2 Literaturübersicht
2.6 Tumorimmunologie
2.6.2 Immuntherapie von Tumorerkrankungen
2.6.2.2 Adoptiver T-Zelltransfer
Die ebenfalls in Abb. 2 schematisch dargestellte adoptive Immuntherapie stellt eine sehr attraktive und elegante Strategie dar, eine Vielzahl lebensbedrohlicher Krankheiten zu be-handeln. Sie beinhaltet die antigenspezifische Stimulation, Aktivierung und Expansion au-tologer T-Zellen ex vivo und ihre anschließende Infusion zurück in den Patienten (DUDLEY und ROSENBERG, 2003).
Für einen erfolgreichen adoptiven Transfer müssen die generierten T-Zellen wichtige Grundeigenschaften aufweisen. Dazu gehört eine hohe Spezifität gegenüber dem jeweili-gen Antijeweili-gen, um das entartete bzw. infizierte Gewebe gezielt attackieren zu können und die Gefahr des Auftretens von Autoimmunreaktionen möglichst zu minimieren. Der TCR sollte eine hohe Affinität gegenüber dem Antigen besitzen und nach Bindung an seinen Liganden eine effektive Aktivierung der T-Zelle induzieren. Nach Injektion einer hohen An-zahl spezifischer Effektorzellen zurück in den Patienten sollte es zu einem korrekten ho-ming der Zellen in den lymphatischen und inflammatorischen bzw. entarteten Bereich kommen. Die Zellen müssen hohe Funktionalität in Form von Zytotoxizität aufweisen und sollten in vivo nach Antigenkontakt proliferieren, um über einen möglichst langen Zeitraum im Patienten persistieren zu können.
Das erste Mal wurde eine erfolgreiche adoptive Immuntherapie an immunkompromierten Patienten nach allogener Knochenmarktransplantation durchgeführt. Cytomegalieviren (CMV) können nach immunsuppressiver Therapie zu einer lebensbedrohlichen Erkran-kung in diesen Patienten führen. Nach Injektion antigenspezifischer T-Zellen kam es in keinem der behandelten Patienten zu einem Ausbruch einer CMV-Erkrankung (RIDDELL et al., 1994; WALTER et al., 1995). In anderen Studien konnte gezeigt werden, dass auch bei Infektionen mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV) oder dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) mehr oder weniger gute Therapieerfolge durch den adoptiven Transfer antigenspezi-fischer zytotoxischer Effektorzellen bzw. CD4+ T-Zellen erzielt werden konnten (HESLOP et al., 1994; HAQUE et al., 1998; ROONEY et al., 1998; BRODIE et al., 2000; RIDDELL und GREENBERG, 2000; SAVOLDO et al., 2002).
Im Gegensatz hierzu hat sich der adoptive T-Zelltransfer zur Behandlung maligner Erkran-kungen als weitaus schwieriger herausgestellt. Zum einen wegen der Schwierigkeit, ho-chaffine, tumorspezifische T-Zellen zu generieren, die auch in vivo ausreichende
Funktio-nalität aufweisen und zum anderen wegen einer Vielzahl von Mechanismen, mit denen sich ein Tumor vor der Zerstörung durch das Immunsystem schützt (DRAKE et al., 2006).
In verschiedenen xenogenen Mausmodellen konnte allerdings die Wirksamkeit von in vitro expandierten, humanen CTLs gezeigt werden (CROWLEY et al., 1992; MALKOVSKA et al., 1992; SABZEVARI und REISFELD, 1993; STENHOLM et al., 1998; ZEH, III et al., 1999; FEUERER et al., 2001; YANG et al., 2002; WESTWOOD et al., 2005).
Erste Ansätze zum adoptiven Transfer von malignomreaktiven Lymphozyten bei Patienten mit malignen Erkrankungen wurden von ROSENBERG et al. durchgeführt. Sie stimulierten isolierte Lymphozyten mit IL-2 und überprüften anschließend die Funktionalität der expan-dierten, als Lymphokin-aktivierte Killerzellen bezeichneten Zellen in vivo. Eine eindeutige Wirksamkeit dieser Therapieform konnte jedoch nicht nachgewiesen werden (ROSENBERG et al., 1985; ROSENBERG et al., 1993). Einige Jahre später gelang es der gleichen Gruppe, TILs erfolgreich aus Melanomen zu isolieren und in vitro unter Anwe-senheit eines Tumorantigens zu expandieren. Nach Reinfusion dieser autologen, tumor-spezifischen T-Zellen konnte in einigen Patienten eine Tumorregression beobachtet wer-den. Allerdings kam es auch zum Auftreten von Autoimmunreaktionen gegenüber gesun-dem Gewebe (ROSENBERG et al., 1988; ROSENBERG et al., 1994; YEE et al., 2000).
