gi-Plug™) gegeben und die Zellen anschließend für weitere 5 h inkubiert. Nach zweimali-gem Waschen der Zellen in FACS-Puffer und Transfer in eine 96-Rundbodenmikrotiterplatte erfolgte die Oberflächenfärbung mit fluoreszenzmarkierten An-tikörpern, die gegen humanes CD3 und CD8 gerichtet waren. Weiterhin wurde in diesem Schritt eine Totzellfärbung mit 7AAD durchgeführt. Nichtgebundene Antikörper wurden in einem nachfolgenden Waschschritt entfernt. Die Fixation und Permeabilisation der Zellen wurde mit Cytoperm / Cytofix durchgeführt. Die Zellen wurden anschließend zweimal in Perm / Wash gewaschen und IFN-γ-positive Zellen durch eine 30-minütige Inkubation mit gekoppelten, Anti-human IFN-γ-Immunglobulinen markiert. Als Kontrolle wurde FITC-gekoppelter Maus IgG1-Isotyp verwendet. Zur Bestimmung der Antigenspezifität wurden die oben angegebenen Formeln angewandt. Die Ergebnisse der Kontrollstimulation (T2-Zellen plus irrelevantes Peptid) wurden von denen der peptidspezifischen Stimulation sub-trahiert.