EXPERIMENTELLER TEIL
5.2.10 Permeation durch Zellkulturen
5.2.10.2 Kultivierung von Kaninchencornea-Epithelzellkultur
Die Kultivierung von KCEZ erfolgte prinzipiell wie unter 5.2.10.1 nach einem modifizierten Protokoll von Chang et al. [345]. Dazu wurden die Kaninchen, wie oben beschrieben, getötet, der Augapfel entnommen und dieser in eiskalten HBSS gegeben. Der Augapfel wurde dann in einem speziellen Halter fixiert und lediglich die Epithelschicht der Hornhaut mit 0.2% Pro-tease für 60 min inkubiert. Die weitere Bearbeitung erfolgte wie für KKEZ, jedoch wurden die Epithelzellen hier durch ein 40 µm Zellfilter (Falkon, Lincoln Park, USA) gefiltert. Die anschließende Resuspendierung der Zellpellets nach dem Zentrifugieren fand entweder in PC-1-Medium oder DMEM/F12 statt, welche mit 1 µg/ml Fungizone®, 50 µg/ml Gentamycin, 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, Insulin-transferrin-selenium (ITS+) Premix, 30 µg/ml Rinder-Hypophysenextrakt (BPE), 1 ng/ml Epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) und 0.36 µg/ml Hydrocortison versetzt waren.
Die isolierten Epithelzellen wurden in einer Dichte von 0.9 x 106 Zellen/cm2 in Transwells (vgl. 5.2.10.1) ausgesät. Die weitere Bearbeitung erfolgte wie unter 5.2.10.1 beschrieben.
Abb. 52: 6.5 mm Clear Transwell mit permeabler Filtereinlage [344]
5.2.10.3 Bioelektrische Messungen
TEER und PD der beiden Zellkulturen (KCEZ und KKEZ) wurden täglich während des Kulti-vierens und unmittelbar vor und nach einer Permeationsstudie mit einem epithelialen Volt-ohmmeter (EVOM, World Precision Instruments, Sarasota, USA) gemessen. Zur Korrektur wurden der Hintergrund-TEER und -PD, gemessen in einem Transwell ohne Zellkultur und befüllt mit Kulturmedium bzw. BR, vom eigentlichen Messwert abgezogen.
5.2.10.4 Permeationsstudien
Die Permeationsstudien mit P-HCl durch KKEZ und KCEZ wurden in den Transwells ausge-führt, in denen die Züchtung der Zellkulturen erfolgte (Abb. 52). Es kamen ausschließlich Kulturen mit optimalen bioelektrischen Parametern zum Einsatz, so dass von einer geschlos-senen und intakten Monolayer ausgegangen werden konnte (zwischen Tag 6 und 8 der Kulti-vierung). Nachdem das Kulturmedium mittels einer Vakuumpumpe abgesaugt worden war, fand eine Inkubation (1 h) der Zellen in temperiertem BR-Puffer statt. Anschließend wurden der TEER und die PD der Zellen vermessen, der Puffer von der oberen Seite des Transwells entfernt und durch die Arzneistofflösung ersetzt. Nach 30, 60, 120, 180 und 240 min wurden je 200 µl aus dem Akzeptormedium entnommen und mit dem gleichen Volumen von tempe-riertem BR wieder ergänzt. Nach Beendigung des Permeationsexperimentes wurden erneut
EXPERIMENTELLER TEIL
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144
die bioelektrischen Daten aufgenommen. Die gesammelten Proben wurden per HPLC auf den P-HCl-Gehalt untersucht (vgl. 5.2.2.1).
