Generierung M1-spezifischer CTLs mit Hilfe der aAPCs und Prüfung verschiedener

Zur Austestung der Funktionalität der hergestellten Daudi M1-SC-Zellen wurden PBMCs gesunder, HLA-A2-positiver Spender verwendet. Daudi M1-SC-Zellen präsentieren das Modellpeptid M158-66 an ihrer Oberfläche. Hierbei handelt es sich um ein HLA-A2-restringiertes Epitop des Influenza A-Matrixproteins. Die Influenza A-Virusinfektion weist eine hohe Prävalenz in der Bevölkerung auf. So können Serumantikörper sowie Gedächt-niszellen in einer Vielzahl von Personen detektiert werden (DUNBAR et al., 1998; BOON et al., 2004). In HLA-A2-positiven Spendern richtet sich die zelluläre Immunität in erster Linie gegen das immundominante Epitop M1 (GOTCH et al., 1987; BOON et al., 2004).

Aus diesem Grund wurde das M1-Peptid, genau wie in den Studien von MAUS et al.

(2002) sowie LATOUCHE und SADELAIN (2000), zur Funktionalitätsprüfung der herge-stellten, zellbasierten aAPCs herangezogen.

Da in den nachfolgenden Untersuchungen nur PBMCs solcher Spender eingesetzt werden sollten, die eine hohe Reaktivität aufwiesen, wurde zunächst der Prozentanteil M1-spezifischer, CD8⁺ T-Zellen nach einwöchiger Inkubation mit dem M1-Peptid bestimmt.

Mehr als die Hälfte aller getesteten Personen zeigte eine M1-spezifische Immunantwort (Abb. 19). Es kann davon ausgegangen werden, dass diese vor allem durch eine Aktivie-rung von T-Gedächtniszellen zustande gekommen ist, die im Rahmen einer vorangegan-genen Infektion mit Influenza A-Viren gebildet wurden (LALVANI et al., 1997; BERG-WELT-BAILDON et al., 2002). Dies konnte auch durch den relativ hohen Anteil M1-reaktiver T-Zellen in den unstimulierten Kontrollansätzen bestätigt werden (0,45 ± 0,38 %).

Um herauszufinden, ob Daudi M1-SC-Zellen überhaupt in der Lage sind, M1-spezifische CTLs aus PBMCs M1-reaktiver Spender zu generieren, wurden Letztere über einen Zeit-raum von drei Wochen repetitiv mit den aAPCs stimuliert und die M1-Spezifität CD8⁺ T-Zellen mittels Pentamer-Färbung bzw. IFN-γ-Assay bestimmt. In allen drei getesteten Spendern konnten M1-reaktive CD8⁺ T-Zellen detektiert werden, wobei ihr Prozentanteil aufgrund individueller Schwankungen deutlich variierte (Abb. 20 und Abb. 21). Aus diesen ersten Ergebnissen konnte geschlossen werden, dass die eingesetzten Daudi M1-SC-Zellen das immundominante Epitop M1 an ihrer Oberfläche präsentierten und, trotz kova-lenter Kopplung des Peptids an ein rekombinantes MHC-Klasse-I-Molekül, eine

regelrech-te Aktivierung von antigenspezifischen CTLs induzierregelrech-ten. Auch die Fusion des Peptid-SC-Konstruktes mit EGFP schien die Funktionalität dieser aAPCs nicht zu beeinträchtigen.

In weiteren Versuchen wurde versucht, durch Optimierung der Kulturbedingungen eine Erhöhung der stimulatorischen Kapazität der generierten Daudi M1-SC-Zellen zu errei-chen. Hierfür wurde zunächst das Verhältnis von PBMCs zu aAPCs variiert. Ein Verhältnis von 10:1 schien dabei den größten Effekt zu haben. Weder eine Erhöhung noch Erniedri-gung der Anzahl an aAPCs induzierte einen weiteren Anstieg M1-spezifischer CD3⁺CD8⁺ T-Zellen in der Kultur (Abb. 22). Die Ursache hierfür könnte darin liegen, dass für die Akti-vierung von T-Zellen eine bestimmte Dichte an MHC-Klasse-I-Molekülen und somit auch an APCs notwendig ist. Eine zu hohe Dichte könnte hingegen, z.B. aufgrund kompetitiver Hemmung oder direkter negativer Beeinflussung der T-Zellen, zu einer abgeschwächten Induktion einer Immunantwort führen.

