ERGEBNISSE UND DISKUSSION
4.1.2 Charakterisierung der Donatorlösungen
Aufgrund des vorgesehenen Einsatzes der o.g. Arznei- und Hilfsstoffe in Form wässriger Lösungen wurden für die Formulierungen, die in den Permeationsstudien als Donatormedien zur Testung gelangten, ophthalmologisch relevante physikalisch-chemische Kenngrößen, wie Viskosität, Osmolalität, Brechungsindex (RI), Dichte und Oberflächenspannung (OS), ermittelt, um vor allem die Akzeptanz gegenüber den zu untersuchenden Geweben sicherzu-stellen. Zur Beurteilung der Polarität der verwendeten Arzneistoffe wurde der Verteilungs-koeffizient (VK) (Octanol/LM) bestimmt.
4.1.2.1 Pilocarpinhydrochlorid-Lösungen
Die für sämtliche in vitro-Studien verwendeten P-HCl-Lösungen können an Hand der phy-sikalisch-chemischen Daten (Tabelle 7) als verträglich für das okulare Gewebe angesehen werden.
Tabelle 7: Physikalisch-chemische Kenngrößen der wässrigen P-HCl-Lösungen Wirk-/Hilfsstoffe Medium Viskosität
η [mPas] Osmolalität [mOsmol/kg]
RI Dichte ρ [g/cm3]
OS σ [mN/m]
pH
Wasser 0.893 0 1.330 0.995 70.49 6.54
GBR 0.825 364 1.332 1.001 58.45 7.32
P-HCl (2%) GBR 0.722 373 1.336 1.004 57.61 6.72
+ BAC 0.01% GBR 0.768 388 1.366 1.005 38.32 6.45
+ EDTA 0.05% GBR 0.746 370 1.345 1.005 55.34 6.66
Die gemessene Osmolalität der Lösungen liegt leicht über dem isotonischen Bereich (290-310 mOsmol/kg), jedoch ist das Auge durchaus in der Lage, schwach hypertonische Lösungen bis etwa 445 mOsmol/kg zu tolerieren [159]. Cowle and Anderson [160] geben ferner an, dass hypertonische Lösungen am unverletzten Auge besser toleriert werden und weniger Schäden bzw. Permeabilitätsänderungen hervorrufen als hypotonische Lösungen.
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Der RI und die Dichte ρ der untersuchten Lösungen stimmen gut mit den für die Tränen-flüssigkeit angegebenen Bereichen überein (RI: 1.336 - 1.357, ρ: 1.004 - 1.005) [161].
Die Oberflächenspannungen aller Lösungen sind gegenüber dem Wasserwert (70.49 mN/m) [162] erniedrigt (Tabelle 7), können aber gut vom Auge vertragen werden, da die Tränen-flüssigkeit selbst oberflächenaktive Verbindungen enthält [30], die Werte zwischen 37-50 mN/m hervorrufen. Die gegenüber dem Wasserwert erniedrigte Oberflächenspannung des GBR-Puffers wird auf das enthaltene Glutathion zurückgeführt, das als Tripeptid (L-γ-Glutamyl-L-cysteinylglycin) tensidische Eigenschaften aufweist. Die weitere Absenkung der Oberflächenspannung in der Lösung, die BAC enthält, ist dem amphiphilen Charakter dieses Konservierungsmittels zuzuschreiben und verbessert die Spreitung auf der Augenoberfläche.
Das Auge ist gegen Abweichungen vom pH-Wert der Tränenflüssigkeit nicht allzu empfind-lich, so dass Lösungen zwischen pH 7-9 reizlos vertragen werden. Auch pH-Werte zwischen 5-10 (ungepuffert) verursachen noch keine deutliche Steigerung des Tränenflusses oder Schä-digung der Gewebe [2], wobei saure Lösungen als weniger verträglich gelten als alkalische.
Die gemessenen Viskositäten werden reizlos vom Auge vertragen.