Studien von MEIDENBAUER et al. (2003) zeigten, dass tumorantigenspezifische T-Zellen in den entarteten oder metastasierten Bereich einwandern und über mehrere Wochen im Patienten persistieren können. Letzteres konnte ebenfalls durch MHC-Tetramer-Analysen von YEE et al. (2002) bestätigt werden.
Bisherige Ergebnisse stützen sich vor allem auf Untersuchungen an Patienten mit malig-nen Melanomen (ROSENBERG et al., 1988; AEBERSOLD et al., 1991; DUDLEY et al., 2002; YEE et al., 2002; NOLTE et al., 2003) und EBV-assoziierten lymphoproliferativen Erkrankungen (ROSKROW et al., 1998; KHANNA et al., 1999; KHANNA et al., 2001;
GOTTSCHALK et al., 2003; SHERRITT et al., 2003).
Es existieren aber auch Studien, die über den adoptiven Transfer bei anderen Tumorer-krankungen berichten (MACARY et al., 2006).
Die Nachteile der adoptiven Immuntherapie bestehen darin, dass die Isolation und Expan-sion antigenspezifischer Effektorzellen in vitro sehr zeit- und kostenintensiv ist. So wird hierfür eine Dauer von 4-16 Wochen veranschlagt; eine lange Zeitspanne, in Anbetracht
der Tatsache, dass die Patienten unter einer progressiven Erkrankung leiden. Einfrier- und Auftauprozesse sowie Lagerung und Transport können negative Auswirkungen auf die Zellprodukte haben. Diese Faktoren fallen bei der aktiven Immunisierung weg (YEE, 2005). Problematisch ist weiterhin, dass optimale Stimulationsbedingungen in vitro bislang nicht bekannt sind. In derzeitigen Veröffentlichungen variiert demzufolge die Art und Wei-se, wie die Zellen für den klinischen Einsatz generiert werden. Dies trifft vor allem auf die Antigenpräsentation (autologe DCs versus aAPCs), die Konzentration und Art der Zytokine (10 U / ml bis 6000 U / ml IL-2 versus TCGF u.a.) sowie die Anzahl infundierter Zellen zu (YEE, 2005). Weiterhin scheint eine vorangegangene Lymphodepletion einen entschei-denden Einfluss auf den Erfolg einer Immuntherapie zu haben (KLEBANOFF et al., 2005b;
GATTINONI et al., 2006). Der Vorteil der adoptiven T-Zelltherapie gegenüber Vakzination besteht hingegen in der Möglichkeit, expandierte T-Zellen phänotypisch und funktionell charakterisieren und gezielt selektieren zu können. Weiterhin können sie ex vivo manipu-liert und hierdurch ihre Spezifität, Funktionalität und Überlebensfähigkeit beeinflusst wer-den. Dies kann z.B. durch Einführung mutierter oder chimärer TCRs oder bestimmter Oberflächenrezeptoren erfolgen (HO et al., 2003; KERSHAW et al., 2005). Durch retrovira-le Transduktion von humanen PBMCs mit TCRs, die Spezifität gegenüber p53 aufwiesen, konnten KUBALL et al. (2005) beispielsweise hochpotente Effektor-T-Zellen erzeugen.
Vakzinationsstrategien scheitern zudem häufig an einer zu geringen Anzahl zirkulierender, tumorspezifischer Immunzellen. Im Gegensatz hierzu kann durch den adoptiven T-Zell-Transfer ein weitaus größerer, prozentualer Anteil an malignomreaktiven CTLs im Patien-ten erreicht werden (ROSENBERG et al., 2004).
