HERACLITUS
Zellkulturen
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.) im Fach Pharmazie
eingereicht an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Humboldt-Universität zu Berlin
von
Martina Scholz geboren am 28.09.1971
in Boizenburg/Elbe
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin Prof. Dr. J. Mlynek
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I Prof. Dr. M. Linscheid
Gutachter/innen: 1. Prof. Dr. Sigrid Keipert 2. Prof. Dr. Uwe Pleyer 3. Prof. Dr. Andreas Langner Tag der mündlichen Prüfung:
Meiner Betreuerin Frau Prof. Dr. Keipert danke ich für die Überlassung des Dissertations- themas sowie für zahlreiche Anregungen und Diskussionen.
Institut für Pharmazie der Humboldt-Universität zu Berlin
Den Mitgliedern der Arbeitsgruppe Pharmazeutische Technologie und allen Mitarbeitern des Institutes danke ich für die Unterstützung bei meiner Arbeit. Ein besonderer Dank gilt dem ehemaligen Kollegen Herrn Dr. Burkhard Siefert für die Einführung in die Thematik der in vitro-Permeationen. Frau Ilse Fleischer danke ich für die tatkräftige und sehr zuverlässige Unterstützung bei den Mycophenolatmofetil-Untersuchungen.
Der studentischen Mitarbeiterin Frau Carola Flenner möchte ich an dieser Stelle für die sehr fruchtbare Zusammenarbeit danken, die in einer freundschaftlichen Atmosphäre stattfand und über das kollegiale Maß hinausging.
Institut für Ophthalmologie, Charité, Humboldt-Universität zu Berlin
Weiterhin bedanke ich mich bei Herrn Prof. Dr. Uwe Pleyer für die Kooperation im Rah- men des Excimer-Laser-Projektes und für die Anregungen zur Formulierungsentwicklung von Mycophenolatmofetil. Herrn Dr. Stefan Schründer und Herrn Sven Gärtner sei herzlich dafür gedankt, dass sie auch außerhalb ihrer Arbeitszeiten bereit waren, mir das Arbeiten mit dem Excimer-Laser zu ermöglichen und Probleme zu beseitigen.
Department of Pharmaceutical Sciences, University of Southern California, Los Angeles, USA
Herrn Prof. Dr. Vincent H. L. Lee, Vorsitzender des o.g. Institutes, möchte ich meinen Dank für die Möglichkeit, 6 Monate in seinem Labor forschen zu dürfen, aussprechen. Beim gesamtem Team des Labors möchte ich mich herzlich für die Hilfe auf beruflicher und privater Ebene bedanken.
Bei Herrn Hovhannes Gukasyan, Herrn Ashutosh Kulkarni und Herrn Mohamed Qaddoumi bedanke ich mich besonders für die Aufbereitung der Kaninchenkonjunktiva- gewebe. Frau Joan-en Chang Lin hat mir nicht nur sämtliche Kaninchencornea- und Kaninchenkonjunktivaepithelzellkulturen zur Verfügung gestellt, sondern hatte auch stets ein offenes Ohr für fachliche und persönliche Probleme meinerseits. Weiterhin bin ich Frau Prof. Dr. Lee-Yong Lim, die zur gleichen Zeit als Gast in diesem Labor tätig war, zu großem Dank verpflichtet, da sie einen erheblichen Beitrag zur Bestimmung der bioelektrischen Para- meter der Zellkulturen geleistet hat.
Der größte Dank gilt meinen Eltern für deren Unterstützung während meiner Promotion sowie meinem Partner Herrn Alexander Gnann, der für meine technische Ausstattung gesorgt hat und mir seelischen Beistand in krisenreichen Phasen leistete.
Abkürzungsverzeichnis
1 EINLEITUNG 5
2 PROBLEMSTELLUNG 7
3 THEORETISCHE GRUNDLAGEN 8
3.1 Anatomie, Physiologie und Funktionalität des Auges 8
3.1.1 Cornea 11
3.1.2 Sklera 13
3.1.3 Konjunktiva 14
3.2 Arznei- und Hilfsstoffe 16
3.2.1 Arzneistoffe 16
3.2.1.1 Pilocarpin 16
3.2.1.1.1 Eigenschaften 17
3.2.1.1.2 Pharmakologie 19
3.2.1.2 Diclofenac-Natrium 20
3.2.1.2.1 Eigenschaften 21
3.2.1.2.2 Pharmakologie 21
3.2.1.3 Mycophenolatmofetil 23
3.2.1.3.1 Eigenschaften 23
3.2.1.3.2 Pharmakologie 25
3.2.2 Hilfsstoffe 27
3.2.2.1 Benzalkoniumchlorid (BAC) 27
3.2.2.1.1 Eigenschaften 27
3.2.2.1.2 Anwendung und Wirkungsweise 27
3.2.2.2 Natriumedetat (EDTA) 29
3.2.2.2.1 Eigenschaften 29
3.2.2.2.2 Anwendung und Wirkungsweise 30
3.2.2.2.3 Anwendungsbeispiele für BAC und EDTA in Augentropfen 31 3.2.2.3 Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HP-β-CD) 32
3.2.2.3.1 Cyclodextrine allgemein 32
3.2.2.3.2 HP-β-CD in Ophthalmika 33
4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 37
4.1 Voruntersuchungen 37
4.1.1 Löslichkeitsversuche 37
4.1.1.1 Diclofenac-Na 37
4.1.1.2 Mycophenolatmofetil 39
4.1.2 Charakterisierung der Donatorlösungen 45
4.1.2.1 Pilocarpinhydrochlorid-Lösungen 45
4.1.2.2 Diclofenac-Natrium-Lösung 46
4.1.2.3 Mycophenolatmofetil- und Mycophenolsäure-Lösung 47 4.1.2.4 Verteilungskoeffizienten der Arzneistoffe 48
4.1.3 Proteinbestimmung von okularen Geweben 50
4.1.3.1 Allgemeines 50
4.1.3.2 Schweinecornea und Schweinesklera 51
4.1.4 Hydratationsstudien an okularen Geweben 53
4.1.4.1 Allgemeines 53
4.1.4.2 Schweinecornea 54
4.1.4.3 Schweinesklera 59
4.1.5 Wirkstoffpenetration 61
4.1.5.1 Allgemeines 61
4.1.5.2 Pilocarpin-HCl 62
4.1.5.3 Diclofenac-Na 63
4.2 In vitro-Wirkstoffpermeation 65
4.2.1 Literaturübersicht zur okularen Permeabilität 65
4.2.1.1 Corneale Permeabilität 66
4.2.1.2 Sklerale Permeabilität 69
4.2.1.3 Konjunktivale Permeabilität 70
4.2.2 Permeationsmechanismen 71
4.2.2.1 Parazelluläre Permeation 71
4.2.2.2 Transzelluläre Permeation 73
4.2.3 Effektiver Permeabilitätskoeffizient (Peff) 75
4.2.4 Pilocarpin-HCl 76
4.2.4.1 Corneale Pilocarpin-Permeation 76
4.2.4.2 Sklerale Pilocarpin-Permeation 79
4.2.4.4.1 Bioelektrische Parameter 82
4.2.4.4.2 Permeationsstudie 83
4.2.5 Diclofenac-Na 85
4.2.5.1 Corneale und sklerale Permeation 85
4.2.5.2 Vergleich von D-Na- und P-HCl-Permeation 87
4.2.5.3 Permeation durch eine synthetische Membran 89
4.2.6 Mycophenolatmofetil 90
4.2.7 Permeation durch gelaserte Schweinecornea 93
4.2.7.1 Laserchirurgie 93
4.2.7.2 Pilocarpin-HCl-Permeation 96
4.2.7.3 Diclofenac-Na-Permeation 100
4.2.7.4 Raster-Elektronenmikroskopie (REM) 102
4.3 Zellkulturen 108
4.3.1 Allgemeines 108
4.3.2 Kaninchencornea-Epithelzellkultur (KCEZ) 109
4.3.2.1 Bioelektrische Parameter 109
4.3.2.2 Permeationsstudie 110
4.3.3 Kaninchenkonjunktiva-Epithelzellkultur (KKEZ) 114
4.3.3.1 Bioelektrische Parameter 114
4.3.3.2 Permeationsstudie 114
5 EXPERIMENTELLER TEIL 119
5.1 Substanzen 119
5.1.1 Arzneistoffe 119
5.1.2 Hilfsstoffe 119
5.1.3 Weitere Chemikalien 119
5.1.4 HPLC-Fließmittel 121
5.1.5 Pufferlösungen 121
5.2 Methoden 122
5.2.1 Physikalisch-chemische Charakterisierung 122
5.2.1.1 Löslichkeitsstudien 122
5.2.1.1.1 Diclofenac-Na 122
5.2.1.1.2 Mycophenolatmofetil 122 5.2.1.2 Bestimmung der Oberflächenspannung und CMC 123
5.2.1.3 Viskosität 123
5.2.1.4 Dichte 123
5.2.1.5 Brechungsindex 124
5.2.1.6 Osmolalität 124
5.2.1.7 pH-Wert 124
5.2.1.8 Verteilungskoeffizient 124
5.2.2 Gehaltsbestimmungen 125
5.2.2.1 Pilocarpin-HCl 125
5.2.2.2 Diclofenac-Na 126
5.2.2.3 Mycophenolatmofetil und Mycophenolsäure 127
5.2.3 Proteinbestimmung 127
5.2.3.1 Präparation der Schweinecornea 127
5.2.3.2 Präparation der Schweinesklera 128
5.2.3.3 Proteinbestimmung nach Lowry 128
5.2.4 Hydratationsstudien 129
5.2.5 Penetrationsstudien 129
5.2.6 Permeation durch isolierte Cornea/Sklera und Nephrophan® 130
5.2.6.1 Permeationsapparatur 130
5.2.6.2 Versuchsdesign 131
5.2.6.3 Integritäts- und Vitalitätsprüfung von Schweinecornea 133 5.2.7 Permeation durch isolierte Kaninchenkonjunktiva 133 5.2.7.1 Gewebeisolierung und Permeationsapparatur 133
5.2.7.2 Bioelektrische Messungen 135
5.2.7.3 Permeationsstudien 136
5.2.8 Permeation nach Excimer-Laser-Behandlung 136
5.2.8.1 Excimer-Laser 136
5.2.8.2 Lasern der Hornhaut 137