Standardbedingungen bei den Permeationsuntersuchungen Permeationsfläche 0.33 cm2
Donatorvolumen 0.2 ml
Akzeptorvolumen 0.8 ml
Probenvolumen 0.2 ml
Pufferlösung BR
Membran KKEZ, KCEZ
Temperatur 37 ± 1.0 °C
95% Luft/5% CO2 - Begasung
Für die pH-abhängigen Untersuchungen (vgl. 4.3.2/3) wurde BR pH 6.4 durch Zugabe von 0.1N HCl und BR pH 8.4 durch Zugabe von 0.1N NaOH hergestellt. Eine BR-Tonizität von 80 mOsmol/kg war durch die Reduktion des NaCl-Anteils im Puffer zu erreichen und die hypertone Präparation (600 mOsmol/kg) wurde durch Zugabe von Saccharose zum BR her-gestellt.
5.2.11 Statistik
Die tabellierten Daten und die verwendeten Symbole in den Abbildungen geben die Mittel-werte wieder, die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (SD) dar, wobei ein bestimm-ter Stichprobenumfang (n) zugrunde gelegt wird. Die Signifikanzprüfung von Messwerten erfolgte nach Prüfung auf Normalverteilung nach David und auf Varianzhomogenität (F-Test) mittels zweiseitigem t-Test mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% (p<0.05). Bei nicht-normalverteilten Werten erfolgte die Signifikanzprüfung mit Hilfe des Mann-Whitney-Tests (u-Test).
Die Ermittlung des statistischen Unterschieds zwischen multipel unterschiedlichen Gruppen fand unter Nutzung von One Way Analysis of Variance (ANOVA) unter Anwendung des Student-Newman-Keuls Multiple Comparison Tests zum Vergleich der Mittelwerte statt, wobei p<0.05 als statistisch signifikant angenommen wurde. Die Annahme der Normal-verteilung und Varianzhomogenität wurde ebenfalls getestet und die Signifikanz durch nicht-parametrische Analyse unter Verwendung von Kruskal-Wallis ANOVA On Ranks Test be-stätigt. Für diese Kalkulationen wurde StatView (Abacus Concepts, Berkeley, USA) verwen-det.
6 ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich vorrangig mit der Permeation von Pilocarpin-HCl (P-HCl), Diclofenac-Natrium (D-Na), Mycophenolatmofetil (MMF) und Mycophenolsäure (MPA) durch verschiedene tierische okulare Gewebe, wie unbehandelte und gelaserte Schweinecornea (SC), Schweinesklera (SS) bzw. Kaninchenkonjunktiva (KK), sowie durch corneale (KCEZ) und konjunktivale (KKEZ) Kaninchenepithelzellkultur ohne und unter Ein-fluss von Formulierungsparametern. Weiterhin wurde die synthetische Membran Nephro-phan® (NP) als Permeationsbarriere eingesetzt. Die Ergebnisse der in vitro-Permeations-studien sollen als Orientierungshilfe dienen, um Rückschlüsse auf die in vivo-Verfügbarkeit der untersuchten Arzneistoffe zu ermöglichen. Im Falle des Modellarzneistoffs P-HCl wird mit diesen Studien außerdem eine Einschätzung der Korrelierbarkeit zwischen isolierten Geweben und Zellkulturen versucht.
Als Voruntersuchungen zu den Permeationsstudien wurden von SC und SS der Proteingehalt, die Hydratation im jeweiligen Versuchsmedium und die Wirkstoffaufnahme in das Gewebe bestimmt. Unter Verwendung der Raster-Elektronenmikroskopie (REM) wurden Veränderun-gen der Epitheloberfläche, hervorgerufen durch das Lasern des Epithels sowie durch Einwir-kung von Benzalkoniumchlorid (BAC), untersucht.
Permeationstudien mit P-HCl durch isolierte Gewebe und Zellkulturen
Der Schwerpunkt der vorliegenden Dissertation lag auf der Untersuchung des hydrophilen Antiglaukomatosums P-HCl, von dessen 2%igen Zubereitungen die Permeabilitätskoeffi-zienten (Peff) durch SC, SS, KK als auch durch KCEZ und KKEZ unter dem Einfluss von BAC und/oder Natriumedetat (EDTA), verschiedenen pH-Werten und Tonizitäten ermittelt wurden.