2.6.2.3 Therapieansätze in der Veterinärmedizin
Aufgrund der Tatsache, dass Tumorerkrankungen in der Tierarztpraxis einen immer grö-ßeren Stellenwert einnehmen und bisherige Behandlungsmethoden häufig nur unzurei-chende Wirksamkeit zeigen, wird auch in der Tiermedizin nach neuen Strategien zur Tu-morbekämpfung gesucht. So existieren bereits einige Studien, in denen versucht wurde, durch aktive oder passive Beeinflussung des Immunsystems eine Regression verschiede-ner Tumoren zu erzielen (NEVOIGT, 2007). Bei der nicht-spezifischen aktiven Immunsti-mulation werden Substanzen appliziert, die über eine StiImmunsti-mulation von Zellen der
angebo-renen und / oder erworbenen Abwehr einen antitumoralen Effekt bewirken sollen. So konnte beispielsweise beim Rind durch eine intratumorale Applikation von niedrig dosier-tem humanen IL-2 eine dosier-temporäre Reduktion von Papillomen oder Karzinomen der Vulva beobachtet werden (HILL et al., 1994a). BCG (Bazillus Calmette-Guérin), ein attenuiertes, avirulentes Mycobabacterium bovis, induzierte sogar eine komplette Regression bereits fortgeschrittener Papillome (HILL et al., 1994b).
Beim equinen Sarkoid handelt es sich um einen aggressiven Hauttumor des Pferdes. Eine Behandlung dieses immunogenen Tumors mit BCG erbrachte viel versprechende Resulta-te (KLEIN et al., 1986; VANSELOW et al., 1988). Auch bei Hund und Katze konnResulta-ten durch Applikation verschiedener Zytokine und / oder Paramunitätsinducer zum Teil signifikante Erfolge bei der Tumorbekämpfung erzielt werden (NEVOIGT, 2007).
Eine spezifische aktive Immunstimulation kann durch Verabreichung reiner Tumorantigene in Form von Proteinen, Peptiden, nackter DNA oder ganzen Tumorzellen erfolgen. Über die Verabreichung von autologen oder allogenen Tumorzellen, die aus unterschiedlichen Malignomen extrahiert und nach Abtötung in den Patienten (re)injiziert wurden, liegen beim Tier einige Studien mit zum Teil viel versprechenden Ergebnissen vor (NEVOIGT, 2007). So behandelten KINNUNEN et al. (1999) Pferde, die an einem primären Sarkoid litten, mit einer autologen Vakzine aus zuvor entnommenem Tumormaterial. Bei Hunden wurde die Wirksamkeit einer Tumorzellvakzine an verschiedenen Neoplasien wie z.B. malignes Mela-nom, Fibrosarkom und Mammatumor getestet. Die Tumorzellen wurden hierfür z.T. mit immu-nologisch wirksamen Subtanzen (z.B. GM-CSF) modifiziert (NEVOIGT, 2007). Nachteile die-ser Methode sind der erforderliche chirurgische Eingriff und der beachtliche finanzielle Auf-wand.
Unter einer passiven Immuntherapie wird unter anderem die Verabreichung von in vitro stimulierten Effektorzellen verstanden. Therapieansätze mit IL-2-aktivierten NK-Zellen existieren für Hund und Katze (TIZARD, 2004).
Immuntherapeutische Verfahren, die bereits erfolgreich in der Tiermedizin eingesetzt wer-den, sind Vakzinierungen gegen tumorinduzierende Viren, die als Ursache von Spontan-tumoren in Betracht kommen. In diesem Zusammenhang seien das Feline Leukämievirus (FeLV) sowie das Virus der Marekschen Krankheit (Galliner Herpesvirus 2) genannt. Es handelt sich hierbei um RNA- bzw. DNA-Viren, die nach Einschleusung in das Genom zu
malignen Entartungen von hämatopoietischen Zellen führen können. Durch Impfung mit entsprechenden Antigenen kann über eine gezielte Aktivierung des Immunsystems einer Tumorentstehung entgegengewirkt werden (MURTHY und CALNEK, 1979; TIZARD, 2004).
