Raster-Elektronenmikroskopie (REM)

Mit Hilfe der REM sollten Veränderungen der Epitheloberfläche, hervorgerufen durch das Lasern des Epithels sowie durch die Applikation von BAC, manifestiert werden. Es ist be-kannt, dass einige pharmazeutisch verwendete Substanzen Veränderungen der Hornhaut her-vorrufen, so verursacht z.B. Tetracain, neben vielen anderen ophthalmologischen Pharmaka,

einen Verlust von Oberflächenmikrovilli [335], eine Störung im Aufbau der Zellmembranen und ein Klumpen der Tonofilamente [336], was durch REM sichtbar gemacht werden konnte.

Zunächst soll der Einfluss von BAC auf die Epithelmorphologie der Cornea untersucht werden. Abb. 39 zeigt die Aufsicht auf intaktes Epithel unbehandelter Cornea (links), in der die Epithelzellen ein polygonales Mosaik formen. Deutlich zu erkennen sind die Begren-zungen zwischen den einzelnen Zellen. Rechts (Abb. 39) ist eine Cornea abgebildet, die 5 h in GBR, versetzt mit 0.01% BAC, inkubiert wurde. In dieser Aufnahme wird ersichtlich, dass sich einige Ecken der Oberflächenzellen von der darunterliegenden Epithelschicht abgelöst bzw. abgeschuppt haben, wodurch die darunterliegende Zellschicht Zellkernbeulen aufweist (Bläschen auf dem gesamten Epithel). Pfister et al. [337] beobachteten an Kaninchenaugen bereits 15 min nach Applikation von 0.01% BAC eine Loslösung der Oberflächenepithel-zellen voneinander und ein gleichzeitig einsetzendes Schuppen.

Abb. 39: links: Schweinecornea unbehandelt, rechts: nach Inkubation in GBR/0.01% BAC, Aufsicht; x 500

In Abb. 40 sind die gleichen Gewebeausschnitte wie in Abb. 39, aber in stärkerer Vergrös-serung (1:10), dargestellt. Im linken Bild ist deutlich eine Zellbegrenzung zu erkennen, und die Mikrovilli erscheinen als weiße Pünktchen. Die rechte Abb. zeigt eine Zellkernerhebung, die durch die Inkubation mit BAC hervorgerufen wurde. Die erste Zellschicht hat sich bereits abgeschält, und die darunterliegende Schicht mit der Erhebung wird sichtbar. In Nachbar-schaft zu dem erhabenen Zellkern befindet sich eine Vertiefung, die die Lokalisierung des Zellkerns einer Zelle der bereits abgeschälten, vormals darüberliegenden Schicht kennzeich-net. Ähnlich wie in der Arbeit von Pfister et al. [337] wurde ein Verlust sowie eine Verklei-nerung der Mikrovilli beobachtet. Nach 30 min stellte die Arbeitsgruppe Pfister [337] bei ihren in vivo-Untersuchungen eine aktive Migration von cornealen Epithelzellen fest,

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den mit einer starken Membrandegeneration, und nach 3 h fand ein Abrollen der ersten Zell-schicht statt.

Schädigungen des cornealen Epithels können jedoch vom Gewebe selbst repariert werden.

Die Reparatur in vivo ist ein biphasischer Prozess, bei dem zunächst über 5-6 h keine Epithel-zellmigration auftritt (latente Phase) und dann das bloße Stroma von den noch vorhandenen, in Migration befindlichen Epithelzellen bedeckt wird [338]. Die Zellproliferation wird nach-folgend initiiert und die normalen 4-6 Zellschichten des Epithels werden wieder hergestellt.

Abb. 40: links: Schweinecornea unbehandelt, rechts: nach Inkubation in GBR/0.01% BAC, Aufsicht; x 5000

Schlussfolgernd aus den BAC-Versuchen ist eine Anwendung von BAC als Konservierungs-mittel in Augentropfen nur unter Vorbehalt zu empfehlen. Für die gefundenen Permeations-steigerungen (vgl. 4.2.4.1) ergibt sich aus den durch REM sichtbar gemachten Epithelschä-digungen eine plausible Erklärung.

Im Folgenden sollen die REM-Aufnahmen, die von gelaserter Cornea aufgenommen wurden, interpretiert werden. Die Abb. 41-43 zeigen Querschnitte gelaserter Hornhaut mit den jeweili-gen Ablationsstufen 25, 50, 75 und 100%. Mit Zunahme der Ablationstiefe ist deutlich eine Reliefbildung zu verifizieren. Der Excimer-Laser rastert die Hornhaut ab und setzt seine Laserpulse bei jedem Durchlauf an die gleiche Position auf der Cornea, so dass die Hornhaut nur unregelmäßig entfernt wird und ein Streifenmuster entsteht. Durch eine höhere Auflösung ließe sich dieses Phänomen allerdings verringern. Bei höherer Auflösung überlappen sich die Pixel, die der Laser pulsweise abrastert, stärker, und die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von ungelaserten Flächen wird geringer.