4.1.2.2 Diclofenac-Natrium-Lösung
Wie schon erwähnt, wurde zur Löslichkeitsverbesserung von D-Na in GBR PG eingesetzt (vgl. 4.1.1.1). Dieses LM findet vor allem in der Dermopharmazie vielfältige Anwendung; es fördert die Emulsionsbildung, wirkt als Weichmacher, Konservierungs- und Feuchthalte-mittel, ferner als LM für etherische Öle und diverse Wirkstoffe bzw. sorgt für deren gute Dispergierung. Laut Fiedler [163] verursacht unverdünntes PG lediglich eine geringe Reizung an der Kaninchenaugenschleimhaut, wobei beachtet werden muss, dass in vorliegender Arbeit das PG mit GBR verdünnt wurde (4.5 : 5.5).
Der Zusatz von PG führte zu einer deutlichen Erhöhung der Viskosität η (25° C) der D-Na-Lösung gegenüber GBR (Tabelle 8), was mit der hohen Eigenviskosität dieses LMs (55 mPas) zu begründen ist [163]. Jedoch liegt der gemessene Wert im Bereich der für die Trä-nenflüssigkeit angegeben Grenzen (1.3 - 5.9 mPas [161] bzw. 1.05 - 1.93 mPas [164]). Eine Erhöhung der Viskosität von wässrigen Augentropfen kann zu einer verlängerten Verweilzeit der Formulierung sowie zur Verringerung der Reizwirkung beitragen [165].
Die gemessene Tonizität in Anwesenheit von PG ist negativ zu beurteilen, da sie deutlich oberhalb der angegebenen Toleranzgrenze [159] liegt und damit die Eigenschaften der oku-laren Gewebe hinsichtlich Penetration und Permeation verändern kann. Hypertone Lösungen weisen wasserentziehende (entquellende) Eigenschaften auf, so dass ein Wasserverlust der Gewebe möglich ist (vgl. 4.1.4). Die Bewegung des Wassers aus dem Gewebe in die prä-corneal applizierte GBR/PG-Zubereitung zum Ausgleich des osmotischen Drucks ist der Arz-neistoffbewegung in das Gewebe entgegen gerichtet. Resultierend könnten Behinderungen der Diffusion von D-Na auftreten. Jedoch musste dieser Kompromiss aus Gründen der ana-lytischen Erfassbarkeit (vgl. 4.2.5) eingegangen werden.
Tabelle 8: Physikalisch-chemische Kenngrößen der wässrigen D-Na-Lösung Wirkstoff Medium Viskosität
η [mPas] Osmolalität
[mOsmol/kg] RI Dichte ρ [g/cm3]
OS σ [mN/m]
pH
GBR 0.825 364 1.332 1.001 58.45 7.32
D-Na (2%) GBR/PG 3.454 2518 1.384 1.037 44.16 9.30 Dichte und RI der Donatorlösung (D-Na in GBR/PG) (Tabelle 8) liegen etwas höher als die für die Tränenflüssigkeit angegebenen Werte (s.v.), wiederum verursacht durch das PG (ρ = 1.0364 g/cm3 und RI = 1.4328) [163].
Die gemessene Oberflächenspannung kann als tolerabel betrachtet werden [30]. Der pH-Wert der 2%igen D-Na-Lösung wurde zur Verwendung bei den Permeationsversuchen von 9.30 mit Hilfe von 0.1N HCl auf pH 7.4 korrigiert.
4.1.2.3 Mycophenolatmofetil- und Mycophenolsäure-Lösung
Die physikalisch-chemischen Kenngrößen der MMF- bzw. MPA-Lösung, die in Permeations-studien als Donatorlösung getestet wurden, sind in Tabelle 9 aufgelistet. Daraus sind keine negativen Auffälligkeiten der bestimmten Parameter ersichtlich, so dass diese Formulierungen bedenkenlos eingesetzt werden können.
Erwartungsgemäß steigen, verursacht durch den Zusatz von 10% HP-β-CD, die Tonizität und Viskosität der Lösungen im Vergleich zu GBR leicht an (Tabelle 9). RI und ρ der untersuchten Lösungen zeigen lediglich geringe Veränderungen, die vom Auge toleriert werden.
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Eine minimale Abnahme der Oberflächenspannung durch den Einsatz von HP-β-CD (Tabelle 9), kann auf die oberflächenaktiven Eigenschaften dieses Hilfsstoffs zurückgeführt werden (hydro-phile äußere Oberfläche und hydrophobe zentrale Kavität) [166]. Auch hier sind die Werte der Oberflächenspannung denen der Tränenflüssigkeit sehr ähnlich (vgl. 2.1.2.1). Die Ausgangs-pH-Werte werden durch Arznei- und Hilfsstoffzusatz kaum verändert.