5.2.9 Raster-Elektronenmikroskopie (REM) 138
5.2.9.1 Aufbau und Funktion des Gerätes 138
5.2.9.2 Probenpräparation 139
5.2.10 Permeation durch Zellkulturen 141
5.2.10.1 Kultivierung von Kaninchenkonjunktiva-Epithelzellkultur 141
5.2.10.4 Permeationsstudien 143
5.2.11 Statistik 144
6 ZUSAMMENFASSUNG 145
7 ANHANG 152
7.1 Tabellenverzeichnis 152
7.2 Abbildungsverzeichnis 153
8 LITERATURVERZEICHNIS 155
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
BAC Benzalkoniumchlorid
BPE Bovine pituitary extract (Rinder-Hypophysenextrakt)
BR Bicarbonat-Ringerlösung
BSA Bovines Serumalbumin
CD Cyclodextrin
CMC Kritische Mizellkonzentration
Cr EL Cremophor® EL
Cr RH 40 Cremophor® RH 40
DMEM Dulbecco’s modifiziertes Eagle’s Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonucleic acid
D-Na Diclofenac-Natrium
dpt Dioptrie
EDTA Ethylendiamintetraacetat-Natrium
EEC European Economic Community (Europäische Wirtschaftsgemeinschaft) EGF Epidermal growth factor (epidermaler Wachstumsfaktor)
F12 Ham’s Nährstoff F12 Medium
FBS Fetal bovine serum (fötales Rinderserum) GBR Glutathion-Bicarbonat-Ringerlösung
HBSS Hanks’ balanced salt solution (Hanks’ physiologische Salzlösung) HE-β-CD Hydroxyethyl-beta-Cyclodextrin
HLB Hydrophilic-lipophilic balance HP-β-CD Hydroxypropyl-beta-Cyclodextrin
HPLC High performance liquid chromatography
IL Interleukin
IOP Intraocular pressure (Intraokularer Druck) ITS+ Premix Insulin-transferrin-selenium-Premix KCEZ Kaninchencornea-Epithelzellkultur
KK Kaninchenkonjunktiva
ΚΚΕΖ Kaninchenkonjunktiva-Epithelzellkultur KStab Apparente Stabilitätskonstante
LM Lösungsmittel
M-β-CD Methyl-beta-Cyclodextrin
MMF Mycophenolatmofetil
MPA Mycophenolsäure
n Anzahl der Stichproben
NP Nephrophan®
NSAID Non-steroid antiinflammatory drug (nichtsteroidales Antiphlogistikum) OECD Organization for economic cooperation and development (Organisation
für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung)
OS Oberflächenspannung
P-Base Pilocarpin-Base
PD Transepitheliale elektrical potential difference (transepitheliale elektrische Potentialdifferenz)
Peff Effektiver Permeabilitätskoeffizient
PG Propylenglykol
P-HCl Pilocarpinhydrochlorid Ph. Eur. Europäisches Arzneibuch
pKa Aziditätskonstante (negativer dekadischer Logarithmus) PRK Photorefraktive Keratektomie
Qt Freigesetzte Arzneistoffmenge [µg] zur Zeit t [min]
REM Raster-Elektronenmikroskopie RI Refractive index (Brechungsindex)
SC Schweinecornea
SC 25% Schweinecornea mit 75% Epithel SC 50% Schweinecornea mit 50% Epithel SC 75% Schweinecornea mit 25% Epithel SCo.E Schweinecornea ohne Epithel
SCo.E, o.B Schweinecornea ohne Epithel und ohne Bowman-Membran
SD Standardabweichung
SF 68 Synperonic® F 68
S-MEM Minimum essential medium with Earl’s salts
SS Schweinesklera
TEER Transepithelial electrical resistance (transepithelialer elektrischer Widerstand)
USP The United States Pharmacopeia VK Octanol-Verteilungskoeffizient
1 EINLEITUNG
Augenerkrankungen werden überwiegend durch topische Applikation entsprechender Dar- reichungsformen, für die es eine Vielzahl von Formulierungsvarianten gibt, therapiert. Die Anforderungen an Ophthalmika, sowohl vom Anwender als auch Gesetzgeber, sind vielfältig.
Der Patient erwartet neben hoher Wirksamkeit, guter Verträglichkeit und Unschädlichkeit eine möglichst geringe Beeinträchtigung des Sehvermögens. Der Arzt setzt weiter eine gute Haftfähigkeit und rasche Verteilung am Auge voraus und der Apotheker hat darüber hinaus eine angemessene Haltbarkeit zu sichern.
Die Penetration eines Pharmakons in und die anschließende Permeation durch die okularen Gewebe sind nicht nur von den physikalisch-chemischen Eigenschaften des Wirkstoffs und dem individuellen Zustand des Auges abhängig, sondern in hohem Maße auch von der Arzneiform und den verwendeten Hilfsstoffen. So bieten Augensalben oder auch ölige Lösungen bzw. Suspensionen gegenüber wässrigen Augentropfen den Vorteil, dass sie eine wesentlich längere Verweildauer im präcornealen Bereich zeigen und damit über längere Zeit Wirkstoff in das Auge abgeben [1,2,3,4,5]. Allerdings wirkt sich ihr relativ hoher Brechungs- index nachteilig aus, so dass es zum Verschwommensehen kommen kann.
Eingesetzte Hilfsstoffe, wie z.B. quartäre Ammoniumverbindungen, die als Konservierungs- mittel dienen, können das Hornhautepithel schädigen [6] und dessen Permeabilität verändern [7]. Andere Vehikel nehmen direkt Einfluss auf die okulare Verfügbarkeit oder die physio- logischen Parameter des Auges.
Die Wirkstoffe topischer Arzneiformen zur Anwendung am Auge sollen nach ihrer Frei- setzung entweder direkt an der Konjunktiva angreifen oder durch die Cornea bzw. Konjunk- tiva permeieren, um dann in der vorderen oder hinteren Augenkammer und an den Rezeptoren des mittleren und hinteren Auges ihre Wirkung zu entfalten. D.h., dass Kenntnisse sowohl der cornealen als auch der konjunktivalen Transportwege von Interesse für die Bioverfügbarkeit sind. So ist z.B. die corneale Permeation hydrophiler Substanzen, auch organischer Ionen, im Vergleich zu lipophilen Verbindungen erheblich eingeschränkt. Für ihr Eindringen sind Poren verantwortlich [8,9,10,11]. Außerdem ist die Permeation eines Arzneistoffs vom jeweiligen Lipid-Wasser-Verteilungskoeffizienten (VK) [1,12,13,14], sowie von seinem Dissoziations- grad [8,9] und von der Partikelgröße [15] abhängig.
EINLEITUNG
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6 Weiterhin sind für die Bioverfügbarkeit neben individuellen Faktoren der Gesundheitszustand des Auges bzw. der Cornea von Bedeutung. Die Durchlässigkeit der Cornea nimmt deutlich bei Entzündung [1,13,16] oder nach Entfernung des Epithels, z.B. nach erfolgter Photorefrak- tiver Keratektomie (PRK), die in dieser Arbeit eine bedeutende Rolle spielt, zu.
In vitro-Permeationsstudien an isolierten Augengeweben verschiedener Provenienz bzw. an Zellkulturen, wie sie im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurden, vermitteln Vorstellungen über den Arzneistofftransport in vivo, auch wenn Aspekte, wie Wirkstoffverlust durch Ablei- tung über die Tränenkanäle, Bindung an Eiweiße der Tränenflüssigkeit und die Verdünnung der Zubereitung durch die Tränenflüssigkeit, unberücksichtigt bleiben. Weiterhin gestatten diese in vitro-Methoden, den Einfluss verschiedener Parameter auf die Permeation der Wirk- stoffe zu untersuchen, so dass es möglich wird, optimierte Formulierungen zu konzipieren.
Damit lassen sich u.a. Überdosierungen, verbunden mit unnötiger Belastung des Patienten und vermehrten Nebenwirkungen, oder Unterdosierungen, gefolgt von verzögertem bzw. fehl- endem Therapieerfolg, weitgehend ausschließen.
2 PROBLEMSTELLUNG
Die vorliegende Dissertation befasst sich vorrangig mit der Permeation des hydrophilen Wirk- stoffs Pilocarpin-HCl (P-HCl) durch isolierte, unbehandelte und gelaserte Schweinecornea (SC) sowie durch unbehandelte Schweinesklera (SS), Kaninchenkonjunktiva (KK) und cor- neale (KCEZ) bzw. konjunktivale Kaninchenepithelzellkultur (KKEZ). Weiterhin wurde die synthetische Membran Nephrophan® (NP) eingesetzt. Es sollten die Durchlässigkeit dieser Permeationsbarrieren für den Modellarzneistoff, die Korrelierbarkeit von isolierten Geweben mit Zellkulturen und der Einfluss verschiedener Formulierungsparameter (BAC, EDTA, pH, Tonizität) auf die Diffusion von P-HCl studiert werden, um einen Beitrag zum Verständnis der okularen Permeation hydrophiler Stoffe zu leisten.
