EXPERIMENTELLER TEIL
5.2.2 Gehaltsbestimmungen .1 Pilocarpin-HCl
HPLC-Gehaltsbestimmung (P-HCl)
Pumpe Pump L 6000, E. Merck-Hitachi (Tokio, J)
Thermostat L-5020 Column Thermostat, E. Merck (Darmstadt) Integrator L-2500 Chromo Integrator, E. Merck-Hitachi (Tokio, J) Detektor UV/VIS- Detektor L 4250, E. Merck-Hitachi (Tokio, J)
Injektionsvolumen 10 µl Rheodyne 7125 Standardsechswegeinjektionsventil, (Cotati, CA, USA)
Stationäre Phase LiChrospher100 RP-18, 5 µm, 125 x 4 mm oder 250 x 4 mm (I.D.), (20°C), E. Merck (Darmstadt)
Mobile Phase 800 ml Wasser werden mit 6 ml (0.105 mol) Phosphorsäure 85%, 5 ml (0.036 mol) Triethylamin und 10 ml Methanol versetzt und mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt (20°C)
Externe Standards P-HCl, (bei Bedarf: Pilocarpinsäure, Isopilocarpinsäure) Flussrate 1.5 ml/min.
Wellenlänge 216 nm
Die flüssigchromatographische Gehaltsbestimmung (HPLC) von P-HCl in den unterschied-lichen Untersuchungsproben erfolgte in Anlehnung an die Methode von Wiesend [351]. Die Herstellung der Kalibrierungsstandardlösungen (externer Standard) erfolgte mit den jeweils
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verwendeten Medien in einem Konzentrationsbereich, in dem auch die unbekannten Konzen-trationen zu erwarten waren. Die Versuchsbedingungen sind tabellarisch aufgelistet.
HPLC-Gehaltsbestimmung (P-HCl)
Pumpe L 6200 A Intelligent Pump, E. Merck-Hitachi (Tokio, J) Detektor Diode Array Detector L 4500, E. Merck-Hitachi (Tokio, J) Interface Interface D 6000, E. Merck-Hitachi (Tokio, J)
Software D 6500 HPLC-Manager, E. Merck (Darmstadt) & Hitachi Instr. Inc.
(San Jose, CA, USA)
Autosampler AS-2000 A, E. Merck-Hitachi (Tokio, J) Injektionsvolumen 20 µl
5.2.2.2 Diclofenac-Na
Die spektrophotometrische (UV/VIS) Gehaltsbestimmung von D-Na erfolgte in wässriger Lösung beim Absorptionsmaximum (λmax) von 273 nm mit Hilfe eines Einstrahlphotometers (Unicam UV/VIS spectrometer 8625, Cambridge, GB). Es wurden UV-taugliche Quarzglas-küvetten der Schichtdicke 1.0 cm verwendet. Zum Nullabgleich wurde entweder Wasser oder die beim entsprechenden Versuch eingesetzte Pufferlösung verwendet.
Die Gehaltsbestimmung von D-Na mittels HPLC erfolgte nach einer Methode von Beaulieu et al. [352]. Die Erstellung einer Kalibrierkurve erfolgte gemäß der Beschreibung in 5.2.2.1. Die apparative Ausstattung entsprach ebenfalls 5.2.2.1 (Nutzung beider HPLC-Geräte), die son-stigen Bedingungen wurden in folgender Art und Weise modifiziert:
HPLC-Gehaltsbestimmung (D-Na)
Stationäre Phase LiChrospher100 RP-18, 5 µm, 125 x 4 mm oder 250 x 4 mm (I.D.), (20°C), E. Merck (Darmstadt)
Mobile Phase Methanol:Wasser:Triethylamin 70:30:0.2, auf pH 7 eingestellt mit Phosphorsäure 85%
Externe Standards D-Na Flussrate 1.0 ml/min.
Wellenlänge 273 nm
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1) Herrn Dr. B. Siefert danke ich herzlich für die Einweisung in die Präparationstechnik von augen.
2) Für die unkomplizierte Kooperation bei der Beschaffung der Schweineaugen möchte ich mich besonders bei Frau Uwarow (LVAT Ruhlsdorf, Groß Kreuz) bedanken.
5.2.2.3 Mycophenolatmofetil und Mycophenolsäure
Die HPLC-Bestimmung von MMF und MPA erfolgte unter Abwandlung der Methode von Hooijmaaijer [92], und die Kalibrierung erfolgte unter Verwendung eines externen Standards.