2.6.3 Problematiken der Immuntherapie von Tumoren
Durch bisherige immuntherapeutische Strategien konnten lediglich Teilerfolge in der Be-kämpfung von Tumoren erzielt werden (ROSENBERG et al., 2004). Der Grund für das Versagen des Immunsystems, den Organismus vor dem Auswachsen einer Geschwulst zu schützen, wird auf verschiedene Mechanismen zurückgeführt. Intrinsische, von der Funktionalität des Immunsystems abhängige Mechanismen, beinhalten eine inadäquate Stimulation von Immunzellen durch maligne entartete Zellen. Die Ursache hierfür kann eine generelle Abwesenheit tumorspezifischer T-Zellen vom Immunrepertoire infolge peri-pherer und zentraler Toleranzmechanismen sein. Weiterhin kann eine insuffiziente Prä-sentation tumorassoziierter Antigene durch APCs sowie eine fehlende Inflammation zu einer ausbleibenden Proliferation und Einwanderung von Effektorzellen in den tumorös entarteten Bereich führen. Auch regulatorische T-Zellen können durch Inhibition aktivierter T-Zellen einen negativen Einfluss auf die Entstehung einer Immunantwort haben (KERSHAW et al., 2005). Weiterhin könnte eine durch Therapeutika induzierte, allgemeine Immunsuppression des Patienten den Erfolg von Vakzinationsstrategien beeinträchtigen (HO et al., 2003; MACARY et al., 2006).
Extrinsische Mechanismen gehen direkt vom Tumor selbst aus. Ihre Entstehung wird auf die Tatsache zurückgeführt, dass Malignome permanent dem Immunsystem ausgesetzt sind. Hierdurch kann es zum Auswachsen solcher Zellen kommen, die der Immunkontrolle nicht mehr unterliegen, weil sie beispielsweise Tumorantigene nicht mehr exprimieren oder die Anzahl funktioneller MHC-Moleküle auf ihrer Oberfläche reduzieren. In klinischen Studien an Melanompatienten wurde vom Auftreten einer Mutation nach einer Immunthe-rapie berichtet, die zum Verlust der Expression des Tumorantigens führte (THURNER et al., 1999; YEE et al., 2002). Durch Sekretion von immunsuppressiven Faktoren können Tumorzellen Immunzellen direkt in ihrer Funktion beeinträchtigen. Eine weitere Möglichkeit
besteht in der Herunterregulierung von Apoptose-induzierenden Oberflächenrezeptoren oder intrazellulären Signalmolekülen (KERSHAW et al., 2005).
3 Material und Methoden
3.1 Material
3.1.1 Geräte
Autoklav Typ GE406 Getinge AB, S-Getinge
Brutschrank mit CO2-Begasung, Baureihe 5060 Heraeus, D-Hanau Bunsenbrenner mit automatischer Zündung Wartewig, D-Göttingen Eismaschine „UBE 30-10“ Ziegra, D-Isernhagen Einfrierkontainer „Nalgene Cryo 1 °C Container“ Nunc, D-Düsseldorf Elektroporationsgerät „Gene Pulser“ Biorad, D-München ELISA-Reader „Dynatech MR 5000“ Dynatech, D-Denkendorf
FACScan flow cytometer Becton Dickinson, D-Heidelberg Fluoreszenz-Durchflusszytometer „FACSCalibur“ Becton Dickinson, D-Heidelberg Fluoreszenzmikroskop „Diaphot 300“ Nikon, D-Düsseldorf
Gelelektrophoresekammer Biozym, D-Hess.-Oldendorf γ-Microplate Scintillation-Counter Wallac, F-Turku
γ-Strahlungsquelle „Gammacell 2000” Molsgaard, Dänemark Labor-pH-Meter „766 Calimatic“ Knick, D-Berlin
Laborwaage „BL310“ Sartorius GmbH, D-Göttingen
MACS MultiStand Miltenyi, D-Bergisch Gladbach
Magnetrührer mit Heizplatte Janke und Kunkel, D-Staufen Pipetten, einstellbar (2, 10, 20, 200,1000 µl) Eppendorf, D-Hamburg Pipettierhilfe „accu-jet“ Brand, D-Wertheim Power Supplier „Power Pac 300“ Biorad, D-München Reinwerkbank „Laminair HL2448“ Heraeus, D-Hanau Schlauchpumpe „Rumo100“ Heidolph, D-Schwabach