Weiterhin wurden vergleichende Permeationsstudien an isolierter, unbehandelter und gelaser- ter SC sowie unbehandelter SS mit dem relativ lipophilen Wirkstoff Diclofenac-Na (D-Na), der u.a. zur Nachbehandlung der PRK eingesetzt wird [17,18,19,20,21], durchgeführt. Trotz häufiger Anwendung dieser laserchirurgischen Methode zur Beseitigung von Fehlsichtigkei- ten ist wenig über die Permeation von Arzneistoffen durch gelaserte Hornhäute bekannt. Das Entfernen von Epithelschichten der SC mittels Excimer-Laser sollte den Heilungsverlauf, vor allem die zeitabhängige Reepithelisierung der Cornea nach erfolgter PRK, simulieren. Die Untersuchung des Wirkstofftransports durch abladierte Hornhäute mit unterschiedlicher Epi- theldicke hatte zum Ziel, Aussagen über die Barrierefunktion der Hornhautepithelschichten gegenüber hydrophilen und lipophilen Stoffen zu erbringen.
Ein weiteres Anliegen der Arbeit bestand darin, eine okular applizierbare Formulierung des Immunsuppressivums Mycophenolatmofetil (MMF), das bislang lediglich nach Nieren- und Herztransplantationen (CellCept®) eingesetzt [22,23,24,25] bzw. systemisch verabreicht bei Augenleiden getestet wurde [26,27,28], zu entwickeln und die in vitro-Verfügbarkeit des Arzneistoffs zu bestimmen. Sowohl für das Prodrug MMF als auch für dessen aktiven Meta- boliten Mycophenolsäure (MPA) wurde die Permeabilität von SC getestet, um eine Eignung beider Arzneistoffe zur topischen Applikation am Auge zu überprüfen.
THEORETISCHE GRUNDLAGEN
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3 THEORETISCHE GRUNDLAGEN
3.1 Anatomie, Physiologie und Funktionalität des Auges
Das Auge wird oft mit einem Photoapparat verglichen. Angemessener wäre es jedoch, es mit einer Fernsehkamera mit automatischer Nachführung zu vergleichen, also mit einem Gerät, das sich von selbst scharf stellt, sich automatisch an die Lichtstärke anpasst, ein selbstrei- nigendes Objektiv besitzt und einen Computer speist, der hochentwickelte Parallelverar- beitungsmöglichkeiten aufweist.
Tränendrüsen
Meibomsche Drüsen
Cornea
Linse Iris Vorderkammer
Zonulafasern Ziliarkörper
Bindehaut
Glaskörper Bulbusachse
Retina Aderhaut
Lederhaut Sehnerv
Hauptsehlinie
Abb. 1: Aufbau des Augapfels und seiner Anhangsgebilde [29]
Das Auge besteht aus dem Augapfel mit dem Sehnerv, und es liegt geschützt, umgeben von Fettgewebe, in der knöchernen Augenhöhle. Außerdem gehören die sechs äußeren Augen- muskeln, die Augenlider, die Bindehaut, die Tränendrüse und die ableitenden Tränenwege zum Sehorgan (Abb. 1).
Der Augapfel hat annähernd die Form einer Kugel, die Hornhaut besitzt einen geringeren Krümmungsradius und überragt daher den Bulbus. Letzterer besteht aus der äußeren, der mittleren und inneren Augenhaut. Die äußere Augenhaut setzt sich aus der derben, undurch- sichtigen Sklera (Lederhaut) und der durchsichtigen Cornea (Hornhaut) zusammen. Die Ge-
fäßschicht des Auges, die mittlere Augenhaut, weist drei hintereinandergelagerte, verschieden ausgebildete Abschnitte auf, die Aderhaut (Chorioidea), den Ziliarkörper (Corpus ciliare) und die Iris (Regenbogenhaut). Die innere Augenhaut besteht nur aus der Retina (Netzhaut). Im Inneren des Augapfels befinden sich die Linse, die vordere und hintere Augenkammer, die das Kammerwasser enthalten, und der Glaskörper.
Die gemeinsame Aufgabe der nichtretinalen Teile des Auges besteht darin, auf den beiden Netzhäuten ein scharfes, klares Bild der Außenwelt festzuhalten. Jedes Auge wird durch die sechs kleinen, äußeren Augenmuskeln innerhalb seiner Höhle in die richtige Lage gebracht, denn beide Augen müssen einem Objekt mit einer Genauigkeit von wenigen Bogenminuten nachgeführt werden, sonst würden wir doppelt sehen. Cornea und Linse bilden zusammen das Äquivalent eines Kameraobjektivs. Die zur Scharfeinstellung erforderliche Lichtbrechung erfolgt zu ungefähr zwei Dritteln an der Grenzfläche zwischen Luft und Cornea, wo das Licht ins Auge einfällt. Das restliche Drittel der Brechkraft liefert die Linse; ihre wichtigste Aufgabe besteht jedoch darin, die für das Fokussieren auf unterschiedlich weit entfernte Gegenstände notwendigen Einstellungen vorzunehmen. Unsere Augen werden fokussiert, indem die Gestalt der gelatineartigen Linse verändert wird, dazu werden die Sehnenfäden (Zonulafasern), die an ihrem Rand ansetzen, entweder ge- oder entspannt. Für nahe Objekte muss die Linse stärker kugelförmig, für weiter entfernte flacher sein. Für diese Verformungen sorgt der radial angelegte Ziliarmuskel. Der Reflex, der die Kontraktion des Ziliarmuskels auslöst, um die Linse abzurunden, ist von der visuellen Eingangsinformation abhängig und mit dem Reflex synchronisiert, der die gleichzeitige Einwärtsdrehung (Adduktion) der Augen steuert. Zwei Gruppen von Muskelfasern verändern den Durchmesser der Pupille und regu- lieren damit die Lichtmenge, die in das Auge einfällt. Eine Gruppe, deren radiale Fasern wie Radspeichen angeordnet sind, öffnet die Pupille (M. dilatator pupillae), die andere, in konzentrischen Kreisen angelegt, schließt sie (M. sphincter pupillae).
Mittels der beschriebenen komplizierten Struktur wird der Retina Zuarbeit geleistet. Diese wandelt Licht in Nervensignale um, erlaubt uns, bei Sternen- wie bei Sonnenlicht zu sehen, unterscheidet verschiedene Wellenlängen des Lichtes, so dass wir Farben wahrnehmen können, und arbeitet mit einer solchen Präzision, dass uns noch in einem Meter Entfernung ein menschliches Haar oder ein Stäubchen auffällt.
THEORETISCHE GRUNDLAGEN
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10
Die Selbstreinigung der den äußeren Einflüssen ausgesetzten Hornhautvorderseite wird durch den Lidschlag und die Sekrete aus den Tränendrüsen gewährleistet. Die Hornhaut ist reich mit Nerven für Berührungs- und Schmerzreize versorgt, so dass die geringste Reizung, z.B. durch Staubpartikel, einen Reflex auslöst, der zum Lidschlag und zur nachfolgenden Tränenaus- scheidung führt. Die Augenlider, die auf ihrer Innenseite mit Bindehautgewebe (Konjunktiva) ausgekleidet sind, bewirken außerdem einen fünf- bis zehnmal pro Minute auftretenden, unwillkürlich ausgelösten Lidschlag, der, unterstützt durch das Sekret der Tränendrüsen, den Tränenfilm gleichmäßig auf der Oberfläche der Cornea verteilt und somit deren Austrocknung und eine daraus resultierende Trübung verhindert. Die Bindehaut ist neben Mucus produ- zierenden Goblet-Zellen, die den eben genannten Vorgang unterstützen, zusätzlich mit einer Reihe immunkompetenter Zellen ausgestattet, die eine wichtige Rolle, z.B. bei der Infekt- abwehr, spielen [30].
Die Tränenflüssigkeit, ein komplex zusammengesetztes Gemisch, bedeckt die Oberfläche von Cornea und Konjunktiva und erfüllt dabei eine Vielzahl wichtiger Funktionen. Die Bildung des Tränenfilms erfolgt in den Tränendrüsen (Glandulae lacrimalis), den Goblet-Zellen und den akzessorischen Tränendrüsen der Konjunktiva. Der präcorneale Film hat eine Dicke von 5-10 µm [31]. Das Volumen der Tränenflüssigkeit beträgt normalerweise am Auge 7-10 µl [32]. Die durchschnittliche Umsatzrate liegt beim Menschen etwa bei 15% pro Minute (ca. 1 ml pro 24 h, wobei die Tränenproduktion nachts fast gänzlich eingestellt wird, tagsüber entsprechend höher ist). Die Tränenflüssigkeit wird demnach theoretisch etwa viertelstündlich erneuert [32]. Die dabei erfolgende Ableitung über die Tränenkanäle zum Tränennasenkanal wirkt sich nachteilig auf lokal applizierte Augenarzneimittel aus.
