Reaktivität gegenüber Influenza M1-transfizierten Tumorzellen

In bisherigen Versuchen wurde die Reaktivität der generierten M1-spezifischen Effektor-zellen gegenüber M1-Peptid-gepulsten bzw. M1-SC-transfizierten TargetEffektor-zellen untersucht.

Nachfolgend sollte überprüft werden, ob die Effektorzellen ebenfalls in der Lage sind, Zel-len zu erkennen, die das M1-Peptid des Influenzavirus nach natürlicher Prozessierung an ihrer Oberfläche exprimieren. Hierzu wurden zunächst HLA-A2-positive NW-38-Mel-Zellen mit dem in dieser Arbeit hergestellten Influenza M1 pEGFP-Konstrukt (4.2) transfiziert.

Aus Abb. 32A geht hervor, dass die Zellen nach Transfektion positiv für GFP waren. Dies wurde mittels Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht. Parallel hiezu erfolgte eine Lipofektamin-Transfektion der Hepatomzelllinie Hlx Pxt mit dem M1-SC pEGFP-Konstrukt. Hlx Pxt M1-SC-Zellen wiesen ebenfalls eine Expression des grünflu-roeszierenden Proteins GFP auf (Abb. 32B). Auf naiven NW-38-Mel- bzw. Hlx Pxt-Zellen konnte kein GFP detektiert werden.

In nachfolgenden Experimenten wurde untersucht, ob mit aAPCs generierte T-Zellen die Fähigkeit besitzen, transfizierte NW-38-Mel M1-Zellen zu erkennen. Dies erfolgte mittels intrazellulärer IFN-γ-Analyse, GM-CSF-ELISA sowie Zytotoxizitäts-Assay. Hlx Pxt M1-SC-Zellen wurden als Positivkontrolle im GM-CSF-ELISA eingesetzt.

NW-38-Mel M1 HlxPxt M1-SC

A

B

A B

Abb. 32: GFP-Expression durch NW-38-Mel M1- und Hlx Pxt M1-SC-Zellen. Die HLA-A2-positiven Zelllinien NW-38-Mel und Hlx Pxt wurden mit dem Influenza M1 pEGFP- (A) bzw. M1-SC pEGFP-Konstrukt (B) transfiziert und die GFP-Expression mittels FCM-Analyse (oben) sowie Fluo-reszenzmikroskopie (unten) untersucht. Naive NW-38-Mel- bzw. Hlx Pxt-Zellen werden im Histogramm als grau ausgefüllte Kurven dargestellt (A und B; oben).

4.5.4.1 Intrazelluläre IFN-γ-Analyse

Für den intrazellulären Assay wurden Zellen des Spenders 1907 verwendet. Sie kamen nach zweiwöchiger Kultur mit Daudi M1-SC-Zellen zum Einsatz. Ihre M1-Spezifität, bezo-gen auf die CD3⁺CD8⁺ Zellpopulation, belief sich auf ca. 17 %. Für den intrazellulären As-say wurden sie zusammen mit naiven oder transfizierten NW-38-Mel-Zellen in einem Ver-hältnis von 1:1 inkubiert und die anschließende Färbung gemäß Protokoll durchgeführt (3.2.5.1).

Aus Abb. 33 geht hervor, dass die generierten T-Zellen IFN-γ sezernierten, wenn sie mit NW-38-Mel M1-Zellen stimuliert wurden. Der Anteil IFN-γ-produzierender Zellen in der CD3⁺CD8⁺ Zellpopulation betrug 29 % (19,5% von 66,5% CD3⁺CD8⁺ Zellen). Eine Inkuba-tion der Zellen mit naiven NW-38-Mel-Zellen induzierte hingegen keine erhöhte IFN-γ-Synthese.

0.12% 19.5%

51.3% 47.0%

NW-38-Mel naive NW-38-Mel M1

CD8 IFN-γγγγ

0.12% 19.5%

51.3% 47.0%

NW-38-Mel naive NW-38-Mel M1

CD8 IFN-γγγγ

0.12% 19.5%

51.3% 47.0%

NW-38-Mel naive NW-38-Mel M1

CD8 IFN-γγγγ

Abb. 33: IFN-γ-Synthese nach Erkennung exprimierender Tumorzellen. Mittels Daudi M1-SC-Zellen generierte Zellen wurden mit der transfizierten Tumorzelllinie NW-38-Mel M1 über einen Zeitraum von 6 h inkubiert und die IFN-γ-Sekretion mittels intrazellulärem Zytokin-Assay unter-sucht. Als Kontrolle wurden naive Tumorzellen eingesetzt. Es handelt sich um ein repräsentatives Ergebnis von zwei unabhängig voneinander durchgeführten Experimenten. Gates: vitale Lympho-zyten und CD3⁺ T-Zellen.

