5 Diskussion
5.6 Überprüfung der Funktionalität generierter Effektorzellen in vivo
Wichtig für eine erfolgreiche adoptive Immuntherapie ist die in vivo-Persistenz transferier-ter Effektor-T-Zellen. Diese hängt im großen Maße von der Art ihrer Generierung in vitro sowie der Art ihrer Administration ab (YEE, 2005). Obwohl bereits zahlreiche Studien über die Generierung von antigenspezifischen CTLs mit Hilfe von aAPCs in vitro vorliegen, wurden Untersuchungen an in vivo-Modellen bislang nur unzureichend durchgeführt. Die Bedeutsamkeit solcher Analysen wurde jedoch von ROSENBERG et al. (2003) hervorge-hoben, die feststellten, dass eine hohe Avidität generierter CTLs in vitro nicht unbedingt mit einer hohen Funktionalität dieser Zellen in vivo korreliert. Dieses Paradoxon wurde auch von anderen Autoren beschrieben. So zeigten GATTINONI et al. (2005), dass hoch-differenzierte T-Zellen, trotz hoher antitumoröser Wirksamkeit in vitro, einen in Mäusen wachsenden Tumor nicht eliminieren konnten. Als Ursache hierfür nannten sie eine
Herun-terregulierung kostimulatorischer Moleküle, ausbleibendes homing der CTLs, ihre Unfä-higkeit, IL-2 zu sezernieren, sowie einen Übergang dieser Zellen in einen proapoptoti-schen Zustand durch hohe Teilungsraten während der in vitro-Kultur (GATTINONI et al., 2005). Effektorzellen, die sich in einem frühen Entwicklungsstadium befinden, scheinen hingegen ein größeres Potential für eine in vivo-Persistenz zu haben (YEE, 2005).
In dieser Arbeit erfolgte die Analyse der in vivo-Funktionalität generierter Effektorzellen in NOD-scid-Mäusen nach Induktion eines M1-exprimierenden Tumors. Aufgrund einer schweren Defizienz des angeborenen und erworbenen Immunsystems kommt es in diesen Tieren zu keiner Abstoßung der xenogenen Tumorzelllinie. Die applizierten Effektorzellen stammten aus der Stimulation von PBMCs des Spenders 3050 mit Daudi M1-SC-Zellen.
13 % der in der gemischten Zellkultur befindlichen Zellen wiesen M1-Spezifität auf (Tabelle 10). Im Vergleich zu den beiden Kontrollansätzen bewirkten diese Effektorzellen nach einmaliger Injektion eine leichte Regression des Tumorwachstums. Ein Auswachsen des Tumors konnte allerdings nicht verhindert werden (Abb. 43). Somit wiesen die gene-rierten CTLs, trotz nachweislicher Funktionalität in vitro, nur eingeschränkte Wirksamkeit in vivo auf. Die Ursachen hierfür können vielfältiger Natur sein. Zunächst könnte eine einma-lige Injektion von 1 x 107 Zellen nicht ausreichend für eine Tumor-eliminierende Therapie gewesen sein. So wird in Mausmodellen eine Frequenz antigenspezifischer T-Zellen von 1-10 % der CD8+ T-Zellen vorgeschlagen (YEE, 2005). KIRCHER et al. (2003) empfehlen zudem repetitive Infusionen von CTLs, um eine dauerhafte Tumorregression in Mausmo-dellen zu erzielen. In den Arbeiten von WESTWOOD et al. (2005) wurde beispielsweise eine Regression s.c. injizierter Eierstockstumoren in NOD-scid-Mäusen durch mehrmalige Injektion genetisch modifizierter T-Zellen hervorgerufen.
Ein weiterer Grund für die in dieser Arbeit nur schwachen Reaktivität generierter CTLs in vivo könnte ebenfalls in einer fehlenden Koadministration von IL-2 gelegen haben. Eine solche Ursache wurde auch bei Untersuchungen von MITCHELL et al. (2002) in Betracht gezogen, die nach Injektion einer polyklonalen Zellpopulation in ihrem in vivo-Modell eben-falls nur bedingte Therapieerfolge erzielten. Allerdings scheinen unphysiologische Kon-zentrationen an IL-2 ebenso eine verminderte proliferative Kapazität von CTLs in vivo zur Folge haben zu können (YEE, 2005). Entsprechend der Ergebnisse von MOROZ et al.
(2004) hätte evtl. auch eine Behandlung der tumortragenden Mäuse mit IL-21 zu einer
er-höhten, klonalen Expansion antigenspezifischer CTLs und hierdurch zu einer erfolgreiche-ren adoptiven Immuntherapie füherfolgreiche-ren können.