Abb. 53 stellt die Permeabilitäten von SC, SS und KK für P-HCl gegenüber und weist den höchsten Wert für die SS (Peff = 5.92 ± 1.21 x 10-6 cm/s), das Gewebe mit der vergleichsweise ausgeprägtesten Hydrophilie, aus. Tendenziell erwies sich die Konjunktiva als am geringsten permeabel für P-HCl (Peff = 1.72 ± 0.69 x 10-6 cm/s), wobei das Ausmaß der parazellulären Diffusion des Arzneistoffs jedoch nicht signifikant verschieden von der SC (Peff = 2.54 ± 0.75
ZUSAMMENFASSUNG
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x 10-6 cm/s) war. Erfahrungsgemäss ist die Konjunktiva für hydrophile Substanzen leichter passierbar als die Cornea, wie auch der Vergleich der Zellkulturexperimente von Cornea (KCEZ) und Konjunktiva (KKEZ) beweist (Abb. 54). Bei der Gegenüberstellung in Abb. 53 müssen jedoch die unterschiedlichen Tierspezies (Schwein bzw. Kaninchen) und differieren-den Ussing-Kammer-Modelle berücksichtigt werdifferieren-den (A und B).
Abb. 53: Peff von P-HCl durch Schweinecornea, -sklera und Kaninchenkonjunktiva, n = 5-12, (*) p<0.05 verglichen mit der jeweiligen 2%igen P-HCl-Lösung; A: Permeationsmodell und Provenienz der Gewebe identisch; B: anderes Modell und andereTierspezies Der permeabilitätsfördernde Einfluss von 0.01% BAC auf die P-HCl-Permeation war für alle drei isolierten Gewebe signifikant, aber unterschiedlich stark ausgeprägt: SS < SC < KK und entspricht einem 1.2-, 3.1- bzw. 3.3fachen Peff, verglichen mit der jeweiligen konservierungs-mittelfreien Präparation (Abb 53). 0.05% EDTA führte dagegen nicht zur signifikanten Per-meabilitätssteigerung.
Abb. 54: Korrelation der Peff von P-HCl durch isolierte Gewebe und Zellkulturen, n=3-12, (*) p<0.05 verglichen mit isolierten Geweben
Trotz unterschiedlicher Tierspezies ergab sich eine gute quantitative Korrelierbarkeit der Peff
zwischen isolierter Cornea (SC) und der Epithelzellkultur (KCEZ) (Abb. 54 links). Lediglich
SS
P-HCl 2% BAC 0.01% EDTA 0.05%
Peff [10-6 cm/s]
P-HCl 2% BAC 0.01% EDTA 0.05%
Peff [10-6 cm/s]
KK KKEZ
0.05% EDTA waren von differenziertem Einfluss auf die P-HCl-Diffusion durch die beiden Barrieren.
Dagegen resultierten beim Vergleich der konjunktivalen Barrieren gleicher Tierspezies (Ka-ninchen) wesentlich höhere Zellkultur-Permeabilitäten für P-HCl gegenüber der exzidierten Konjunktiva (Abb. 54 rechts). Die Permeation von P-HCl war ca. 20-50fach höher durch KKEZ verglichen mit KK. 0.01% BAC steigerte die Permeation durch KK um das 3.3fache im Vergleich zur P-HCl-Lösung ohne Konservierungsmittelzusatz, während eine nur 1.5fache Steigerung des Peff, hervorgerufen durch 0.01% BAC, bei KKEZ resultierte. Im Gegensatz dazu verursachten 0.05% EDTA die doppelte Arzneistoffkonzentration im Akzeptormedium der Zellkultur, wiederum verglichen mit der hilfsstofffreien Zubereitung, während eine nur 1.5fache Arzneistoffmenge durch KK das Akzeptormedium erreichte.