Schüttler „Orbital Shaker“ Forma Scientific, USA-Marietta Spektralphotometer „Gene Quant II“ Pharmacia Biotech, D-Freiburg
Stickstofftank Linde, D-Höllriegelskreuth Thermocycler „Mastercycler” Eppendorf, D-Hamburg Tischzentrifuge „5415C“ Eppendorf, D-Hamburg
Trockenschrank Heraeus, D-Hanau
UV-Transilluminator „GelDoc 2000“ Biorad, D-München Wasserbad mit Temperaturregelung „Typ 1003“ GFL, D-Hannover Zentrifuge „Megafuge 1.0R“ Heraeus, D-Hanau Zellharvester „Tomec 3[H] Cell Harvester” Wallac, F-Turku
3.1.2 Plastik- und Glaswaren
Combitips (0,5 ml, 2,5 ml, 12,5 ml) Eppendorf, D-Hamburg
Cryoröhrchen (1,8 ml) Nunc, D-Düsseldorf
Einmalspritzen Braun, D-Melsungen
Elektroporationsküvette „Gene Pulser Cuvette“ (0,4 cm) Biorad, D-München
FACS-Röhrchen „Polystyrene Round-Bottom Tube“ Becton Dickinson, D-Heidelberg Filtertips „Biosphere“ Greiner, D-Frickenhausen
Gewebekulturflaschen (25 cm2, 75 cm2, 175 cm2) Greiner, D-Frickenhausen
Glasfaserfilter „MN“ Machery-Nagel, D-Düren
Klebefolie „Scotch Pad“ Einzelhandel
Laborflaschen mit Gewinde, 500 ml VWR int., D-Hannover
Leucosep®-Röhrchen Greiner, D-Frickenhausen
MACS „Separation columns“ (MS) Miltenyi, D-Bergisch Gladbach Mikrotiterplatten (96 Vertiefungen, rund / flach / spitz) Greiner, D-Frickenhausen Mikrotiterplatten (6, 24 und 48 Vertiefungen) Sarstedt, D-Nürnbrecht Messplatte „LumaPlate-96“ Perkin Elmer, USA-Boston Nylon-Filter (Nylon-Netz) (70 µm) Heidland, D-Harsewinkel Pasteurpipetten aus Glas (22,5 mm) Brand, D-Wertheim Pipettenspitzen (10, 200, 1000) Sarstedt, D-Nürnbrecht
Quarzküvette „UVette” Eppendorf, D-Hamburg
Reagent Reservoir (50 ml) Costar, USA-NY
Reaktionsgefäße (0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml) Eppendorf, D-Hamburg
Röhrchen für die Durchflusszytometrie (1,4 ml) Micronic Systems, N-Lelystad Sample Bag (90 x 120 cm) Wallac, F-Turku
Serologische Pipetten (steril; 1, 5, 10 und 25 ml) Sarstedt, D-Nürnbrecht Sterilfilter „Steriflip“ (0,2 µm und 0,45 µm) Millipore, D-Eschborn Zentrifugenröhrchen „Falcon Tubes“ (15 ml, 50 ml) Greiner, D-Frickenhausen Zählkammer nach Neubauer Brand, D-Giessen
3.1.3 Reagenzien
7AAD Becton Dickinson, D-Heidelberg
Agarose Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe
AIM-V®-Medium Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe
Ampicillin Sigma-Aldrich, D-Schnelldorf
Aqua (steril) Delta Select, D-Dreireich
Auftragspuffer „Blue-Juice“ Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe
β-Mercaptoethanol Merck, D-Darmstadt
β2-Mikroglobulin, humanes Sigma-Aldrich, D-Steinheim
BSA Serva, D-Heidelberg
BSA (10x) Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe
CD14 MicroBeads, human Miltenyi, D-Bergisch Gladbach
51Chrom (Na251
CrO4) Amersham Biotech, D-Freiburg
CFSE (5 mmol / l) Molecular Probes, D-Göttingen
Collagenase Sigma-Aldrich, D-Schnelldorf
Dispase II Sigma-Aldrich, D-Schnelldorf
DMEM-Medium Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe
DMSO Merck, D-Darmstadt
dNTP Mix (10 mmol / l) Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe
Ethanol (99 %) Calbiochem, D-Schwalbach
Ethidiumbromid Sigma-Aldrich, D-Steinheim
EDTA Sigma-Aldrich, D-Steinheim
FACSFlow™ Becton Dickinson, D-Heidelberg
FCS Biochrom, D-Berlin Ficoll „Biocoll Separation Solution“ Biochrom, D-Berlin