Die Tränenflüssigkeit des Menschen ist anders zusammengesetzt als sein Serum. Vor allem fällt auf, dass sie nur 10% der Proteinmenge des Serums enthält. Zusätzlich zu Albuminen und Globulinen findet sich Lysozym. Im wesentlichen besteht der präcorneale Film aus drei Schichten, der äußersten Monolayerschicht, bestehend aus Lipiden, Protein und Mucus, einer darunterliegenden wässrigen Schicht mit den darin gelösten Elektrolyten, bestimmten nieder- molekularen, organischen Substanzen bzw. Proteinen und einer direkt auf den Epithelzellen der Cornea befindlichen, oberflächenaktiven Mucinschicht [33]. Trotz des geringen Gehalts an Proteinen wird die Permeation vieler Arzneistoffe durch die Cornea infolge von Eiweiß- bindung behindert. Beispielsweise fanden Mikkelson et al. [34] eine Proteinbindung von Pilo- carpinnitrat, Sulfafurazol und Methylprednisolon.
Wichtig für Augenformulierungen ist die Berücksichtigung des osmotischen Drucks der Tränenflüssigkeit, der am gesunden Auge ~311-350 mOsmol/kg [35] beträgt und des pH- Werts der wässrigen Phase (Tränenflüssigkeit, Kammerwasser), der je nach Tageszeit, zwischen 7.14 und 7.82 schwankt [36].
Da sich die vorliegende Dissertation hauptsächlich mit der Permeation von Arzneistoffen durch Hornhaut, Lederhaut und Bindehaut befasst, sollen im Folgenden diese Gewebe näher charakterisiert werden.
3.1.1 Cornea
Abb. 2: Aufbau der Cornea [37]; Epi = Epithel, Endo = Endothel
Die humane Hornhaut besitzt keine Blutgefäße und ist völlig durchsichtig; sie nimmt ein Fünftel der Oberfläche des Bulbus ein. Ihre Begrenzung gegen die Sklera verläuft nicht genau kreisförmig, sondern queroval: sie ist in horizontaler Richtung etwas breiter (11.6 mm) als in vertikaler Richtung (11.2 mm) [38]. Die Cornea hat die Form eines Uhrschälchens und ist mit ihrem scharfen Rand in den Skleralfalz eingelassen. Je nach Lage differiert ihre Dicke zwischen 0.5 mm im Zentrum und 0.7 mm an den Rändern.
Die Diffusion durch die Cornea ist ein komplizierter Vorgang, zurückzuführen auf den sand- wichartigen Aufbau dieser Barriere (Abb. 2). Die äußere lipophile Schicht der Hornhaut bildet das Epithel, welches ca. 50 µm dick ist und aus einem unverhornten, geschichteten Platten- epithel mit fünf bis sechs Zellschichten besteht. Tight junctions in den Zonulae occludentes zwischen den flachen Deckzellen werden hauptsächlich für die Impermeabilität des Epithels
THEORETISCHE GRUNDLAGEN
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12
gegenüber Wasser und hydrophilen Substanzen verantwortlich gemacht. Die interzellulären Zwischenräume sind sehr eng, so dass für Substanzen mit einer relativen Molekülmasse >
1000 kaum eine Chance besteht, in das Epithel einzudringen. Bevorzugt lipophile Substanzen mit einem hohen VK können durch das Epithel diffundieren [1,12,13,14] (vgl. 4.2.1.1).
Die subepitheliale, sehr starke Basalmembran, Bowman-Membran, ist homogen und azellulär.
Sie trennt das Epithel vom Stroma. Die Substantia propria (Stroma) macht neun Zehntel der Dicke der Hornhaut aus und besteht aus kollagenen Fasern, die in Form sich überkreuzender Lamellen angeordnet sind. Die regelmäßige Anordnung der kollagenen Fasern, die in eine mucopolysaccharidreiche Kittsubstanz eingelagert sind, sowie das Fehlen von Blutgefäßen bedingen die Durchsichtigkeit des Gewebes. Das Stroma enthält marklose Nerven, von denen zahlreiche Fasern in das Epithel aufsteigen und dort enden. Dies erklärt die große Empfind- lichkeit der Hornhaut beim Eindringen oder Haften von Fremdkörpern. Ein Wassergehalt von 70% bewirkt den hydrophilen Charakter des Stromas als elastische und mikroporöse Schicht.
Eine rasche Diffusion durch diese Schicht setzt eine nicht zu geringe Wasserlöslichkeit des Wirkstoffs voraus. Daher penetrieren Wirkstoffe dann besonders gut durch die Cornea, wenn sie neben lipophilen (Epitheltransport) in gewissem Umfang auch hydrophile Eigenschaften besitzen (vgl. 4.2.1.1), z.B. Chloramphenicol im Gegensatz zum sehr hydrophilen Penicillin oder zu Fluoreszein-Na [4,12,39,40]. Dissoziierende Arzneistoffe sollten bei der Hydronium- ionen-Konzentration der Tränenflüssigkeit wenigstens zum Teil undissoziiert vorliegen.
Die Descemet-Membran stellt ebenfalls eine kräftige Basalmembran dar, die sich endothel- seitig zum Stroma befindet. Sie weist eine außerordentlich hohe Elastizität auf und bleibt selbst dann noch intakt, wenn die darüberliegenden Schichten zerstört sind. Das Endothel schließt die Cornea nach innen ab und besteht lediglich aus einer Schicht relativ weit auseinanderstehender, abgeflachter, epithelähnlicher Zellen, deren Hauptaufgabe darin be- steht, das Stroma zu dehydratisieren und damit die Dicke und Transparenz der Cornea sicher- zustellen. Außerdem spielt das Endothel eine wichtige Rolle bei aktiven Transportprozessen (vgl. 4.1.4.1) und ist als gut durchlässige Membran wesentlich für den Stoffaustausch mit anderen Geweben verantwortlich. Das Endothel weist, genau wie das Epithel, lipophile Ei- genschaften auf, d.h. es ist leichter für lipophile Stoffe passierbar, jedoch ist die Barriere- funktion des Epithels als wesentlich stärker einzuschätzen.
Die Hornhaut wird durch Diffusion von Substanzen aus dem Kammerwasser, der Tränen- flüssigkeit und den arteriellen Gefäßen am Hornhautrand (Sklera) ernährt.
3.1.2 Sklera
Die weiße Sklera ist eine dicke, vorwiegend aus kollagenen Fasern aufgebaute, dehnungsfeste Bindegewebskapsel (Abb. 3), die, unterstützt durch den Augeninnendruck, die Form des Bulbus aufrechterhält. In ihrem vorderen Abschnitt ist sie von der Bindehaut überzogen. Ihre Ausdehnung macht vier Fünftel der Bulbusfläche aus, und der Krümmungsradius beträgt 12.7 mm. Nach innen grenzt die Sklera an die Aderhaut und vorn überdeckt sie den zugeschärften Rand der Cornea besonders von oben und unten, etwas weniger an den Seiten, nach Art der Befestigung des Uhrglases bei der Taschenuhr (Abb. 3).
Abb. 3: Seitenansicht eines Menschenauges [41]
Die Lederhaut ist nicht überall gleich stark, an der rückwärtigen Bulbushälfte beträgt ihre Dicke etwa 1 mm, in der Gegend vor und hinter dem Äquator verdünnt sie sich auf 0.3 mm und verdickt sich an den Ansätzen der Augenmuskeln wieder auf 0.6 mm [42].
Als viskoelastisches Gewebe zeigt die Sklera eine biphasische Reaktion auf eine plötzliche Verformung: eine schnelle, kurze Verlängerung (elastische Komponente), gefolgt von einem langsamen Zusammenziehen der Kollagenfasern [42,43].
Die Sklera besteht hauptsächlich aus drei Schichten: der Episklera, dem Stroma und der lamina fusca [44]. Cornea und Sklera sind hauptsächlich kollagene Gewebe, wobei die Trans- parenz der Hornhaut und die Opakizität der Sklera aus Unterschieden in der Größe und
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Orientierung der Kollagenfasern, im Wassergehalt und der Mucopolysaccharidfraktion resul- tieren [45]. Im Gegensatz zu den cornealen Kollagenfasern variieren die skleralen in der Breite: die äußeren sind dicker als die inneren [46,47,48,49]. Die Kollagenfibrillen der Sklera haben einen Durchmesser von 2.5-230 nm [44]. Die Faserbündel liegen nicht parallel über- und nebeneinander geordnet vor, sondern unregelmäßig geflochten (Abb. 4).
Abb. 4: Sklerafaserbündel [50]
Kollagen, mit einem großen Anteil an Hydroxyprolin, bildet 75% des Trockengewichts der Sklera; der Rest besteht aus nicht-kollagenen Proteinen und Mucopolysacchariden [48].
Elastisches Gewebe, bestimmt durch den Gehalt an Desmosin und Isodesmosin, zwei Amino- säuren, die nur im Elastin vorkommen, bildet weniger als 2% des Trockengewichts [51]. Laut Dische [48] beträgt der Wassergehalt der Sklera 68%.
Die Arzneistoffpermeation durch die Sklera verläuft ähnlich wie durch das corneale Stroma, da sich die Grundstrukturen sehr ähneln, d.h. hydrophilere Stoffe gelangen grundsätzlich leichter in die inneren Augenabschnitte als lipophile Stoffe der gleichen Molekülmasse (vgl.
4.2.1.2).