Die weiteren apparativen Bedingungen entsprachen wiederum 5.2.2.1. Für beide Arzneistoffe konnte das gleiche Fließmittel verwendet werden, da eine vollständige Trennung der Substan-zen durch unterschiedliche Retentionszeiten gegeben war.
HPLC-Gehaltsbestimmung (MMF und MPA)
Stationäre Phase LiChrospher100 RP-18, 5 µm, 125 x 4 mm oder 250 x 4 mm (I.D.), (20°C), E. Merck (Darmstadt)
Mobile Phase Phosphorsäure 0.07%:Acetonitril 2:1, auf pH 4.0 eingestellt mit konzentrierter NaOH
Externe Standards MMF, MPA Flussrate 1.2 ml/min.
Wellenlänge 215 nm 5.2.3 Proteinbestimmung
5.2.3.1 Präparation der Schweinecornea1)
Für sämtliche Studien mit Schweineaugen wurden Bulbi frisch geschlachteter Hausschweine unterschiedlichen Alters von den Eberswalder Fleischwerken (Eberswalde-Britz) und der Lehr- und Versuchsanstalt Teltow2) (LVAT Ruhlsdorf, Groß Kreuz, EV) verwendet.
Der Augapfel wurde auf einen für diesen Zweck konstruierten Bulbushalter (Deutschmann-Medizintechnik, Zittau) gelegt und nach makroskopischer Kontrolle der cornealen Integrität in dieser Halterung fixiert. Nach Befreiung von anhängendem Muskelgewebe wurde der Augapfel mit GBR gespült und anschließend die Cornea mit einem Skalpell rund ausge-schnitten, so dass sich um das unbeschädigte Gewebe noch ein ca. 2-3 mm breiter Skleralring befand. Unter Vermeidung eines Austritts größerer Mengen an Kammerwasserflüssigkeit oder Glaskörper wurde die ausgeschnittene Cornea mit einer kleinen Pinzette leicht angehoben und ggf. noch verbliebene Skleralfasern mit einer Präparationsschere durchtrennt. Die Hornhaut wurde anschließend vom unterseits anhaftenden Iris-Ziliarkörper-Gewebe abgezogen.
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1) An dieser Stelle sei Frau S. Krase, Institut für Pharmazie, großer Dank für ihre bereitschaft ausgesprochen.
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5.2.3.2 Präparation der Schweinesklera
Im Anschluss an die Präparation der Hornhaut erfolgte die Isolierung der Sklera. Dazu wurde der corneafreie Bulbus zunächst von allen inneren Geweben befreit und anschließend halbiert.
Die noch anhaftende Aderhaut auf der Innenseite der Sklera wurde mittels Pinzette entfernt und Reste von ggf. noch vorhandenem Muskelgewebe auf der Außenseite der Sklera wurden mit einer Präparationsschere abgetrennt.
5.2.3.3 Proteinbestimmung nach Lowry1)
Lösungen:
A: 2% Na2CO3 in 0.1 M NaOH
B: 0.5% CuSO4 x 5H2O in 0.8%iger Weinsäure
C: 1 ml Lösung B in 50 ml Lösung A (frisch hergestellt)
D: Folin-Ciocalteau-Reagenz (Säurekonzentration 1mol/l, Titration mit 1 M NaOH gegen Phenolphthalein)
Die zu untersuchenden Gewebe wurden vor der Bestimmung zunächst mittels Schere zerklei-nert und in Portionen zu ca. 30 mg Cornea und 65 mg Sklera geteilt (Feuchtgewicht). Zu die-sen Portionen wurden jeweils 1.5 ml Lösung C gegeben und 12 h geschüttelt (Thys 2, VEB MLW Labortechnik, Ilmenau). Anschließend erfolgte eine weitere Zerkleinerung der Gewe-bestücke mit Hilfe eines Ultraschallstabes (GM Sonopuls HD 70, Bandelin electronic, Berlin) unter Eiskühlung. Um ggf. noch vorhandene Gewebereste von der Proteinlösung abzutrennen, wurden die Proben zentrifugiert (Hermle Z 230, Hermle AG, Gosheim). Wiederum mit Lö-sung C wurde zu 2.0 ml aufgefüllt und die LöLö-sung weitere 10 min bei Raumtemperatur aufbe-wahrt. Unter sofortigem kräftigen Schütteln wurde Lösung D hinzugegeben und nach ca. 40 min die Extinktion bei 720 nm (Unicam UV/VIS spectrometer 8625, Cambridge, GB) gegen einen Leerwert (H2O bidest.) gemessen. Die Erstellung der Kalibrierkurve erfolgte in den Konzentrationsbereichen 7.5 x 10-4 bis 1.5 x 10-2 % mit Schweineserumalbumin als Standard.