Abb. 55 fasst die Einflüsse der getesteten Formulierungsparameter auf KCEZ bzw. KKEZ zu-sammen, wobei die prozentuale Zu- bzw. Abnahme des Peff gegenüber der Referenz (2% P-HCl in BR, pH 7.4, 300 mOsmol/kg) dokumentiert ist.
Abb. 55: Veränderung [%] der Peff von P-HCl durch corneale und konjunktivale Epithelzellkultur unter Einfluss unterschiedlicher Formulierungsparameter
In qualitativer Hinsicht sind die Effekte der genannten Formulierungsparameter auf beide Zellkulturen als ähnlich einzuschätzen, was wahrscheinlich mit der vergleichbaren Anatomie der cornealen und konjunktivalen Epithelzellen zu begründen ist. Der Enhancer-Effekt von BAC lässt sich generell bestätigen.
Peff Veränderung [%] gegenüber Referenz (Ordinate) a
ZUSAMMENFASSUNG
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KCEZ weist eine besondere Empfindlichkeit gegenüber 0.01% BAC auf, wohingegen diese Zellkultur den anderen Formulierungsparametern gegenüber als relativ unempfindlich er-scheint. Dagegen reagierte die KKEZ sensibel auf BAC und EDTA in abgestufter Konzen-tration bzw. in Kombination.
Die Sensibilität beider Zellkulturen gegenüber pH-Veränderungen war gering. Erwartungs-gemäß führte ein pH-Wert von 6.4, bedingt durch den erhöhten Ionisierungsgrad von P-HCl, zu einer schwachen, aber nicht signifikanten Senkung der Arzneistoffkonzentration auf der Akzeptorseite beider Zellkulturen. Auch im Hinblick auf die Tonizität der Arzneistofflösung zeigte sich nur mäßige Empfindlichkeit. Lediglich eine hypotonische Zubereitung verursachte eine signifikante Steigerung der P-HCl-Permeation durch KKEZ um ca. 90%.
Schlussfolgernd hat diese Studie gezeigt, dass die parazelluläre Diffusion von P-HCl durch isolierte Gewebe und Zellkulturen unterschiedlich durch Formulierungsparameter beeinflusst werden kann. Die Korrelation zwischen den isolierten Geweben und Zellkulturen hinsichtlich der Qualität und Quantität der Effekte der Formulierungsparameter war gut, auch wenn Ein-schränkungen beim Vergleich konjunktivaler isolierter Gewebe und Zellkulturen gemacht werden müssen.
Permeationstudien mit P-HCl und D-Na durch gelaserte Schweinecornea
An Hand dieser Studie sollte die Wundheilung des Corneaepithels nach erfolgter Photorefrak-tiver Keratektomie (PRK) simuliert werden, bei der eine zeitabhängige Reepithelisierung der Cornea stattfindet. In der Excimer-Laser-Studie wurde die Permeation von P-HCl (hydro-philer Arzneistoff) und D-Na (lipo(hydro-philer Arzneistoff) durch Hornhäute unterschiedlicher Epi-theldicke verglichen (Abb. 56).
Die parazelluläre Diffusion von P-HCl nahm mit zunehmender Ablationstiefe signifikant zu, da die Barrierefunktion der Cornea für hydrophile Stoffe durch die Abtragung der Zell-schichten abnimmt. Verglichen mit unbehandelter Cornea (SC) erfolgte bereits nach Ablation von 25% des Epithels (SC 25%) eine Verdoppelung des Peff, während in den folgenden Ab-lationsstufen nur noch eine Steigerung um das jeweils 1.5fache resultierte. Ursache hierfür ist die ausgeprägte Barrierefunktion der beiden oberen Zellschichten des Epithels, die das Aus-maß der parazellulären Permeation determinieren. Interessanterweise verursachte die
Entfer-nung der Bowman-Membran (SCo.E, o.B) keine weitere Erhöhung der Permeabilität der Cornea, im Vergleich zu einer Hornhaut, der nur das Epithel entfernt wurde (SCo.E).