Geneticin G-418 Sulfat (Neomycin) Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe
Glykogen-Lösung Amersham Biotech, D-Freiburg
Glycerol (99 %) Sigma-Aldrich, D-Steinheim
HEPES (1 mol / l) Biochrom, D-Berlin
Ionomycin Sigma-Aldrich, D-Schnelldorf
Isopropanol (2-Propanol, 99 %) Sigma-Aldrich, D-Schnelldorf Kanamycin-Sulfat Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe LB-Agar-Medium (Kapseln) Q-Biogene, D-Heidelberg
L-Glutamin Biochrom, D-Berlin
Ligase-Puffer (10 x) New England Biolabs (NEB), D-Schwalbach
LPS Sigma-Aldrich, D-Steinheim
Liquemin N 25000 (L-Heparin) Roche, D-Mannheim
MgCl Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe
NaN3 Merck, D-Darmstadt
NaCl Roth, D-Karlsruhe
Optimem-Medium Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe
Optiphase “Super-Mix” Wallac, F-Turku
PBS (D-PBS, 10 x) Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe
PCR-Puffer (10 x) NEB, D-Schwalbach
Penicillin/Streptomycin 100x Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe
PHA Sigma-Aldrich, D-Steinheim
PMA Sigma-Aldrich, D-Steinheim
RPMI-Medium 1640 Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe
SDS Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe
S.O.C.-Medium Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe
Sodium-Pyruvat Biochrom, D-Berlin
Stickstoff Linde, D-Höllriegelskreuth
Szintillationsflüssigkeit “Betaplate Scint 3[H]“ Wallac, F-Turku
TAE-Puffer (10x) Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe
3[H]-Thymidin Amersham TRU 120 (1 mCi / ml) Amersham-B., D-Braunschweig Trypanblau (0,4 %) Sigma-Aldrich, D-Steinheim Trypsin / EDTA Solution (1x) Biochrom, D-Berlin
Tween® 20 Calbiochem, D-Schwalbach
Kits
BD Cytoperm / Cytofix Becton Dickinson, D-Heidelberg DuoSet Human GM-CSF-ELISA R&D-Systems, D-Wiesbaden Lipofectamine™ 2000 Reagent Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe
QIAprep Miniprep Kit Qiagen, D-Hilden
QIAgen Plasmid Midi und Maxi Kit Qiagen, D-Hilden QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen, D-Hilden QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, D-Hilden
MHC-Pentamere (HLA-A*0201 MHC Pro5™)
M1-MHC-Pentamer Proimmun, UK-Oxford
(M1-Peptidsequenz: GILGFVFTL)
NY-ESO-1-MHC-Pentamer Proimmun, UK-Oxford
(NY-ESO-1-Peptidsequenz: SLLMWITQC)
Enzyme
Hind III und Bgl II Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe Mlu I, Kpn I, Bam HI und Eco RI NEB, D-Schwalbach
T4-DNA-Ligase Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe
Taq-Polymerase Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe
Zytokine
GM-CSF R&D Systems, D-Wiebaden
IL-2 (Proleukin) Chiron, N-Amsterdam
IL-4 R&D Systems, D-Wiesbaden
Molekulargewichtsmarker
1 kb DNA Längenstandard NEB, D-Schwalbach
100 bp Marker NEB, D-Schwalbach
λ DNA / Hind III Fragment-Leiter NEB, D-Schwalbach
3.1.4 Häufig verwendete Puffer FACS-Puffer
1x PBS; 10 % FCS (v / v); 1 mg / ml NaN3
MACS-Puffer
1x PBS, 5 mg / ml BSA, 2 mmol / l EDTA
Die Lagerung der Puffer erfolgte bei 4 °C. Der MACS -Puffer wurde vor Gebrauch sterilfilt-riert.
3.1.5 Biologische Materialien
3.1.5.1 Bakterienstämme
E. coli TOP10 Gibco-Invitrogen, D-Karlsruhe
Genotyp: F [lacIq Tn10 (tetR)] mcr A ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) ϕ80 lacZ ∆M15 ∆lacX74 recA1 deoR araD139 ∆(ara-leu)7697 gal/U gal/K rpsL (strR) endA1 nupG
Die Bakterien wurden bei -80 °C gelagert.