3.1.3 Konjunktiva
Am Rande der hinteren Lidkante geht das mehrschichtige, verhornte Plattenepithel der Epidermis in das Epithel der Bindehaut über. Die Bindehaut überzieht als eine mit Gefäßen durchzogene Schleimhaut die Innenfläche der Lider (Conjunctiva palpebrarum), setzt sich dann im Fornix (Übergangsfalte zwischen Bindehaut des Augapfels und der Lider) auf der Vorderfläche der Sklera fort, um mit dieser am Cornearand zu enden (Conjunctiva bulbi)
(Abb. 1) [52,53]. Die Oberfläche der Konjunktiva ist ca. neunmal (Kaninchen) und 17mal (Mensch) größer als die Oberfläche der Cornea [54].
Beide Abschnitte umschließen den Konjunktivalsack, der normalerweise ein kapillarer Spalt ist, jedoch durch Abziehen der Lider, etwa beim Einbringen von Tropfen, erweitert werden kann (Abb. 5). Das konjunktivale Epithel, das einem Bindegewebe aufsitzt, ist am Skelett der Lider (Bindegewebsplatte) mehrschichtig und hochprismatisch. Am Bulbus gestaltet es sich als ein mehrschichtiges Plattenepithel ohne Verhornung, welches sehr dünn und durchschei- nend ist, so dass zuweilen die darunterliegende Sklera durchschimmert. Normalerweise sitzt das Epithel sehr locker und kann leicht bewegt werden.
Abb. 5: Bindehautbereiche im menschlichen Auge [55]
Für alle Konjunktivazellen ist charakteristisch, dass sie einen Zellkern und viele zytoplasma- tische Organellen besitzen. Die Oberflächenzellen zeigen teilweise Mikrovilli, enthalten zahl- reiche Schleimkörnchen und haben breite Zwischenräume zwischen den Zellen. Außerdem weist die Konjunktiva Goblet-Zellen auf, die an der Mucusproduktion beteiligt sind, genau wie die Becherzellen, die vor allem im Fornix zu finden sind. Der Schleim ist essentiell für die Tränenfilmstabilität und die corneale Transparenz [56].
Die Konjunktiva hat außerdem ein enormes Potential bei der Bekämpfung von Infektionen, da sie erstens stark vaskularisiert ist, zweitens verschiedene Zelltypen aufweist, die die Abwehr einer Entzündung initiieren und durchführen können, drittens viele immunkompetente Zellen vorhanden sind, die die Immunglobuline unterstützen und viertens durch die Oberflächen- gestaltung (Mikrovilli) und Biochemie (enzymatische Aktivität) der konjunktivalen Zellen das Gewebe befähigt wird, Fremdkörper, wie z.B. Viren, zu neutralisieren [57,58].
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Hinsichtlich der Permeabilität für Arzneistoffe verhält sich die Konjunktiva ähnlich wie die Cornea aufgrund der Lipophilie des Gewebes (vgl. 4.2.1.3).
In der vorliegenden Arbeit wurden Gewebe von Schweine- und Kaninchenaugen als Modelle verwendet. Die Anatomie und Physiologie dieser Tiermodelle, insbesondere von Schweine- augen [59], sind mit Humanaugen, bis auf wenige Details, vergleichbar. Im Fall von Kanin- chenaugen sei auf die Größenunterschiede der Gewebe und das Fehlen der Bowman- Membran in der Cornea im Vergleich zu Humanaugen hingewiesen. Weitere Unterschiede sind in den jeweiligen Kapiteln herausgearbeitet (vgl. 4.2).
3.2 Arznei- und Hilfsstoffe
3.2.1 ArzneistoffeAls hydrophiler, gut wasserlöslicher Modellarzneistoff kam das Antiglaukomatosum Pilo- carpin sowohl als Hydrochlorid als auch als Base zum Einsatz. Diclofenac-Natrium wurde als Vertreter der NSAID hauptsächlich im Rahmen des Excimer-Laser-Projektes untersucht. Das lipophile, kaum wasserlösliche Immunsuppressivum Mycophenolatmofetil und sein aktiver Metabolit Mycophenolsäure wurden zu einer wässrigen Augenzubereitung formuliert und getestet.
3.2.1.1 Pilocarpin
Eur. Ph. NT 2001/
USPXXVI: Es existieren zwei Monographien von Salzen der Pilocarpin- base: Pilocarpinhydrochlorid ist (3S,4R)-3-Ethyl-4-[(1-methyl- 1H-imidazol-5-yl)methyl] dihydro-furan-2(3H)-on-hydrochlorid (C11H17ClN2O2) (Mrel 244.7).
Pilocarpinnitrat) ist (3S,4R)-3-Ethyl-4-[(1-methyl-1H-imidazol- 5-yl)methyl]dihydrofuran-2(3H)-on-nitrat (C11H17N3O5) (Mrel
271.3).
O
N O N
3.2.1.1.1 Eigenschaften
Pilocarpin ist das Hauptalkaloid aus den Blättern der südamerikanischen Sträucher Pilocarpus jaborandi, Pilocarpus microphyllus und anderer Rutaceae-Arten. Die Blattdroge enthält bis zu 2% Pilocarpin [60].
Die freie Base ist bei Zimmertemperatur eine gelbliche, klare, hochviskose Flüssigkeit, die in Wasser eine relativ gute Löslichkeit zeigt. Bei der Salzbildung wird der doppelt gebundene Imidazol-Stickstoff protoniert (pKa1=6.85), weil dadurch ein mesomeriestabilisiertes Ami- dinium-Kation entsteht. Das zweite Stickstoffatom bildet nur in sehr saurem Milieu Salze (pKa2=1.43). Das in dieser Arbeit verwendete P-HCl ist ein in Wasser leicht lösliches (1:0.3), weißes, leicht hygroskopisches, kristallines Pulver.
O O
N N
N N
O OH
H O
O O
N N
N N
O OH
H O
Epimerisierung
Hydrolyse
Hydrolyse
Pilocarpin Pilocarpinsäure
Isopilocarpin Isopilocarpinsäure Abb. 6: Zersetzung von Pilocarpin [61]
In wässriger Lösung ist der pH-Wert für die Wirksamkeit von ausschlaggebender Bedeutung.
Je mehr sich der pH-Wert der Lösung dem neutralen Bereich nähert, umso größer ist bei gleicher Konzentration die ophthalmologische Wirkung, da die lipophile Alkaloidbase ein wesentlich besseres Permeationsvermögen durch die Hornhaut als das dissoziierte Alkaloid- salz aufweist [62,63]. Mit steigendem pH-Wert, besonders bei erhöhter Temperatur, ver- schlechtert sich dagegen die Stabilität. Bei der Formulierung muss versucht werden, diese beiden Faktoren, Stabilität und Wirksamkeit, in einen vernünftigen Kompromiss zu bringen.
In wässriger Lösung stehen zwei chemische Reaktionsprozesse im Vordergrund (Abb. 6): die hydrolytische Spaltung des γ-Lactonrings mit Bildung der Pilocarpinsäure [64] und anderer-
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seits die Epimerisierung am C-3 zu Isopilocarpin mit nachfolgender Hydrolyse zur Isopilo- carpinsäure. Beide Umsetzungsprodukte sind unwirksam [62].
Das Isopilocarpin, das in wässriger Lösung von Pilocarpin auftritt, kann sich auch durch Cyclisierung der bei der Hydrolyse entstehenden Isopilocarpinsäure bilden. Hydrolytische Zersetzungsprozesse spielen für die Stabilität von Augentropfenlösungen die dominante Rolle. Pilocarpin ist in saurer, wässriger Lösung relativ stabil, der pH-Wert für die maximale Stabilität wird zwischen 4 und 5 [65] bzw. 5-5.5 [61] angegeben.
Ein weiterer Aspekt, der berücksichtigt werden muss, ist die Metabolisierung des Arzneistoffs in den Augengeweben. Sendelbeck et al. [66] zeigten, dass, nach Applikation des Arzneistoffs in den Konjunktivalsack von Albinokaninchen, Isopilocarpin ca. 10% der Metabolite aus- macht und die restlichen 90% als Pilocarpinsäure detektiert werden.
Tabelle 1: Pilocarpinsäure [%] in Cornea, Kammerwasser und Iris/Ziliarkörper nach topischer Applikation einer 0.01 M Pilocarpinlösung [67]
Zeit [min]
Gewebe 10 30 60 120
Cornea 34.5 (5.9) 50.5 (6.0) 87.2 (3.8) 98.6 (0.4)
Kammerwasser 47.4 (0.2) 52.7 (15.0) 75.9 (4.5) 81.7 (4.5) Iris/Ziliarkörper 44.3 (10.0) 32.7 (5.9) 81.7 (6.0) 78.9 (5.4) SD in Klammern
Der sehr hohe Gehalt an Pilocarpinsäure in der Cornea nach 2 h (Tabelle 1) [67] lässt ver- muten, dass die Metabolisierung hauptsächlich in diesem Gewebe stattfindet. Der Pilocar- pinsäuregehalt im Kammerwasser bzw. in Iris/Ziliarkörper wird wahrscheinlich durch die vorangegangene Corneapassage von Pilocarpin hervorgerufen. Anderson et al. [68] fanden eine Esteraseaktivität in der Cornea von Albinokaninchen bei der Umwandlung des Prodrugs Dipivalylepinephrin zu Epinephrin, die eine Metabolisierungsraten-Konstante von 0.17 min-1 aufwies. Die Metabolisierung kann durch unspezifische als auch für den jeweiligen Arznei- stoff spezifische Enzyme erfolgen, wobei Pilocarpin hauptsächlich durch unspezifische Esterasen metabolisiert wird. Sind die Esterasen membrangebunden, wird die Zugänglichkeit durch den Mechanismus der Arzneistoffpermeation kontrolliert.
