EXPERIMENTELLER TEIL
5.2.6 Permeation durch isolierte Cornea/Sklera und Nephrophan ® .1 Permeationsapparatur 1)
Ein von unserer Arbeitsgruppe entwickeltes Permeationsmodell [73] aus Acrylglas® (Grün-berg Kunststoffe, Rödermark) wurde vorrangig, neben den Untersuchungen zur Wirkstoffauf-nahme in okulare Gewebe, zur Ermittlung des Permeationsverhaltens von P-HCl, D-Na und MMF bzw. MPA durch SC, SS und NP genutzt. Weiterhin wurden damit die Permeation von P-HCl und D-Na durch Hornhäute unterschiedlicher Epitheldicken untersucht und die Ein-flüsse der Hilfsstoffe BAC und EDTA auf die cornealen Diffusionseigenschaften von P-HCl bestimmt. Zur Bestimmung des Arzneistoffgehalts nach erfolgter Permeation in den Geweben (Penetrationsstudien, vgl. 5.2.5), diente ebenfalls dieses Ussing-Kammer-System.
Das Modell wurde in Anlehnung an eine im Arbeitskreis bereits etablierte Gleichgewichts-dialysezelle [354] in der Art und Weise modifiziert, dass die Auflagefläche für die Permea-tionsbarrieren auf der Donatorseite als zirkuläre Vertiefung und auf der Akzeptorseite als ringförmige Erhebung konzipiert wurden (Abb. 49). Neben einer sicheren Fixierung der Membran zwischen den beiden Halbzellen gewährleistet diese Konstruktion, dass die anato-misch bedingten Krümmungen der Cornea und der Sklera (Kurvatur) aufrecht erhalten bleiben. In die Donatorhalbzelle sind zur Befüllung des Kompartiments zwei Serumkanülen Nr. IV (mlw Injecta, Steinach) im Winkel von 30° eingelassen, während das
Akzeptorkom-partiment durch zwei im Winkel von 180° angeordnete messingverstärkte Bohrungen konti-nuierlich mit Akzeptorflüssigkeit durchspült werden kann.
Abb. 49: Permeationszelle
5.2.6.2 Versuchsdesign
Die Versuchsbedingungen sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst.
Standardbedingungen bei den Permeationsuntersuchungen
Permeationsfläche 0.5 cm2
Donatorvolumen 1.00 ml
Donatorflüssigkeitsvolumen 1.00 ml
Akzeptorvolumen 1.00 ml
Akzeptorflüssigkeitsvolumen 20.0 ml
Probenvolumen 1.00 ml
Pufferlösung für P-HCl GBR
Pufferlösung für D-Na GBR/PG
Pufferlösung für MMF GBR/HP-β-CD
Pufferlösung für MPA GBR/HP-β-CD
Membran SC, SS, NP
Temperatur 33 ± 0.5 °C
Pumpe Ismatec (Glattbrugg-Zürich, CH)
SC und SS wurden, wie bereits beschrieben (vgl. 5.2.3.1/2) innerhalb von zwei Stunden nach Schlachtung der Tiere präpariert und vorsichtig mit Hilfe eines Trepans auf den erforderlichen Durchmesser von 1.2 cm ausgestanzt. Bei diesem Arbeitsschritt war größte Sorgfalt erforder-lich, um die Gewebe nicht zu verletzen.
Eine Nephrophan®-Dialysemembran (regenerierte Cellulose, Porengröße ca. 2.4 nm, Dicke 14-15 µm, mit Sorbitol und Glycerol als Weichmacher imprägniert, Filmfabrik Wolfen)
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te als synthetische Membran für Permeationsstudien. Die Membran wurde vor Versuchsbe-ginn 60 min in Wasser eingelegt und dann 10 min gespült, um die Weichmacher zu entfernen und um für jeden Versuch gleiche Bedingungen zu sichern. Anschließend wurden die vorbe-reiteten Membranen mit Hilfe eines Trepans ausgestanzt (1.2 cm ∅).
Abb. 50: Permeationsapparatur für Schweinecornea, -sklera und Nephrophan®
Die isolierten Gewebe und NP wurden vor dem jeweiligen Versuch kurz in GBR getaucht und anschließend mit einer feinen Pinzette vorsichtig auf der Donatorhalbzelle positioniert bzw.
zentriert. Dabei wurde darauf geachtet, dass die epitheliale Seite der Cornea bzw. die Außen-seite der Sklera der DonatorAußen-seite zugewandt war. Mit jeweils drei Muttern (467 Ni, Schrauben Scholz, Berlin) wurden die beiden Zellenhälften verschraubt und die Gewebe damit so be-festigt, dass eine Faltenbildung vermieden werden konnte. Jeweils sechs Zellen wurden über Distanzstücke auf einem Gestänge etabliert und in ein Wasserbad eingesetzt, das auf 33 ± 0.5°
C thermostatiert (T Lauda, Lauda Dr. R. Wobser GmbH & Co. KG., Lauda-Königshofen) war.