Abb. 56: Permeation von D-Na (aus GBR/PG) und P-HCl (aus GBR) durch gelaserte Schweinecornea
Parallel zu den vorangegangenen Versuchen wurde der Einfluss von 0.01% BAC auch auf die Permeation durch gelaserte Hornhäute untersucht. In Analogie zu den Befunden mit intaktem Gewebe erfolgte eine Permeationsförderung, wobei die Peff wiederum proportional zur Abla-tionstiefe anstiegen wie bei der hilfsstofffreien Formulierung. 0.05% EDTA hatten einen dif-ferenzierten, aber insgesamt moderaten permeationsfördernden Einfluss.
Im Gegensatz zu P-HCl resultierten für D-Na nur geringfügige Unterschiede zwischen den Ablationsstufen. Dieses Resultat bestätigt die Hypothese, dass das Epithel für lipophile Stoffe lediglich eine limitierte Barrierefunktion ausübt, während das Stroma die Hauptbarriere darstellt. Erst bei vollständiger Entfernung des Epithels konnte eine signifikante Erhöhung der Arzneistoffpassage durch die Cornea verzeichnet werden.
Der Peff durch intakte Cornea betrug für D-Na lediglich 1.77 x 10-6 cm/s gegenüber 2.54 x 10-6 cm/s für P-HCl, obwohl im Allgemeinen lipophile Stoffe, wie D-Na, die Cornea leichter passieren als das hydrophile P-HCl. Wie die Ergebnisse der vergleichenden Permeations-studien mit P-HCl in GBR/PG bzw. GBR als Versuchsmedium schlussfolgern lassen, wird dieses Phänomen durch das verwendete osmotisch aktive Versuchsmedium GBR/PG hervor-gerufen. Die P-HCl-Permeation aus GBR ist ca. um den Faktor 11 größer als aus GBR/PG (Peff = 0.22 x 10-6 cm/s). Beim Vergleich der Permeation von P-HCl und D-Na aus dem gleichen Permeationsmedium (GBR/PG) bestätigte sich, dass lipophile Substanzen die Cornea
0 5 10 15 20
SC 25% 50% 75% o.E o.E, o.B
Peff [10-6 cm/s]
D-Na P-HCl
ZUSAMMENFASSUNG
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150
leichter passieren als hydrophile Stoffe. Der Peff von D-Na betrug das 8fache, verglichen mit dem Peff von P-HCl.
Eine messbare Diffusion von D-Na erfolgte erst nach einer Lagtime von 119 min. Diese Lag-time nimmt mit zunehmender Ablationsrate ab. Es ist anzunehmen, dass eine Akkumulation des lipophilen Arzneistoffs im Epithel stattfindet, einhergehend mit einer Verzögerung der transzellulären Permeation in direkter Proportionalität zur Epitheldicke.
Im Ergebnis ist festzustellen, dass die Arzneistoffpermeation durch Hornhäute mit unter-schiedlich dickem Epithel in Abhängigkeit von den physikalisch-chemischen Eigenschaften der Arzneistoffe variiert. Demnach kann während des Wundheilungsprozesses nach PRK eine Konzentrationserhöhung hydrophiler Arzneistoffe im Kammerwasser, verbunden mit uner-wünschten Nebenwirkungen, nicht ausgeschlossen werden. Im Gegensatz dazu wird die Per-meation des lipophilen Arzneistoffs D-Na kaum verändert.
MMF-Formulierung und Permeation
MMF wurde bisher lediglich systemisch bei Hornhauttransplantationen und okularen Auto-immunerkrankungen angewendet, wobei es aber direkt nach der Applikation Diarrhöe, Übelkeit und Erbrechen und auf lange Sicht Leukopenie und Sepsis hervorrufen kann. Des-halb war es eine weitere Aufgabe dieser Arbeit, eine topisch applizierbare Zubereitung zur Testung dieses Arzneistoffs am Auge zu entwickeln.