3.1.5.2 Eukaryontische Zellen
Sofern nicht anders angegeben, wurden die nachfolgend aufgeführten Zelllinien von ATCC (Manassas, USA) bezogen.
Daudi (ATCC-Nr.: CCL-213)
Bei der Daudi-Zelllinie handelt es sich um B-Lymphoblasten, die von einem männlichen, schwarzhäutigen Jungen mit Burkitt´s Lymphom abstammen (KLEIN et al., 1967). Auf-grund eines genetischen Defektes im Bereich des β2-Mikroglobulins sind diese Zellen nicht in der Lage, funktionelle MHC-Klasse-I-Moleküle zu konstruieren und an ihrer Oberfläche zu präsentieren. Die in Suspension wachsenden Zellen sind MHC-Klasse-II-positiv.
K562 (ATCC-Nr.: CLL-243)
Die permanente Zelllinie K562 wurde aus der Pleuralflüssigkeit einer 53 Jahre alten Frau mit chronischer, myeloischer Leukämie gewonnen (LOZZIO und LOZZIO, 1975). Es han-delt sich um eine, zur Granulozytenserie gehörende, hoch undifferenzierte Zellpopulation.
K562-Zellen weisen einen genetischen Defekt im Bereich des MHC-Lokus auf und sind aus diesem Grund nicht in der Lage, MHC-Klasse-I-Moleküle zu exprimieren.
T2 (ATCC-Nr.: CLL-1992)
Die T2-Zelllinie stellt eine Fusion einer lymphoblastoiden B-Zelllinie, die eine Deletion in den MHC-Klasse-II-Molekülen aufweist, mit der T-Zelllinie CEM dar (SAVAGE et al., 2004). Die Syntheserate der MHC-Klasse-I-Moleküle ist bei der T2-Zelllinie normal. Auf-grund einer Mutation des TAP1- und TAP2-Gens ist die Peptidbeladung im ER allerdings unzureichend. Daraus resultiert eine Instabilität der nicht-peptidbeladenen MHC-Klasse-I-Moleküle und somit eine reduzierte Zelloberflächenexpression von HLA-A2-MHC-Klasse-I-Molekülen.
Durch Inkubation der T2-Zellen mit HLA-A2-restringierten Peptiden kann die Expression der MHC-Klasse-I-Moleküle erhöht werden, indem das jeweilige Peptid die unbeladenen MHC-Klasse-I-Moleküle stabilisiert und dadurch die Dichte an MHC-Peptid-Komplexen an der Zelloberfläche erhöht. Aufgrund dieser Eigenschaft können T2-Zellen als Targetzellen in verschiedenen Assays eingesetzt werden.
NIH/3T3 CD40L
NIH/3T3 CD40L-Zellen wurden durch stabile Transfektion der permanenten Maus-fibroblastenzelllinie NIH/3T3 (ATCC-Nr.: CLL-1658) mit dem Oberflächenmolekül CD40L hergestellt. Sie wurden für die Stimulation von Daudi-Zellen verwendet. Die Zelllinie wurde
uns freundlicherweise von Britta Maecker (Transplantations-Forschungszentrum, MHH) zur Verfügung gestellt.
NW-38-Mel
NW-38-Mel-Zellen wurden von Elke Jäger (Medizinische Klinik Hämatologie-Onkologie, Frankfurt) aus einem Patienten mit malignem Melanom isoliert. Es handelt sich um eine HLA-A2-positive Tumorzelllinie, die uns freundlicherweise zur Verfügung gestellt wurde.
Hlx Pxt
Hlx Pxt-Zellen stellen eine Hepatomazelllinie dar. Sie wurden aus einem Patienten mit he-patozellulärem Karzinom isoliert. Sie exprimieren an ihrer Oberfläche das MHC-Klasse-I-Molekül HLA-A2.
3.1.5.3 HLA-A2-positives Blut
Das Blut HLA-A2-positiver, gesunder Spender stammte aus der Blutbank der Medizini-schen Hochschule Hannover. Es wurde benötigt, um die Funktionalität der generierten Daudi M1-SC-Zellen zu überprüfen.