Die entsprechende Arzneistofflösung (vgl. 4.2.4/5/6) wurde in eine Injektionsspritze (5 cm3) (Record mlw Injecta, Steinach) aufgezogen und anschließend in die Donatorhalbzelle (1.0 ml) gefüllt. Die auf 33° C vortemperierten Pufferlösungen wurden über Silikonschläuche mit den Akzeptorhalbzellen verbunden und mit Hilfe einer Ismatec-Pumpe (siehe Tabelle) kontinu-ierlich umgepumpt, so dass eine ausreichende Agitation garantiert war. Bei einer Experiment-dauer von 5 h wurde alle 30 min 1.0 ml des Akzeptormediums entnommen und durch vorge-wärmtes, frisches Akzeptormedium ersetzt. Die Gehaltsbestimmung der Arzneistoffe in den Proben erfolgte mittels HPLC (5.2.2). Nach der Permeation wurden die Gewebe mit Trypan-blau-Lösung bzw. Fluoreszein-Lösung auf Vitalität geprüft (vgl. 5.2.6.3).
5.2.6.3 Integritäts- und Vitalitätsprüfung von Schweinecornea
Zur Prüfung der Integrität und Vitalität der isolierten Gewebe vor und nach den Permeations-versuchen wurden Färbemethoden eingesetzt. Ein verwendeter Farbstoff war Fluoreszein, der epitheliale Defekte der Cornea anfärbt [355]. Die Inkubation frisch isolierter Hornhäute in Fluoreszeinlösung 0.5% (5 min) ergab punktuell gelbe Färbungen, die aber makroskopisch kaum sichtbar waren. Diese gelben Verfärbungen zeigten nach den fünfstündigen Permea-tionsexperimenten ein größeres Ausmaß und wurden durch Betrachtung unter UV-Licht in-tensiviert.
Als Färbemittel zur Vitalitätsprüfung wurde Trypanblau-Lösung (0.4%) verwendet, die ledig-lich tote Zellen anfärbt [355]. Die Ergebnisse mit Trypanblau-Lösung waren vergleichbar mit denen unter Verwendung von Fluoreszein. Direkt nach der Isolierung waren punktuell abge-storbene Zellen durch Blaufärbung zu erkennen, die nach der Permeation häufiger und groß-flächiger auftraten. Als Negativkontrolle gelangten mit 1%iger Triton ®-X-100-Lösung be-handelte Gewebe zum Einsatz (5 min).
5.2.7 Permeation durch isolierte Kaninchenkonjunktiva 5.2.7.1 Gewebeisolierung und Permeationsapparatur
Männliche pigmentierte Kaninchen mit einem Körpergewicht von 2.5-3.0 kg wurden von Irish Farms (Los Angeles, USA) bezogen. Die Untersuchungen, an denen Kaninchen beteiligt waren, wurden gemäß den Guiding Principles in the Care and Use of Animals (DHEW Publi-cation, NIH 80-23), der ARVO Resolution on the Use of Animals in Research und der Dekla-ration of Helsinki durchgeführt.
Um konjunktivales Gewebe zu isolieren, wurden die Kaninchen mit einer Injektion von Pen-tobarbital-Na (85mg/kg Körpergewicht) in eine am Rand des Ohres befindliche Vene getötet.
Wie in Abb. 51/1. gezeigt, wurde der Augapfel vorsichtig aus der Augenhöhle entfernt - dabei sollte das Skalpell von der Konjunktiva abgewandt sein - und anschließend in vorgewärmtem BR (pH 7.4, 37° C) aufbewahrt.
Die Konjunktiva wurde sorgfältig zugeschnitten, um nicht dazugehörige Teile abzutrennen (Abb. 51/2.). Der Augapfel mit der noch anhaftenden, zugeschnittenen Konjunktiva (Abb.
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51/3.) wurde dann in die Mitte eines speziell gefertigten Gewebeadapters platziert, dessen kreisrunde Öffnung eine Fläche von 1.0 cm2 aufwies (Abb. 51/4.). Die Öffnung des Adapters ist mit einem Weichsilikonring umgeben, der mit einer kleinen Menge Hochvakuum-Schmier-stoff (Dow Corning) versehen war. Um diesen Silikonring waren 4 mm lange Nadeln kreis-förmig in einem Abstand von 1 cm angeordnet. Nach vorsichtiger Befestigung des Gewebes an den Nadeln des Adapters, ohne die Konjunktiva dabei zu dehnen, wurde der Augapfel von der Konjunktiva entfernt. Das befestigte Gewebe, welches einer vorherigen makroskopischen Integritätsprüfung unterlag, wurde durch das Aufsetzen des Adaptergegenstücks gesichert.
Das Gegenstück war ebenfalls mit einem gefetteten Silikonring versehen und mit pass-gerechten Löchern ausgestattet, in die die Nadeln des Adapterteils mit der befestigten Kon-junktiva gesteckt wurden. Diese Adapterkombination wurde dann in der Ussing-Kammer für bioelektrische Messungen platziert.
1. 2.
3. 4.