4.5.4.2 GM-CSF-ELISA

Im nachfolgenden GM-CSF-ELISA wurden ebenfalls Zellen des Spenders 1907 verwen-det, die sich in diesem Fall für eine Dauer von drei Wochen in Kultur befanden. Eine Ana-lyse mittels Pentamer-Färbung ergab, dass, bezogen auf die CD8⁺ T-Zellpopulation, ca.

46 % der Effektorzellen M1-Spezifität aufwiesen. Sie wurden mit verschiedenen Targetzel-len inkubiert. Hierbei handelte es sich entweder um T2-ZelTargetzel-len, die mit M1-Peptid beladen wurden oder um NW-38-Mel-Tumorzellen, die das Influenza M1-Konstrukt an ihrer Ober-fläche exprimierten. Außerdem wurden in diesem Versuch Hlx Pxt M1-SC-Zellen als Tar-getzellen eingesetzt. Naive T2-, NW-38-Mel- bzw. Hlx Pxt-Zellen dienten als Negativkon-trolle.

Eine Synthese von GM-CSF konnte durch alle Targetzellen induziert werden, die M1 an ihrer Oberfläche exprimierten, wobei die gemessene Zytokinkonzentration mit 1400 pg / ml bei den Hlx Pxt M1-SC-Zellen höher war als bei den NW-38-Mel M1-Zellen mit 850 pg / ml. T2-Zellen, die das M1-Peptid über MHC-Klasse-I-Moleküle präsentierten, lösten die stärkste CSF-Sekretion aus (1650 pg /ml). Bei allen drei Kontrollansätzen lag die GM-CSF-Konzentration unter 100 pg / ml und hob sich signifikant von der durch M1-exprimierende Targetzellen induzierten Zytokinsekretion ab (Abb. 34).

0

Abb. 34: M1-spezifische GM-CSF-Sekretion durch Effektor-T-Zellen. M1-exprimierende Tar-getzellen (T2+M1, NW-38-Mel M1 und Hlx Pxt M1-SC) wurden mit Effektorzellen (M1-Spezifität ca.

46 %) in einem Verhältnis von 1:1 inkubiert und die GM-CSF-Konzentration im Zytokin-ELISA de-tektiert. Die Kontrollansätze bestanden aus naiven T2-, NW-38-Mel- bzw. Hlx Pxt-Zellen. Mittelwert

± SD aus n = 3. *** p ≤ 0,001.

4.5.4.3 Zytotoxizität

Zur Untersuchung der lytischen Aktivität gegenüber NW-38-Mel M1-Zellen wurden Zellen des Spenders 3050 verwendet, die aus der Stimulation naiver PBMCs mit Daudi M1-SC-Zellen hervorgegangen waren. Ca. 10 % ihrer CD8⁺ T-Zellen wiesen Spezifität für das M1-Pentamer auf. Sie wurden in verschiedenen E:T-Verhältnissen mit NW-38-Mel M1-Zellen zusammengebracht. Zur Kontrolle wurden die CTLs mit naiven NW-38-Mel-Zellen inku-biert. Bei einem E:T-Verhältnis von 33:1 wurden die NW-38-Mel M1-Zellen zu 56 % lysiert.

Betrug das Verhältnis 3:1 lag die Lyse bei 41 %. Im Vergleich dazu wurden naive NW-38-Mel-Zellen bei diesen beiden E:T-Verhältnissen zu 37 % bzw. 14 % lysiert. Der Unter-schied zwischen beiden Gruppen war bei allen E:T-Verhätnissen signifikant (Abb. 35).

L y si s (% )

Abb. 35: M1-spezifische Lyse von NW-38-Mel M1-Zellen durch generierte Effektorzellen. Zel-len des Spenders 3050 (Spezifität ca. 10 %) wurden auf ihre Zytotoxizität gegenüber M1-exprimierenden NW-38-Mel-Zellen überprüft, die stabil mit dem Influenza M1 pEGFP-Konstrukt transfiziert wurden. Eingesetzt wurden drei verschiedene Effektor:Target-Verhältnisse (E:T). Als

Negativkontrolle dienten naive NW-38-Mel-Zellen. Mittel ± SD aus Triplikaten.

** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001.