Als Resultat der Löslichkeitsstudie erwies sich GBR mit 10% HP-β-CD als geeignetes Lö-sungsmittel für MMF. Die gewünschte Konzentration von 1% MMF war jedoch erst durch Erhitzen dieser Formulierung im Autoklaven (121° C, 200 kPa, 15 min) zu erzielen, wobei allerdings eine ca. 50%ige hydrolytische Spaltung des Prodrugs zum aktiven MPA erfolgte.
An Hand der ermittelten Daten der in vitro-Permeationsstudie kann davon ausgegangen werden, dass das Prodrug MMF keine Vorteile gegenüber MPA hinsichtlich der Verfüg-barkeit bei der topischen okularen Anwendung bietet. Aus einer 0.57%igen MMF-Lösung, die aus einer 1%igen MMF-Zubereitung durch Autoklavieren und damit verbundener Hydrolyse des Esters hervorging, gelangten kaum messbare Konzentrationen des Esters in die Akzeptor-kammer. Im Gegensatz dazu war MPA im Akzeptormedium zu detektieren (Peff = 5.48 x 10-6
cm/s). Die größere Bioverfügbarkeit von MMF gegenüber MPA bei oraler Applikation konnte für die Cornea nicht bestätigt werden, da die Mrel von MMF wahrscheinlich ein Limit für die Diffusion durch die Cornea darstellt.
Bei in vivo-Verteilungsstudien an Kaninchenaugen, durchgeführt in unserer Arbeitsgruppe [289], wurde eine größere MPA-Konzentration in der Cornea bei topischer Applikation von 1%iger MMF-Lösung gefunden als bei der Anwendung von MPA-Lösung gleicher Konzen-tration (Sörensen-Phosphat-Pufferlösung pH 7.4, 10% HP-β-CD, Autoklavieren).
Resümee
Erstmalig wurden vergleichende in vitro-Permeationsstudien unter Nutzung mehrerer okularer Gewebe (Cornea, Sklera und Konjunktiva) sowie von Zellkulturen durchgeführt. Aus den Er-gebnissen kann geschlussfolgert werden, dass die Permeation eines Arzneistoffs nicht nur von den physikalisch-chemischen Eigenschaften des Pharmakons (VK, Mrel, pKa) abhängt, sondern in hohem Maße auch von den Formulierungsparametern (BAC, EDTA, pH, Tonizität) be-einflusst wird. Die Untersuchungen mit gelasertem Gewebe erbrachten darüber hinaus orien-tierende Aussagen über den Stofftransport nach invasiver Behandlung (z.B. PRK). Jedoch ist die Korrelierbarkeit mit in vivo-Resultaten im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht worden, so dass die vorliegenden Ergebnisse als Grundlage für Permeationsstudien am in vivo-Modell zu bewerten sind.