3.2.1.1.2 Pharmakologie
Pilocarpin wird zur Therapie des pathologisch gesteigerten intraokularen Drucks (IOP) (über 26 mm Hg), dem Glaukom, eingesetzt. Der IOP hängt vor allem von der Menge des kontinu- ierlich gebildeten und abfließenden Kammerwassers ab, das vom Epithel des Ziliarkörpers durch aktive und passive Transportprozesse abgesondert wird. Von der hinteren Augen- kammer fließt das Kammerwasser durch die Pupillenöffnung in die vordere Augenkammer.
Von hier aus gelangt es über den Kammerwinkel in den Schlemm’schen Kanal und fließt dann in kleine Venen ab.
Ein Abfluss über den Schlemm’schen Kanal ist vor allem dann gewährleistet, wenn die Pupille verengt ist und damit den Kammerwinkel nicht einengt. Die treibende Kraft für den Kammerwasserstrom ist ein hydrostatisches Druckgefälle. Der IOP, der beim gesunden Auge 10-22 mm Hg beträgt, ist konstant, wenn die Menge des durch den Schlemm’schen Kanal abgeleiteten Kammerwassers der pro Zeiteinheit gebildeten Kammerwassermenge (etwa 2 µl/min) entspricht [69].
Die Ursache eines Glaukoms ist fast immer eine Abflussbehinderung des Kammerwassers.
Ein primäres Glaukom liegt vor, wenn die Drucksteigerung als erstes und zunächst einziges Zeichen einer Augenerkrankung auftritt. Ist die Erhöhung des IOP dagegen eine Folge einer bestehenden oder vorausgegangenen Augenerkrankung, spricht man vom sekundären Glau- kom.
Je nach Weite des Kammerwinkels wird das primäre Glaukom nochmals in das Engwinkel- und Weitwinkelglaukom unterteilt. Während bei Ersterem eine Druckerhöhung infolge eines engen, d.h. teilweise verschlossenen Kammerwinkels resultiert, liegt beim Weitwinkel- glaukom eine strukturelle Veränderung des Trabekelmaschenwerkes vor. Weiterhin kommen ein erhöhter Widerstand sowie eine Drucksteigerung im Schlemm’schen Kanal in Betracht.
Die Erkrankung verläuft zunächst symptomlos, führt jedoch langfristig zu einer Druckschä- digung des Sehnervs, die bis zur vollständigen Erblindung führen kann.
Als m-cholinozeptor-Agonist wirkt Pilocarpin als direktes Parasympathomimetikum. Es ist eine entfernte Verwandtschaft mit dem Acetylcholin, dem physiologischen Gegenspieler des Noradrenalins, aufgrund einer Estergruppierung im Butyrolactonring und eines in geeignetem
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Abstand methylierten Stickstoffatoms N-1 im Imidazolring zu erkennen. Durch das Andocken von Pilocarpin an den Muscarinrezeptor der Effektorzelle kommt es zu einer Dauerkontrak- tion des Musculus sphincter pupillae (Miosis) und des Ziliarmuskels (Myopie), wobei die Miosis den Abfluss des Kammerwassers vor allem beim Engwinkelglaukom erleichtert und die Myopie eine unerwünschte Nebenwirkung darstellt. Außerdem werden allergische Reak- tionen beschrieben. Möglicherweise kommt für die Senkung des IOP auch eine Hemmung der Kammerwasserproduktion in Betracht.
Abb. 7: A: weiter Kammerwinkel; B: enger Kammerwinkel; 1=Ziliarkörper, 2=Iris, 3=Trabekelmaschenwerk, 4=Schlemm’scher Kanal, 5=Vene, 6=Hornhaut [69]
Pilocarpin spielt heute in der Glaukombehandlung eher eine untergeordnete Rolle, da neue Wirkstoffgruppen, wie z.B. β-Rezeptorenblocker, Carboanhydrasehemmer und Prostaglandin- Analoge empfohlen werden [70,71,72]. Trotzdem wurde P-HCl in der vorliegenden Arbeit als Modellarzneistoff gewählt, da er einfach zu handhaben ist und verschiedene okulare Gewebe passieren kann [73,74,75,76].
3.2.1.2 Diclofenac-Natrium
CH2 COONa
NH Cl Cl
Eur. Ph. NT 2001: In Eur. Ph. ist lediglich Diclofenac-K aufgeführt, welches identisch ist mit [2-[(2,6-Dichlorphenyl) amino] phenyl]
essigsäure, Kaliumsalz der Summenformel C14H10Cl2 KNO2
(Mrel 334.2).
USP XXVI: Diclofenac-Na[2-[(2,6-Dichlorphenyl)amino]phenyl]essigsäure, Natriumsalz der Summenformel C14H10Cl2 NaNO2 (Mrel 318.13) ist in der USP aufgelistet.
3.2.1.2.1 Eigenschaften
D-Na ist ein synthetisches, weißes bis schwach gelbliches, geruchloses, kristallines Pulver mit schwach hygroskopischen Eigenschaften. Es ist nur wenig löslich in Wasser, dafür aber löslich in Methanol und Ethanol. Der pH-Wert einer 1%igen Lösung in Wasser liegt zwischen 7.0 und 8.5 (pKa= 4).
Eine gepufferte Zubereitung mit einem pH zwischen 6.5 und 7.0 ist geeignet für die Lösung, Stabilisierung und okulare Applikation von D-Na in Form von Augentropfen. Bei diesem pH- Wert liegt eine relativ hohe Menge freie Säure vor, die unter diesen Bedingungen schwer von der Tränenflüssigkeit mit einer geringen Pufferkapazität deprotoniert werden kann [77].
3.2.1.2.2 Pharmakologie
D-Na, ein Arylessigsäurederivat, ist ein nichtsteroidaler, antiinflammatorischer Arzneistoff (NSAID) mit entzündungshemmenden, analgetischen und antipyretischen Eigenschaften [78].
Seine pharmakologischen Effekte werden, ebenso wie die anderer NSAID, auf die Hemmung der Prostaglandinsynthese zurückgeführt. Jedoch scheint D-Na insofern eine besondere Rolle innerhalb dieser Gruppe zu spielen, da es drei mögliche Angriffspunkte auf die Arachidon- säurekaskade besitzt, die für die pharmakologische Wirkung relevant sein können [78,79]. D- Na hemmt erstens den Cyclooxygenaseweg und reduziert dadurch die Bildung von Prosta- glandinen und Thromboxan [80], zweitens beobachtet man nach Gabe von D-Na eine Ver- minderung der Leukotrienproduktion, was auf eine Inhibition des Lipoxygenaseweges schließen lässt [80,81], und drittens ist der freie Arachidonsäurespiegel durch die Hemmung der Freisetzung und Stimulierung des Reuptake reduziert [80,81]. Inwieweit diese Effekte jedoch zur therapeutischen Wirkung beitragen, ist unbekannt.
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Die therapeutisch genutzten, aber teilweise auch die Nebenwirkungen des D-Na werden, ebenso wie die anderer nichtsteroidaler Antirheumatika, im Wesentlichen durch die Hem- mung der mikrosomalen, membrangebundenen Cyclooxygenase erklärt [82] (Abb. 8). Dieses Enzym katalysiert die Biosynthese von Prostaglandinen und anderen Eicosanoiden aus ihrer gemeinsamen Vorstufe Arachidonsäure (Abb. 8). Eicosanoide sind Gewebehormone, die in allen Körperzellen bei Bedarf synthetisiert und freigesetzt werden können und zahlreiche biologische Mediatorfunktionen erfüllen. Sie spielen als Vermittler der Entzündungsreaktion eine wesentliche Rolle.
Phospholipase A2
Lipoxygenase
Cyclooxygenase
Abb. 8: Hemmung der Prostaglandinsynthese durch Pharmaka [83]
Membranlipide
Glukokortikoide
ungesättigte
Fettsäuren Leukotriene
Cyclische Endoperoxide Nicht-opioide
Analgetika
Prostacyclin Prostaglandine Prostaglandin F2α Thromboxan
Hemmender Effekt
D-Na-Augentropfen (Voltaren Ophtha) werden zur Behandlung von Keratitis, Konjunktivitis und Uveitis angewendet [84,85,86]. Die prostaglandinsynthesehemmende Wirkung D-Na- haltiger Augentropfen wurde durch die Senkung konjunktivaler, perikeratischer und iridaler Hyperämien, die Prävention von Blut-Kammerwasser-Barrieredurchbrüchen [87,88] und die Hemmung von zellulärer Infiltration in die Zielgewebe nachgewiesen. Da D-Na inflam- matorischer Miosis vorbeugt, wird es außerdem zur Nachbehandlung okularer chirurgischer Eingriffe angewendet [89,90]. Eine topische Behandlung mit D-Na ist ohne Nebenwirkungen, wie sie von Kortikosteroiden hervorgerufen werden, wie z.B. eine Erhöhung des IOP, Linsen- trübung oder verzögerte Wundheilung, so dass D-Na eine gute Alternative darstellt.
3.2.1.3 Mycophenolatmofetil
Eur. Ph. NT 2001/
USPXXVI: Es existiert keine Monographie von Mycophenolatmofetil bzw.
Mycophenolsäure.
Martindale: Im Martindale ist Mycophenolatmofetil (MMF) aufgeführt, welches identisch ist mit 2-(4-Morpholin)ethyl-(E)-6-(1,3- dihydro-4-hydroxy-6-methoxy-7-methyl-3-oxo-5-isobenzo- furanyl)-4-methyl-hexanoat der Summenformel C23H31NO7 (Mrel
433.5).