Die Extinktion jeder Probe wurde dreifach vermessen.
5.2.4 Hydratationsstudien
Nach dem Lasern der Cornea (SC 50%) (vgl. 5.2.8.2) und mechanischer Epithelabrasio (SCo.E) mittels Skalpell erfolgte die Isolierung der zu untersuchenden Augenteile wie Cornea und Sklera (vgl. 5.2.3.1/2). Dabei wurden die Hornhäute so ausgeschnitten, dass sie ohne den o.g. skleralen Ring vorlagen. Mittels Trepan konnten vergleichbar große, kreisrunde Stücke von der Sklera ausgestanzt werden (Ø ca. 1.2 cm). Anschließend wurden die Gewebestücke einzeln auf einer Analysenwaage (ISO 9001, Sartorius AG, Göttingen) gewogen (Feucht-gewicht) und 1, 2, 3, 4 oder 5 h in Wasser, GBR bzw. GBR/PG unter Schütteln (GFL 3032, Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel) bei 33.5° C inkubiert. Nach Abtupfen des je-weiligen Inkubationsmediums erfolgte ein erneutes Auswiegen der bearbeiteten Proben (Feuchtgewicht) und anschließend eine Trocknung bis zur Massekonstanz bei 100° C im Trockenschrank (T 6030, Heraeus Instruments, Hanau) (ca. 24 h). Die getrockneten Gewebe wurden dann in einen Exsikkator überführt, um ohne Wasseraufnahme auf Raumtemperatur abzukühlen. Die Proben wurden erneut gewogen (Trockengewicht) und im Anschluss der Wassergehalt mit folgender Gleichung berechnet [353]:
mg/mg Gewebe = (Feuchtgewicht – Trockengewicht)/ Trockengewicht
Es wurden jeweils 4 Proben pro Zeiteinheit, Medium und Gewebeart untersucht. Die Berech-nung der Wasseraufnahme erfolgte durch Differenzbildung zwischen dem Wassergehalt des Gewebes nach der Inkubation und nach der Isolierung.
5.2.5 Penetrationsstudien
Die Isolierung von SC und SS erfolgte gemäss 5.2.3.1/2. Nach der Isolierung wurden die Gewebe wie für die Permeationsstudien präpariert und in die Ussing-Kammer (vgl. 5.2.6) ein-gespannt. Als Donatorlösungen dienten eine 2%ige P-HCl-Lösung (GBR) bzw. eine 2%ige D-Na-Lösung (GBR/PG). Die Akzeptorkammern waren jeweils mit dem wirkstofffreien Me-dium befüllt. Wie bei den Permeationsstudien (vgl. 5.2.6) wurde alle 30 min eine Probe von 1.0 ml aus den 20.0 ml Akzeptormedium entnommen und dieses durch frisches, vorge-wärmtes Akzeptormedium ersetzt. Nach 1, 2, 3, 4 bzw. 5 h Versuchsdauer wurden die SC bzw. SS (n=6) den Ussing-Kammern entnommen.
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1) Herrn G. Glowacz, Institut für Chemie, danke ich an dieser Stelle besonders für die Anfertigung der Permeationszellen.
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Die Gewebe wurden zunächst vom Donator- bzw. Akzeptormedium durch Abspülen mit GBR (P-HCl) bzw. GBR/PG (D-Na) befreit und der Teil der Gewebe, der dem Durchmesser der ef-fektiven Permeationsfläche entsprach, ausgeschnitten. Nach Bestimmung des Feuchtge-wichtes dieser Gewebe wurden sie unter Eiskühlung mit dem Ultraschallstab (GM Sonopuls HD 70, Bandelin electronic, Berlin) zerkleinert. Um die Effektivität der Arzneistoffextraktion zu erhöhen, wurde im Falle von P-HCl die Zerkleinerung des Gewebes in einem Gemisch von 3 Teilen DMSO (Synopharm, Barsbüttel) und 7 Teilen GBR vorgenommen. Für die Extrak-tion von D-Na wurde ein Gemisch von 7 Teilen DMSO und 3 Teilen GBR verwendet. Das Volumen der Extraktionsflüssigkeit betrug jeweils 1.5 ml. Anschließend wurden die Homo-genate zentrifugiert und in der überstehenden Lösung mittels HPLC die Gehalte an P-HCl und D-Na ermittelt (vgl. 5.2.2).
5.2.6 Permeation durch isolierte Cornea/Sklera und Nephrophan®