Eine weitere Möglichkeit für die beobachtete, schwache Regression könnte in einer subop-timalen Stimulation der Effektorzellen in vitro gelegen haben. So wird unter anderem eine inadäquate Kostimulation als Ursache für eine fehlende Persistenz transferierter T-Zellen im peripheren Blut des Wirtes in Betracht gezogen (YEE, 2005). Die in dieser Arbeit ver-wendeten Daudi M1-SC-Zellen wiesen hingegen eine hohe Expression kostimulatorischer Moleküle auf ihrer Oberfläche auf.
Anstelle von IL-2 wird für die in vitro-Generierung zytotoxischer T-Zellen von einigen Auto-ren die Verwendung von IL-15 empfohlen (BRENTJENS et al., 2003). Die durch dieses Zytokin expandierten, tumorreaktiven CD8+ T-Zellen konnten einen etablierten Tumor deutlich besser attackieren (KLEBANOFF et al., 2005a). Als weiteres Zytokin scheint IL-7 durch Förderung der Langzeitkultur tumorreaktiver CTLs in vitro deren immuntherapeuti-sche Effizienz in vivo zu fördern (LYNCH und MILLER, 1994).
Da die injizierten Effektorzellen einer mehrwöchigen Kultur mit Daudi M1-SC-Zellen unter-zogen wurden, könnten sie sich zum Zeitpunkt ihrer Applikation bereits am Ende ihrer Le-bensspanne befunden haben. Dies würde ihre Expansion in vivo stark einschränken. Ein Faktor, der als sehr bedeutend für den Erfolg einer adoptive Immuntherapie angesehen wird (GATTINONI et al., 2005). Zur Steigerung der Effektivität transferierter, antigenspezi-fischer CTLs wird von einigen Autoren auch eine Lymphodepletion des Wirtes vor der Im-muntherapie als sinnvoll erachtet (KLEBANOFF et al., 2005b; WANG et al., 2005).
Die Verwendung einer gemischten Zellkultur ist ein weiteres Kriterium, das das Ergebnis des durchgeführten Experimentes beeinflusst haben könnte. So wird von vielen Autoren eine Applikation aufgereinigter CD8+ T-Zellen bevorzugt. Hierauf wurde in dem vorgestell-ten in vivo-Experiment verzichtet, da durch Verwendung einer Mischkultur eine positive Beeinflussung durch zusätzlich vorhandene Zellpopulationen erhofft wurde. Neben CD8+ T-Zellen, von denen knapp über 50 % spezifisch für M1 waren, wurden ebenfalls γ:δ T-Zellen und zu einem geringeren Prozentsatz auch CD4+ T-Zellen sowie NKT-Zellen detek-tiert (Tabelle 1). γ:δ T-Zellen können zu Abwehrreaktionen gegenüber tumorösen Erkran-kungen beitragen (KAUR et al., 1993; WILHELM et al., 2003) und wurden auch schon er-folgreich für einen adoptiven Transfer im Mausmodell eingesetzt (MALKOVSKA et al.,
1992; ZHENG et al., 2001b). Ein positiver Einfluss dieser Zellen auf die Beseitigung des M1-exprimierenden NW-38-Mel-Tumors konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Das gleiche gilt für die ebenfalls in der generierten Zellpopulation vorhandenen CD4+ T-Zellen, obwohl ihnen als Helferzellen eine wichtige Rolle bei Immunreaktionen gegenüber Tumo-ren zugesprochen wird (HUNG et al., 1998). Außerdem scheinen sie die in vivo-Persistenz transfizierter CD8+ T-Zellen fördern zu können (WALTER et al., 1995; DUDLEY et al., 2002).
Der Verlust des Antigens auf Tumorzellen stellt einen wichtigen Tumor-escape-Mechanismus dar (THURNER et al., 1999; YEE et al., 2000). Um dieses Phänomen als Ursache für die schwache Regression des Tumors auszuschließen, wurden die NW-38-Mel M1-Tumorzellen am Ende des Versuches auf GFP-Expression untersucht (Abb. 44).
Zwar war diese im Vergleich zu in vitro-kultivierten Tumorzellen reduziert, was auf das Vorhandensein anderer Zellen im Tumorstroma zurückzuführen ist, ein vollständiger Ver-lust konnte jedoch nicht festgestellt werden. Um neben der GFP-Expression eine auch weiterhin bestehende Präsentation des M1-Peptids über MHC-Klasse-I-Moleküle sicher-zustellen, hätten allerdings weitere funktionelle Assays durchgeführt werden müssen.