Die Addition von TCGF zur T-Zellkultur wurde von verschiedenen Autoren beschrieben (MACKENSEN et al., 1994; OELKE et al., 2000; OELKE et al., 2005b). Durch Förderung der Proliferation scheint dieser Wachstumsfaktor einen positiven Einfluss auf die Generie-rung und Expansion antigenspezifischer Effektorzellen in vitro zu haben. In dieser Arbeit erfolgte die Synthese von TCGF aus dem Überstand mitogenaktivierter Leukozyten. Das hergestellte Medium wurde auf Funktionalität getestet, indem sein Einfluss auf die Prolife-ration von PHA-Blasten untersucht und mit einem TCGF-Standard verglichen wurde. Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass TCGF die Expansion dieser Zellen förderte (Abb. 15).

Verglichen mit dem Standard wies das neu hergestellte TCGF etwas geringere Aktivität auf. Dies lässt sich auf kulturbedingte Variationen bei der Herstellung zurückführen. Dass der Wachstumsfaktor ebenfalls einen positiven Einfluss auf CTLs ausübt, konnte in weite-ren Versuchen bestätigt werden. So induzierte die Addition höherer Konzentrationen an TCGF eine stärkere Proliferation und somit auch Expansion peptidspezifischer T-Zellen.

NOLTE et al. (2003) verwendeten in ihren Studien einen kommerziell erhältlichen T-Zellwachstumsfaktor, den sie in einer Konzentration von 20 % zur T-Zellkultur gaben. Zwar konnten sie einen signifikanten Anstieg der absoluten Zellzahl beobachten, gleichzeitig stellten sie aber auch fest, dass TCGF in höheren Konzentrationen zu einer Expansion unspezifischer Effektorzellen und somit zu einer Verdrängung von in der Kultur befindli-chen, antigenspezifischen CTLs beitragen kann.

Es wurde bereits beschrieben, dass Daudi-Zellen die klassischen kostimulatorischen Mo-leküle auf ihrer Oberfläche tragen und dass deren Expression durch eine spezifische Akti-vierung modulierbar ist. Aufgrund der großen Bedeutung dieser Moleküle für die Induktion einer Immunantwort in vivo als so genanntes Signal 2 wurde untersucht, ob mit CD40L, LPS und IL-4 stimulierte Daudi M1-SC-Zellen, im Vergleich zu naiven aAPCs, bessere antigenpräsentierende Eigenschaften aufweisen.

Aus PBMCs, die über drei Wochen mit aktivierten Daudi M1-SC-Zellen stimuliert wurden, konnte eine signifikant höhere Anzahl M1-spezifischer CD3⁺CD8⁺ CTLs generiert werden als aus PBMCs desselben Spenders, bei denen naive Daudi M1-SC-Zellen zum Einsatz kamen. Dieses Ergebnis wird durch Untersuchungen von HOOGENDOORN et al. (2004) bestätigt, in denen aus B-Zell-Lymphomen isolierte Tumorzellen in der Lage waren, nach Hochregulierung ihrer kostimulatorischen Moleküle, tumorreaktive CTLs in vitro zu gene-rieren. Naive Tumorzellen wiesen diese Fähigkeit hingegen nicht auf. Ähnliche Ergebnisse erzielte die gleiche Gruppe an einem anderen Krankheitsmodell (HOOGENDOORN et al., 2005). In Veröffentlichungen von BERGWELT-BAILDON et al. (2002) wurde bewiesen, dass CD40L-aktivierte B-Zellen aus gesunden sowie krebskranken Personen in der Lage sind, antigenspezifische CTLs sowohl aus dem naiven als auch aus dem Gedächtnis-T-Zellpool zu stimulieren. MAUS et al. (2002) sowie LATOUCHE und SADELAIN (2000) de-monstrierten in ihren Studien die Bedeutsamkeit kostimulatorischer Moleküle auf der Ober-fläche zellbasierter aAPCs für die in vitro-Generierung zytotoxischer T-Zellen.