Buffy coats, die der Herstellung des TCGF-Mediums dienten, wurden von der Blutbank des Universitätsklinikums Göttingen bezogen.
Neben Blut gesunder Spender wurde zur Überprüfung der Effektivität der hergestellten aAPCs ebenfalls Blut von Patienten verwendet, die an einem gastrointestinalen Karzinom (Stadium IV) litten. Diese Patienten wiesen aufgrund einer palliativen Chemotherapie (FOLFOX4) eine Immunsuppression auf. Das Blut wurde den Patienten im Rahmen eines Aufenthaltes in der onkologischen Tagesklinik der Medizinischen Hochschule Hannover entnommen.
Des Weiteren wurde Blut von HLA-A2-positiven Patienten verwendet, die an einem hepa-tozellulären Karzinom (HCC) erkrankt waren. Personen mit einem solchen Krankheitsbild weisen in der Mehrzahl aller Fälle einen erhöhten Serumspiegel an AFP auf (BUTTERFIELD, 2004). Eine Expression von NY-ESO-1 konnte ebenfalls in einem Teil der Patienten festgestellt werde (BUTTERFIELD, 2004). Gegen beide Tumorantigene kam es zu nachweisbaren Immunreaktionen (VOLLMER, Jr. et al., 1999; BUTTERFIELD et al.,
2003; KORANGY et al., 2004). Die aus dem Patientenblut isolierten PBMCs wurden ein-gesetzt, um die generierten AFP-SC- bzw. NY-ESO-SC-exprimierenden aAPCs auf Funk-tionalität zu testen.
Die durchgeführten Versuche wurden von der Ethikkommission der Medizinischen Hoch-schule Hannover genehmigt.
3.1.5.4 Mäuse
Die tierexperimentellen Versuche wurden mit NOD/LtSz-scid (non-obese diabetical severe combined immunodeficiency)-Mäusen durchgeführt. Die scid-Mutation ist durch einen De-fekt des Prkdc-Gens gekennzeichnet, der eine gestörte VDJ-Rekombination zur Folge hat.
Betroffene Tiere weisen eine schwere B- und T-Zell-Defizienz auf (BOSMA et al., 1983).
Durch Rückkreuzung der scid-Mutation auf den NOD/Lt-Hintergrund wurde ein neuer, transgener Mausstamm entwickelt, der neben der schweren Defizienz des adaptiven Im-munsystems eine reduzierte Funktionalität des angeborenen ImIm-munsystems aufweist. So konnte in NOD/LtSz-scid-Mäusen ein Mangel an zirkulierenden Komplementfaktoren und eine Beeinträchtigung der Differenzierung und Funktionalität von APCs sowie von NK-Zellen festgestellt werden (SHULTZ et al., 1995). Demzufolge eignen sich NOD/LtSz-scid-Mäuse besonders gut zur Transplantation humaner (xenogener) Tumoren.
Die Tiere wurden in einem Alter von 6 bis 12 Wochen vom Zentralen Tierlabor der Medizi-nischen Hochschule Hannover bezogen und während der Versuche unter keimfreien Be-dingungen im Tierlabor des Forschungszentrums Oststadt gehalten. Futter und Wasser standen den Tieren ad libitum zur Verfügung. Alle Tierversuche unterlagen tierschutzrecht-lichen Bestimmungen und wurden unter der Versuchstiernummer 05 / 965 von der zustän-digen Behörde genehmigt.
3.1.6 Kulturmedien
Das in der Zellkultur eingesetzte Serum (FCS und humanes AB-Serum) wurde vor Gebrauch für 45 min bei 56 °C hitzeinaktiviert, um d ie hitzesensitiven Komponenten des Komplementsystems zu entfernen.
3.1.6.1 Medien für Bakterien
LB-Medium und LB-Agar-Platten für die Kultur bzw. Anzucht von Bakterien wurden ent-sprechend Herstellerangaben aus Kapseln hergestellt. Zur Selektion erfolgreich transfor-mierter Bakterien erfolgte die Zugabe entsprechender Antibiotika.
LB-Medium und LB-Agar-Platten für die Kultur bzw. Anzucht von Bakterien wurden ent-sprechend Herstellerangaben aus Kapseln hergestellt. Zur Selektion erfolgreich transfor-mierter Bakterien erfolgte die Zugabe entsprechender Antibiotika.