Hagers Handbuch: Hagers Handbuch führt Mycophenolsäure (MPA), 6-(4-
Hydroxy-6-methoxy-7-methyl-3-oxo-1,3-dihydro-isobenzofuran- 5-yl)-4-methyl-hex-4-ensäure als aktiven Metaboliten des MMF der Summenformel C17H20O6 (Mrel 320.3) auf.
3.2.1.3.1 Eigenschaften
MMF (Handelspräparat CellCept) ist der Morpholino-Ethyl-Ester der MPA, eines Gärungs- produktes verschiedener Pilzarten der Gattung Penicillium. MPA wurde zunächst als Anti- biotikum und antitumorales Medikament geprüft, anschließend wurden klinische Studien für
O N O
O
O O
CH3
CH3 OH
OCH3
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die Behandlung der Psoriasis durchgeführt. Die Entwicklung des Medikaments für diese Indi- kation wurde jedoch nicht abgeschlossen. Erst später erwachte auf der Suche nach einer Substanz mit selektiver antiproliferativer Wirkung auf Lymphozyten das Interesse an MPA wieder.
Abb. 9: Abbauprodukte von MMF [91]; 1=MPA, 2=MMF, 3=N-Oxid des MMF, 4=2- Morpholino-ethanol, 5=MPA-Lactonanalogon, 6=MPA-Hydroxylactonanalogon, 7- 9=unbenannt
Es konnte gezeigt werden, dass eine Veresterung von MPA zum Morpholino-Ethyl-Ester MMF die Bioverfügbarkeit nach oraler Administration bei nicht-menschlichen Primaten durch verstärkte Absorption steigert [92]. Das Prodrug MMF ist ein weißes oder weißlich kristallines Pulver mit einer Wasserlöslichkeit von 43 µg/ml bei pH 7.4; die Löslichkeit nimmt bei pH 3.6 auf 4.27 mg/ml zu. Der VK (log P; Octanol/Wasser; pH 7.0) beträgt 0.47.
MMF ist bei 25° C und atmosphärischem Druck stabil. Durch Wärme und Peroxide wird der Abbau von MMF zum Hauptspaltungsprodukt MPA katalysiert [91] (Abb.9).
O N
N O
O O
O
OH
O
OR
CH3
R =
R =
O + R = H
1
2
3
O N
O O O
O OH
OH
O R1
H
CH3
R1 = H R1 = OH
4
5 6
O
O
O COOH
OH
OCH3
7
O
O O
O O
OCH3
8
O O
O
OH
O H
CH3
9
3.2.1.3.2 Pharmakologie
MMF ist seit 10 Jahren das erste Medikament, das in den USA zur Prophylaxe gegen Ab- stoßungsreaktionen nach Nierentransplantation zugelassen wurde [93]. Die Substanz ist ein reversibler Inhibitor der Inosin-Monophosphat-Dehydrogenase (hohe Affinität zur Isoform II), eines Enzyms, das die Purinsynthese an zentraler Stelle kontrolliert [94]. MPA hemmt reversibel die De-novo-Bildung von Guanosin-Monophosphat [95]. Da Lymphozyten im Gegensatz zu anderen Körperzellen (welche über einen Salvage Pathway verfügen) über- wiegend von dieser De-novo-Synthese abhängig sind, wird die Purin-Biosynthese dieser Zellen nahezu selektiv gehemmt [96] (Abb.10).
Abb. 10: Ablauf der Immunkaskade mit Angriffsorten von Ciclosporin und MMF [26], Hemmung durch MMF
Dieser zentrale Angriffspunkt führt zu einer Modulation verschiedenster Immunreaktionen wie:
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26
1. Inhibition der T- und B-Zellproliferation,
2. Inhibition der Glykosylierung von Adhäsionsmolekülen, 3. Inhibition der Antikörperreaktion,
4. Inhibition der Produktion von Zytokinen (wie IL1 und IL6) [97].
Bereits in den 70er bzw. 80er Jahren wurde MPA bei Patienten mit Psoriasis [98] und rheu- matoider Arthritis [99] eingesetzt, so dass hier schon Sicherheitsdaten gewonnen werden konnten.
Klinische Studien nach Nieren- [100,101,102] und Herztransplantationen [103] haben gezeigt, dass MMF in Dosen von 2-3 g pro Tag wirksam Abstoßungsreaktionen verhindern kann, ohne gleichzeitig die Inzidenz von Infektionen zu erhöhen [23]. In einem tierexperimentellen Modell der Hornhauttransplantation konnte der Nachweis erbracht werden, dass MMF das Transplantatüberleben signifikant verlängert [104]. Auch bei autoimmunologischen Prozes- sen, wie etwa im Modell der autoimmunen Uveoretinitis [105] oder dem experimentellen systemischen Lupus [106], konnte der therapeutische Nutzen von MMF nachgewiesen werden. Untersuchungen zur Immunbiologie der Keratoplastik belegen eine zentrale Rolle von T-Lymphozyten [107,108]. Bereits in der frühen, afferenten Phase einer Immunreaktion können Makrophagen und T-Lymphozyten im Transplantat nachgewiesen werden. Dieser initialen Sensibilisierungsphase schließt sich die Proliferation immunkompetenter Zellen an.
Zytokine und Lymphokine werden durch diese Zellen freigesetzt und verstärken den Prozess.
Schließlich erfolgt die Infiltration und Zerstörung des Transplantates (efferentes Stadium) [109,110]. MMF hat aufgrund seines Wirkmechanismus das Potential, diese Immunreak- tionen zu beeinflussen. MMF führt im Gegensatz zu alkylierenden Substanzen oder Antimetaboliten nicht zu Chromosomenbrüchen bzw. Miscoding und ist daher nicht karzi- nogen. Außerdem verfügt es über eine große therapeutische Breite.
Allerdings kann MMF direkt nach peroraler Gabe Diarrhöe, Übelkeit und Erbrechen verur- sachen [111] und nach längerer Anwendung zu reversiblen hämatologischen (z.B. Anämie, Leukopenie, Neutropenie) und auch neurologischen (z.B. Kopfschmerzen, Tinnitus, Schlaf- störungen) Nebenwirkungen führen [26,111].
3.2.2 Hilfsstoffe
3.2.2.1 Benzalkoniumchlorid (BAC)
Eur. Ph. NT 2001/
USPXXVI: Benzalkoniumchlorid ist sowohl in der Eur. Ph. als auch im USP aufgeführt und ist ein Gemisch von Alkylbenzyldimethylammonium- chloriden, deren Alkylteil aus C8- bis C18-Ketten der Summenformel C17-27H30-50ClN (Mrel 354.0, berechnet als C22H40ClN ) besteht.
3.2.2.1.1 Eigenschaften
BAC, eine quartäre Ammoniumverbindung (Quat) oder auch Invertseife, ist ein weißes oder gelblich weißes, sehr bitteres, amorphes, hygroskopisches Pulver oder eine gelartige Masse von seifigem Griff und schwach aromatischem Geruch. Es ist in 1.5 Teilen Wasser, 2.5 Teilen Ethanol und 3.5 Teilen Chloroform löslich [32], wobei beim Schütteln einer wässrigen Lösung (pH 6.0-8.0) starke Schaumbildung eintritt, denn Quats sind, wie echte Seifen, grenz- flächenaktive Substanzen. BAC gilt als chemisch stabil. Eine Gehaltsabnahme kann in erster Linie durch Sorptionsverluste an Behältermaterialien, wie Naturgummi [112] oder gewissen PVC-Sorten [32], auftreten. Die Synthese von BAC erfolgt durch Benzylierung von Dime- thylalkylaminen.
3.2.2.1.2 Anwendung und Wirkungsweise
BAC wird als Desinfektionsmittel für Instrumente und Flächen und als Antiseptikum ein- gesetzt. Häufig kommt es als Kombinationspartner für andere Desinfektionsmittel zur Erwei- terung des Wirkungsspektrums, insbesondere gegen einige Viren, bzw. als remanent wirk- same Komponente zum Tragen. Weiterhin wird es als Konservierungsmittel in Salben und Arzneilösungen, vorrangig aber zur Hände- und Hautantiseptik in Konzentrationen von 0.3- 1.5% angewendet.
CH2 N CH3 CH3
R
R = C8H17 bis C18H37
+ Cl-
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BAC wird als antimikrobielles Konservierungsmittel in Augentropfen, zumeist in einer Kon- zentration von 0.01%, eingesetzt. Es gehört international zu den am häufigsten verwendeten Konservierungsmitteln für Ophthalmika. Das Wirkungsspektrum umfasst die grampositiven und die weniger empfindlichen gramnegativen Keime, wobei aber einige Pseudomonas-Arten resistent sind. Gegen Pilze und Viren ist BAC wenig wirksam, und Bazillensporen sind resistent. Durch Eiweiß, Eiter oder Serum kann BAC inaktiviert werden.
Der Wirkungsmechanismus beruht auf Anlagerung und Adsorption der Verbindung an die Oberfläche der Mikroorganismen, was zu einer Zerstörung des Aufbaus der Zytoplasmamem- bran führt. Wesentlich für die Wirkung sind der quartäre Stickstoff und eine oder mehrere lipophile Seitenketten, die mindestens acht Kohlenstoffatome enthalten müssen. Die hydro- phoben Seitenketten sind für die Wechselwirkung mit den Bakterienoberflächen verant- wortlich. Sie können in Membranen penetrieren und diese desintegrieren [113], so dass es zum Austritt von zytosolischem Material kommen kann. Die kationischen Köpfe können durch Ladungsneutralisation die Denaturierung von Proteinen bewirken.