Aufgrund der Ergebnisse der Vorexperimente erfolgte die Stimulation antigenspezifischer Effektor-T-Zellen in nachfolgenden Versuchen nach einem einheitlichen Schema: Das PBMC:aAPC-Verhältnis wurde bei 10:1 belassen, zusätzlich zu IL-2 erfolgte eine Addition von 10 % TCGF und Daudi Peptid-SC-Zellen wurden vor ihrer Verwendung mit CD40L, LPS und IL-4 aktiviert (Abb. 24). Zur genaueren Bestimmung der M1-Spezifität wurde in verschiedenen Assays neben CD8⁺ eine Detektion CD3⁺ T-Zellen durchgeführt. Hierdurch sollte eine durch NK-Zellen induzierte, falsch positive Immunantwort ausgeschlossen wer-den.

Die aAPCs wurden mit PBMCs verschiedener Spender inkubiert. Abb. 25 und Abb. 26 verdeutlichen beispielhaft die Ergebnisse der Spender 1798, 1907 und 3050. Im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle kam es in allen drei Fällen zu einer deutlichen Anreicherung

M1-spezifischer CTLs in der gemischten Kultur. So belief sich der Proliferationsindex nach dreiwöchiger Stimulation bei Spender 1798 und 1907 auf 2300 bzw. 3500. Im Fall von Spender 3050 konnte sogar eine über 30000-fache Expansion beobachtet werden. Zellen des Spenders 1798 wurden zur Langzeitstimulation in Kultur gehalten. Es konnte ein ste-ter Anstieg antigenspezifischer CD3⁺CD8⁺ T-Zellen detektiert werden. Nach siebenwöchi-ger Kultur hatten sich die Effektorzellen um das 90000-fache vermehrt. Somit wiesen Daudi M1-SC-Zellen eine hohe stimulatorische Kapazität auf. Diese war mit den Ergebnis-sen verschiedener anderer Autoren vergleichbar, die anstelle von PBMCs, aufgereinigte CD8⁺ T-Zellen in der Startkultur einsetzten. So erzielten OELKE et al. (2000) durch Ver-wendung von peptidbeladenen MoDCs und anschließende, unspezifische Stimulation eine 600-fache Expansion antigenspezifischer CTLs nach fünfwöchiger Kultur. Mit Hilfe von HLA-Ig-beladenen Beads konnten Mart-1-spezifische CD8⁺ T-Zellen in weniger als zwei Monaten um den Faktor 1000 vermehrt werden (OELKE et al., 2003). Eine 1500-fache Expansion spezifischer CTLs wurde nach 16-wöchiger Stimulation mit EBV-transformierten B-Zellen beschrieben (ROSKROW et al., 1998). PAPANICOLAOU et al.

(2003) konnten mit ihren aAPCs nach einmaliger Stimulation eine 300- bis 600-fache Amplifikation CMV-spezifischer T-Zellen erzielen.

Vergleicht man die Ergebnisse aus Abb. 20 und Abb. 26A, wird noch einmal deutlich, dass durch Optimierung der Kulturbedingungen eine verbesserte Generierung M1-spezifischer T-Zellen erzielt werden konnte. In beiden Fällen wurden PBMCs des Spenders 1907 mit Daudi M1-SC-Zellen stimuliert. In der initialen Studie waren nach drei Wochen rund 20 % der Zellen positiv für CD8 und das M1-Pentamer (Abb. 20). In einem späteren Experiment lag dieser Wert bei 44 % (Abb. 26A). Kulturbedingte Schwankungen können als Ursache hierfür allerdings nicht vollständig ausgeschlossen werden.