Abb. 51: Präparation von Kaninchenkonjunktiva [256], Pfeile kennzeichnen Schneiderichtung
Eine von der Arbeitsgruppe Lee modifizierte und in diesen Studien verwendete Ussing-Kam-mer [256], funktionierte nach dem gleichen Prinzip wie die für Schweineaugengewebe (vgl.
5.2.6.1). Der Gewebeadapter wurde zwischen zwei Acrylglas®-Blöcke geklemmt, deren Öf-fnungen zueinander zeigten. Dabei war die muköse Seite der Konjunktiva der Donatorhälfte zugewandt. Die Acrylglas®-Blöcke wiederum waren paarweise (jeweils zwei Paare) in einem kastenförmigen Halter untergebracht, der nach oben hin offen war und an dessen Enden
Schrauben angebracht waren, um die Blöcke mit dem Adapter in der Mitte abzudichten. Der kastenförmige Halter war von einem Metallmantel umgeben, der kontinuierlich von auf 37° C vorgewärmtem Wasser durchflutet wurde und damit die Versuchsanordnung temperierte.
Insgesamt konnten vier Kammern gleichzeitig betrieben werden.
5.2.7.2 Bioelektrische Messungen
Um die Lebensfähigkeit und Integrität der konjunktivalen Gewebe einzuschätzen, wurden die spontan entwickelte transepitheliale elektrische Potentialdifferenz (PD) und der Widerstand (TEER) mit einer automatischen Spannungsklemme (558C-5, University of Iowa, Bioen-gineering Department, Iowa city, USA) überwacht. Die Daten wurden alle 30 min während des Experimentes aufgezeichnet sowie vor und nach jedem Versuch.
Die PD wurde als Index für den aktiven Netto-Ionentransport betrachtet und TEER als Index für die Integrität der Tight junctions des isolierten Gewebes. Die PD wurde mit einem Paar Kalomelelektroden gemessen. Zwei Polyethylen-Brücken (PE 90) (gefüllt mit 4% Agar in 3 mol/l KCl), deren Enden nahe dem Zentrum der Gewebeoberflächen lokalisiert waren, wur-den genutzt, um die Flüssigkeiten, in die die Elektrowur-den getaucht waren mit dem Donator-bzw. Akzeptormedium elektrisch zu verbinden. Der elektrische Output der Kalomelelektroden wurde durch die Spannungsklemme verstärkt. Der direkte Strom wurde mittels Ag/AgCl-Elektroden-Paar durch die Konjunktiva gesendet, das wiederum über Polyethylen-90-Brücken mit dem Donator- bzw. Akzeptormedium verbunden war. Diese Brücken waren entfernt von den Gewebeoberflächen positioniert. Der Kurzschluss-Strom (ISC), der in Richtung Puffer-Ge-webe-Puffer floss, wurde durch einen Strip Chart Recorder (Kipp and Zonen, Delft, The Netherlands) überwacht und aufgezeichnet. In 60 s-Intervallen wurde ein 2 mV Puls (∆V) für 3 s durch das Gewebe geschickt, um den TEER zu bestimmen. Der Widerstand wurde als oberflächennormalisiertes Verhältnis vom auferlegten Spannungspuls zur gemessenen Ablen-kung des resultierenden Stromes (∆I) berechnet:
TEER = (∆V/∆I)A,
wobei A die nominale Oberfläche (1 cm2) der Ussing-Kammer-Öffnung ist. Vor jedem Expe-riment wurde der Widerstand der Lösungen (<100 Ωcm2) automatisch durch die Spannungs-klemme kompensiert.
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5.2.7.3 Permeationsstudien
Nach Abdichtung der Zellen und Temperieren der Anordnung wurden 6 ml BR in jeden der Blöcke gefüllt (Donator- bzw. Akzeptorkammer) und ca. 30 min äquilibriert, bis ein kon-stanter ISC zu verzeichnen war. Nach der Äquilibrierung wurde der Puffer aus der Donator-kammer mittels Vakuumpumpe entfernt und mit frisch hergestellter Arzneistofflösung (vgl.
4.2.4.4) wieder aufgefüllt. Nach 30, 60, 120 und 180 min wurden jeweils 0.5 ml aus dem Ak-zeptormedium für HPLC-Messungen (vgl. 5.2.2) entnommen. Die entnommene Probe wurde sofort durch temperierten Puffer ersetzt. Die Untersuchungen wurden bei 36 ± 1.0° C und unter 95% Luft/5% CO2-Begasung durchgeführt.
Standardbedingungen bei den Permeationsuntersuchungen Permeationsfläche 1.0 cm2
Donatorvolumen 6.00 ml
Donatorflüssigkeitsvolumen 6.00 ml
Akzeptorvolumen 6.00 ml
Akzeptorflüssigkeitsvolumen 6.00 ml
Pufferlösung BR
Probenvolumen 0.5 ml
Membran KK
Temperatur 36 ± 1.0°C
95% Luft/5% CO2 - Begasung
5.2.8 Permeation nach Excimer-Laser-Behandlung