Abb. 41: links: Schweinecornea unbehandelt, rechts: mit 75% Epithel, Querschnitt; x 50

Abb. 42: links: Schweinecornea mit 50%Epithel, rechts: mit 25% Epithel, Querschnitt; x 50

Abb. 43: Schweinecornea ohne Epithel, Querschnitt; x 50

In Abb. 43 ist eine Cornea ohne Epithel dargestellt, in der erwartungsgemäß kein Streifen-muster mehr zu identifizieren ist. Lediglich die Kollagenfasern des Stromas sind zu erkennen.

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Eine weitere Aussage, die aufgrund der Querschnitte getroffen werden kann, ist, dass die Laserstrahlung tatsächlich nur Auswirkungen auf die Oberfläche des Epithels hat. Unter der Oberfläche liegende Zellschichten werden von der Laserstrahlung nicht erfasst, wie Quer-schnitte stärkerer Vergrößerung belegen (Abb. 44). Den REM-Aufnahmen kann entnommen werden, dass sich die Integrität der einzelnen Zellschichten unter der Oberfläche des Epithels von unbehandelter Cornea und Cornea, der 50% des Epithels abladiert wurde, nicht unter-scheiden. Dieses war auch nicht zu erwarten, denn die Eindringtiefe des Laserstrahls in ein Gewebe ist geringer als der durchschnittliche Zelldurchmesser. Ähnliches beobachteten Pulia-fito et al. [339], die Excimer-Laserstrahlung an entnommenen Kälberhornhäuten testeten und nur minimale strukturelle Veränderungen feststellten.

Abb. 44: links: Schweinecornea unbehandelt, rechts: mit 50% Epithel, Querschnitt, x 1000 Ob die Laserstrahlung intrazelluläre Auswirkungen hat, ist anhand dieser Aufnahmen nicht zu verifizieren. In diesem Zusammenhang sei aber auf die mutagene und kanzerogene Wirkung von UV-Strahlung hingewiesen [340]. Seiler et al. [341] untersuchten den Effekt von Ex-cimer-Laserstrahlung an Hefezellen mit Hilfe von Fotoreaktivierungsversuchen und fanden eine signifikante Reparaturrate der DNA in den Zellen. Aufgrund der Ähnlichkeit der Hefe-zellen mit cornealen EpithelHefe-zellen wird eine gute Korrelation angenommen. Es besteht die Möglichkeit eines Zelltodes oder einer Mutation der Epithelzellen durch eine DNA-Zer-störung, die durch die Laserstrahlung hervorgerufen wird.

Die gelaserten Hornhäute (Abb. 45/46) ähneln, unabhängig von der Ablationstiefe, den Horn-häuten, die in GBR/BAC 0.01% inkubiert wurden (Abb. 39/40). Hervorgerufen durch die Laserstrahlung, die jeweils die Oberflächenschicht abdampft, schält sich die neue Oberfläche teilweise ab und rollt sich zusammen. Außerdem sind deutliche Membranschädigungen durch Löcher in der obersten Zellschicht zu erkennen, die durch eine starke Aktivität der Retrak-tionsfibrillen verursacht sein könnte, wie sie z.B. durch den Zusatz von BAC ebenfalls auftritt

[337]. Die rechte REM-Aufnahme in Abb. 46 zeigt eine Hornhaut ohne Epithel und ohne Bowman-Membran mit den typischen Kollagenfasern des Stromas.

Abb. 45: links: Schweinecornea mit 75% Epithel, rechts: mit 50% Epithel, Aufsicht; x 5000

Abb. 46: links: Schweinecornea mit 25% Epithel, rechts: ohne Epithel, Aufsicht; x 5000 Resultierend aus den Ergebnissen der REM-Untersuchungen von gelaserten Hornhäuten wird postuliert, dass das Lasern in cornealem Epithel zu wenig sichtbaren Veränderungen dieser Zellschichten führt und deshalb prinzipiell geeignet ist, die Schichtdicke zu verringern. Es findet lediglich eine Auflockerung und Schädigung der Epithelzellen statt, die nach dem Lasern als neue Oberfläche fungieren.

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4.3 Zellkulturen