In Draize-Tests wurde wiederholt die initiale Toxizität an Augengeweben und der Einfluss von BAC in Augentropfen auf die Heilung von verletzten Arealen am Auge geprüft. Dabei berichteten viele Wissenschaftler von einer toxischen Wirkung des Konservierungsmittels [114,115].
Von Richards und Mizhari [116] wurde gefunden, dass die Produkte verschiedener Pro- venienz nicht unbedingt dieselbe antimikrobielle Wirkungsstärke aufweisen, was auf die che- mische Zusammensetzung zurückgeführt wird. Am aktivsten soll das Tetradecyl-Homologe sein.
Die Wirkung ist im schwach sauren bis alkalischen Bereich optimal, zeigt aber insgesamt keine starke pH-Abhängigkeit. Citrat- und Phosphatpuffer, nicht aber Boratpuffer, können die Wirksamkeit gegen Pseudomonas herabsetzen [32]. Ein Zusatz von 0.1% EDTA kann resistente Pseudomonas-Stämme gegen BAC sensibilisieren [117,118], und Kombinationen mit einigen anderen Konservierungsmitteln können, insbesondere im Hinblick auf die Wirk- samkeit gegen Pseudomonaden, vorteilhaft sein. Die dreiteilige Kombination aus 0.01%
BAC, 0.05% EDTA und 0.5-0.6% Benzylalkohol wurde als optimal wirksam in Augentropfen befunden [32].
BAC und andere Quats erhöhen die Permeabilität der Hornhaut für schlecht penetrierende Stoffe [119,120]. Bei Langzeitanwendung dieser Stoffe ist Vorsicht geboten, da Auswir- kungen auf den Tränenfilm und die corneo-konjunktivale Oberfläche beobachtet wurden [121,122].
Ein weiterer Aspekt, verglichen mit anderen Substanzen, ist die verstärkte Aufnahme von BAC in die Augengewebe. Green et al. [123] beobachteten eine Eliminierung von BAC aus dem Auge erst nach bis zu 48 h nach der Applikation, während andere ophthalmologische Substanzen schon nach 8-12 h nicht mehr in okularen Flüssigkeiten und Geweben nachzuweisen sind. BAC verbleibt z.T. in der Cornea, speziell im Epithel, welches somit als Reservoir für eine weitere Diffusion fungieren und zur Verlängerung der Wirkzeit führen kann.
3.2.2.2 Natriumedetat (EDTA)
Eur. Ph. NT 2001/
USPXXVI: Sowohl in der Eur. Ph. als auch im USP ist Natriumedetat aufgeführt, und ist identisch mit (Ethylendinitrilo)tetraessigsäure, Dinatriumsalz, Dihydrat der Summenformel C10H14N2Na2O8 x2H2O (Mrel 372.2).
3.2.2.2.1 Eigenschaften
Der Chelatbildner EDTA besteht aus weißen, geruchlosen und schwach sauer schmeckenden Kristallen, deren 5%ige wässrige Lösung einen pH-Wert von 4-5.5 aufweist. EDTA ist in 11 Teilen Wasser löslich, wenig löslich in Ethanol und unlöslich in Chloroform und Ether.
EDTA bildet in wässriger Lösung mit zwei- oder mehrwertigen Metallionen 1:1-Komplexe, die als 4- oder 6-zähnige Chelate [chele (griechisch) = Kralle, Klaue] formuliert werden können (Abb. 11). Dabei wird das Metallion in einem inneren Ring gebunden und dadurch unwirksam. Der aufgebaute Komplex ist wasserlöslich und dissoziiert nicht wesentlich. Die Stabilität der Komplexe wird durch die Stabilitätskonstante K bzw. log K beschrieben:
CH2 CH2 N N
CH2 CH2
CH2 CH2 COOH
COONa NaOOC
HOOC
THEORETISCHE GRUNDLAGEN
____________________________________________________________________________________________________
30
] [
] [
] [
2
2+ ⋅ −
= Me EDTA
MeEDTA K
Zur Herstellung von EDTA wird Ethylendiamin mit Formaldehyd und Blausäure umgesetzt.
Das hierbei entstehende schwer lösliche Ethylendiamintetraacetonitril wird abgetrennt und durch alkalische Verseifung mit Natronlauge in Tetranatriumedetat überführt. Beim Ansäuern auf pH 5 entsteht das Dinatriumsalz, bei noch stärkerem Ansäuern die vierwertige Edetinsäure (pKa1=2.0, pKa2=2.67, pKa3=6.16, pKa4=10.26). Der Nachteil dieses Verfahrens liegt im tech- nischen Einsatz der sehr toxischen Blausäure, die auch korrodierend wirkt.
Abb. 11: Struktur eines EDTA-Metall(II)ion-Komplexes [60]
3.2.2.2.2 Anwendung und Wirkungsweise
EDTA wird aufgrund seiner komplexierenden Eigenschaften gegenüber zwei- oder mehr- wertigen Metallionen zur Entfernung dieser aus dem Körper genutzt. So wird der Chelat- bildner z.B. zur Therapie der Hypercalcämie [124], bei Erkrankungen mit Kalkablagerungen in den Gefäßen [125] (z.B. Herzkranzgefäße) [124], Haut (Sklerodermie) oder anderen Gewe- ben (z.B. Herzklappen) [124] eingesetzt. Weiterhin findet EDTA Anwendung zur Entcalci- fizierung der Niere, zur Behandlung von Hämochromatosen, Bleivergiftungen, zur Retention von radioaktiven Metallen im Körper, zur Kontrolle von durch Digitalis induzierten Herz- rhythmusstörungen und zur Behandlung der akuten Porphyrie [124].
Am Auge wird EDTA therapeutisch gegen Kalkverätzungen und zum Abbau endogener Kalkablagerungen verwendet. Ferner dient es zur Inaktivierung bakterieller Herde und wirkt als Synergist zum BAC. Als Hilfsstoff dient EDTA zur Komplexierung von Schwermetall-
ionen zwecks Verhinderung der Oxidationskatalyse von Arzneistoffen, ferner als Nebenhilfs- stoff in einem Großteil der Kontaktlinsenflüssigkeiten.
3.2.2.2.3 Anwendungsbeispiele für BAC und EDTA in Augentropfen
Tabelle 2 zeigt zusammenfassend die Anwendung von BAC und EDTA in arzneistoffhaltigen Augentropfen. 79% aller wirkstoffhaltigen Präparate aus der Roten Liste [126] sind mit BAC konserviert, von denen 55% EDTA als Stabilisator enthalten.
Tabelle 2: Anwendung von BAC und EDTA in Augentropfen [126], exklusive Filmbildner- präparate
Konservierungsmittel und/oder Synergist
Fertigarzneimittel
Digophton Augentropfen Aquamycetin N Augentropfen Floxal Augentropfen
Gent-Ophthal Augentropfen Kana-Stulln Augentropfen Ophtagram Augentropfen Refobacin Augentropfen BAC
Predni-POS Augentropfen
Albucid liquidum 10% Augentropfen Betam-Ophthal Augentropfen
Chibroxin Augentropfen Ciloxan Augentropfen Dispagent Augentropfen Efflumidex Augentropfen BAC und EDTA in
Kombination
Gentamycin-POS Augentropfen
Combiamid Augentropfen (Chlorobutanol) Kombi-Stulln Augentropfen (Antibiotika)
Dexagel Augentropfen (Benzododeciniumchlorid) Chibro-Cadon Augentropfen (Benzododecinium- bromid)
EDTA in Kombination mit anderen Konservierungsmitteln (in Klam- mern) oder in Antibiotikapräparaten
Sophtal-POS N Augentropfen (Chlorhexidindi- gluconat)
THEORETISCHE GRUNDLAGEN
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32
3.2.2.3 Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin (HP-β-CD)
HP-β-CD: R = (CH2-CHCH3O)nH
Eur. Ph. NT 2001: In der Eur. Ph. ist lediglich Betadex (Betacyclodextrin) als Cyclo-α-(1-4)-D-heptaglucopyranosid der Summenformel [C6H10O5]7 (Mrel 1135) aufgeführt.
3.2.2.3.1 Cyclodextrine allgemein
Native Cyclodextrine (CDe), auch Schardinger-Dextrine genannt, sind cyclische Oligosac- charide, die üblicherweise aus sechs bis acht 1,4-α-glykosidisch verknüpften Glucoseein- heiten bestehen (α-, β- und γ-CD). Die (Bio)synthese der nativen CDe erfolgt in der Regel aus Stärke durch Hydrolyse und anschließende Cyclisierung unter Einwirkung des bakteriellen Enzyms Glycosyltransferase.
Moleküle bzw. Molekülteile mit passenden molekularen Dimensionen, die größtenteils lipo- philen Charakter aufweisen, werden in den vom CD gebildeten, runden, leicht konischen Hohlraum eingeschlossen und unter Verminderung der Ringspannung durch hydrophobe Wechselwirkungen, van der Waals- oder Wasserstoffbrücken-Bindungen fixiert [127]. Die hydrophileren Hydroxylgruppen im CD-Molekül weisen dabei eine Auswärtsrichtung auf, die deutlich lipophileren Kohlenstoff- sowie Ethersauerstoff-Gruppierungen sind nach innen gerichtet. Die Durchmesser der von α-, β- und γ-CD gebildeten Kavitäten liegen zwischen 0.47 und 1.0 nm [128].