ANHANG
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152
7 ANHANG
7.1 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Pilocarpinsäure [%] in Cornea und Iris/Ziliarkörper nach topischer Applikation einer 0.01 M
Pilocarpinlösung 18 Tabelle 2: Anwendung von BAC und EDTA in Augentropfen, exklusive Filmbildnerpräparate 31 Tabelle 3: Eigenschaften und Toxizität modifizierter β-CDe 34 Tabelle 4: In vitro- und in vivo-Untersuchungen zur ophthalmologischen Anwendung von Wirkstoff/HP-β Komplexen 36 Tabelle 5: Beispiele von CMC-Werten (experimentell ermittelt) 37 Tabelle 6: Geradenanstieg tan α, Korrelationskoeffizienten R2 und apparente Komplexstabilitätskonstanten KStab der Systeme MMF/HP-β-CD und MPA/HP-β-CD 44 Tabelle 7: Physikalisch-chemische Kenngrößen der wässrigen P-HCl-Lösungen 45 Tabelle 8: Physikalisch-chemische Kenngrößen der wässrigen D-Na-Lösung 47 Tabelle 9: Physikalisch-chemische Kenngrößen der wässrigen MMF/HP-β-CD- und MPA/HP-β-CD-Lösungen 48 Tabelle 10: Verteilungskoeffizienten VK (Octanol/GBR) für die angewendeten Arzneistoffe 49 Tabelle 11: Wassergehalt (WG) und Wasseraufnahme (WA) in [mg/mg Gewebe] von Schweinecornea (1)
unbehandelt, (2) 50% Epithel und (3) ohne Epithel nach Inkubation in Wasser, GBR oder GBR/PG 58 Tabelle 12: Wassergehalt (WG) und Wasseraufnahme (WA) in [mg/mg Gewebe] von Schweinesklera nach
Inkubation in Wasser, GBR oder GBR/PG 61 Tabelle 21: Permeationsdaten von MPA aus einer MMF-Lösung 1% (= 0.43% MPA) und aus einer MPA-Lösung 0.74% 92 Tabelle 22: Permeationsdaten von 2%igen P-HCl-Lösungen durch Schweinecornea unterschiedlicher Epitheldicke 97 Tabelle 23: Permeationsdaten der D-Na-Lösung durch Schweinecornea unterschiedlicher Epitheldicke 102
7.2 Abbildungsverzeichnis
Abb. 7: A: weiter Kammerwinkel; B: enger Kammerwinkel; 1 = Ziliarkörper, 2 = Iris; 3 = Trabekelmaschenwerk, 4 = Schlemm’scher Kanal, 5 = Vene, 6 = Hornhaut 20 Abb. 8: Hemmung der Prostaglandinsynthese durch Pharmaka 22 Abb. 9: Abbauprodukte von MMF; 1 = MPA, 2 = MMF, 3 = N-Oxid des MMF, 4 = 2-Morpholinoethanol, 5 =MPA-Lactonanalogon, 6 = MPA-Hydroxylactonanalogon, 7-9 = unbenannt 24 Abb. 10: Ablauf der Immunkaskade mit Angriffsorten von Ciclosporin und MMF, Hemmung durch MMF 25 Abb. 11: Struktur eines EDTA-Metall(II)ion-Komplexes 30 Abb. 12: Corneale Permeationswege für Wirkstoffe in Anwesenheit von CDen; (Df) freier Wirkstoff, (CDf)
freies CD, D.CD) Wirkstoff-CD-Komplex, (C) Komponenten des Tränenfilms, (K) konstante 35 Abb. 13: Löslichkeitsverbesserung von D-Na in GBR (pH 7.4) mittels Solubilisatoren 38 Abb. 14: Löslichkeitsverbesserung von MMF in GBR (pH 7.4) mittels Solubilisatoren 40 Abb. 15: Sättigungskonzentrationen von MMF, gemessen als unverändertes MMF und dem Hydrolyseprodukt MPA nach Zusatz von HP-β-CD 41 Abb. 16: Löslichkeit von MMF (links) und MPA (rechts) in GBR (pH 7.4) in Abhängigkeit von der HP-β
Konzentration (nach Autoklavieren, 15 min, 200 kPa, 121° C) 42 Abb. 17: Schema der Bewegung von Arzneistoffen und Augenflüssigkeiten und deren Zusammensetzung im
vorderen Bereich des Auges 50 Abb. 18: Proteingehalt von Schweinecornea und -sklera [µg/mg Gewebe], n = 12 52 Abb. 19: Schema der Wasseraufnahme und -abgabe in der Cornea (Endothel = Barriere und Pumpe) 53 Abb. 20: Versagen der Endothelfunktion führt zur ungehinderten Flüssigkeitsaufnahme in das Stroma und Epithel 54 Abb. 21: Hydratation von Schweinecornea (unbehandelt, 50% Epithel, ohne Epithel) nach Inkubation in Wasser, GBR bzw. GBR/PG, n = 4, (*) p<0.05 verglichen mit SC 56 Abb. 22: Hydratation von Schweinesklera nach Inkubation in Wasser, GBR oder GBR/PG, n = 4, (*) p<0.05
verglichen mit GBR 60 Abb. 23: Aufnahme von P-HCl in isolierte Schweinecornea und -sklera, n = 6, (*) p<0.05 verglichen mit Sklera 63 Abb. 24: Aufnahme von D-Na in isolierte Schweinecornea und -sklera, n = 6, (*) p<0.05 verglichen mit Sklera 64 Abb. 25: Schematische Darstellung der okularen Absorption nach topischer okularer Arzneistoffadministration 66 Abb. 26: Der parazelluläre Permeationsweg 72 Abb. 27: Tight junction Struktur Modelle; A: Fusionsmodell (Plasmamembranen angrenzender Zellen
verschmelzen); B: integrierende Membranproteine sind Hauptstrukturelemente der Tight junctions 72 Abb. 28: Potentieller Mechanismus für eine passive transzelluläre Diffusion 74 Abb. 29: Permeationsprofil von P-HCl durch Schweinecornea unter Einfluss von BAC und EDTA, n = 9-10 77 Abb. 30: Permeationsprofil von P-HCl durch Schweinesklera unter Einfluss von BAC und EDTA, n = 12 80 Abb. 31: Vergleich der Permeation von P-Base und P-HCl durch Schweinecornea und -sklera, n = 5-12, (*) p<0.05 verglichen zu P-HCl 81 Abb. 37: Permeation von P-HCl durch Schweinecornea mit unterschiedlichen Epitheldicken unter Einfluss von BAC und EDTA, n = 8-13, (*) p<0.05 verglichen mit P-HCl 2% der jeweiligen Ablationsstufe (%-Angabe der Epithellaserung; o.E. = ohne Epithel; o.B. = ohne Bowman-Membran) 96 Abb. 38: Permeation von D-Na durch Schweinecornea unterschiedlicher Epitheldicke, n =8-12, (*) p<0.05 verglichen mit unbehandelter SC 101 Abb. 47: Peff (Kolumne) durch corneale Epithelzellkultur und TEER(final) (Punkt), n = 5-8; (*) p<0.05 verglichen
mit Referenz (P-HCl 2%, pH 7.4, 300 mOsmol/kg) 112 Abb. 48: Peff (Kolumne) durch konjunktivale Epithelzellkultur und TEER(final) (Punkt), n = 5-8; (*) p<0.05
verglichen mit Referenz (P-HCl 2%, pH 7.4, 300 mOsmol/kg) 116
ANHANG
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154
Abb. 49: Permeationszelle 131 Abb. 50: Permeationsapparatur für Schweinecornea, -sklera und Nephrophan® 132 Abb. 51: Präparation von Kaninchenkonjunktiva, Pfeile kennzeichnen Schneidrichtung 134 Abb. 52: 6.5 mm Clear Transwell mit permeabler Filtereinlage 143 Abb. 53: Peff von P-HCl durch Schweinecornea, -sklera und Kaninchenkonjunktiva, n = 5-12, (*) p<0.05 verglichen mit der jeweiligen 2%igen P-HCl-Lösung; A: Permeationsmodell und Provenienz der Gewebe identisch;
B: anderes Modell und andere Tierspezies 146 Abb. 54: Korrelation der Peff von P-HCl durch isolierte Gewebe und Zellkulturen, n = 3-12, (*) p<0.05 verglichen mit isolierten Geweben 146 Abb. 55: Veränderung [%] der Peff von P-HCl durch corneale und konjunktivale Epithelzellkultur unter Einfluss
unterschiedlicher Formulierungsparameter 147 Abb. 56: Permeation von D-Na (aus GBR/PG) und P-HCl (aus GBR) durch gelaserte Schweinecornea 149
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