Tabelle 9: Physikalisch-chemische Kenngrößen wässriger MMF/HP-β-CD- und MPA/HP-β Lösungen
GBR 0.825 364 1.331 1.001 58.45 7.32
MMF (1%*)/
HP-β-CD (10.0%) GBR 0.990 410 1.348 1.035 55.13 7.28 MPA (0.74%)/
HP-β-CD (10.0%) GBR 0.998 397 1.337 1.030 50.91 7.20
*MMF-Ausgangskonzentration; nach Autoklavierung lagen 0.43% MMF und 0.57% MPA vor
4.1.2.4 Verteilungskoeffizienten der Arzneistoffe
Durch die Bestimmung des VK können Aussagen über das Ausmaß der Verteilung eines Stoffs zwischen einer lipophilen, nicht mit Wasser mischbaren Phase (z.B. Octanol) und einer hydro-philen, wässrigen Phase getroffen werden. Dementsprechend sind vergleichende Aussagen über die Polarität und mögliche Auswirkungen auf das Resorptionsverhalten der untersuchten Verbin-dungen möglich.
Tabelle 10 gibt einen Überblick über die VK der in dieser Arbeit verwendeten Arzneistoffe in GBR. Auf die Bestimmung von VK in GBR/PG (D-Na-Zubereitungen) wurde verzichtet, da PG die Mischbarkeit von Octanol mit Wasser bzw. GBR fördert und die Ergebnisse nicht aussagekräftig wären.
Der niedrige VK von P-HClin GBR spricht für den hydrophilen Charakter dieses Arzneistoffs (Tabelle 10), wohingegen die P-Base deutlich lipophiler ist. Zusätzlich muss angemerkt wer-den, dass der VK einer ionischen Verbindung, wie P-HCl, in hohem Maße vom pH-Wert der verwendeten Pufferlösung und dem daraus resultierenden Ionisationsgrad αa abhängig ist.
D-Na weist als Salz eine relativ hohe Lipophilie auf, was der hohe VK in GBR verdeutlicht (Tabelle 10) und zusätzlich durch die relativ schlechte Wasserlöslichkeit (vgl. 4.1.1.1) zum Ausdruck kommt.
Tabelle 10: Verteilungskoeffizienten VK (Octanol/GBR) für die angewendeten Arzneistoffe
Substanz VK
P-HCl (2%) 0.229
P-Base (2%) 1.03
D-Na (2%) 13.46
MMF (0.88%), (RT) 23.41
MPA (0.12%), (RT) 3.73
MMF (0.43%), HP-β-CD (10%)(A) 12.25 MPA (0.57%),HP-β-CD (10%)(A) 0.46 RT=Raumtemperatur, A=autoklaviert
Auch bei MMF ließ sich eine ausgeprägte Lipophilie in Form eines hohen VK in GBR feststellen (Tabelle 10). Vermessen wurde der Überstand einer 1%igen MMF-Suspension in GBR, die bei Raumtemperatur zubereitet wurde bzw. eine 1%ige MMF-Lösung in GBR/HP-β-CD, die unter Autoklavierung hergestellt wurde (vgl. 4.1.1.2). Dabei trat sowohl bei Raum-temperatur als auch beim Erhitzen eine Esterhydrolyse auf, so dass MPA neben MMF vorlag und der VK von beiden Komponenten bestimmt werden musste (Tabelle 10). Durch den Zusatz von 10% HP-β-CD und anschließendes Autoklavieren der Suspension konnte der VK
von MMF um ca. die Hälfte reduziert werden. Es ist anzunehmen, dass der verringerte VK
durch den Einschluss von MMF in die HP-β-CD-Kavität verursacht wird, denn die CDe selbst haben einen niedrigen VK (0.020-0.123) [158] aufgrund ihres hydrophilen Charakters. Bei MPA erfolgte durch den Zusatz von 10% HP-β-CD und anschließendem Autoklavieren der Suspension eine Senkung des VK auf ein Achtel.
Es sei angemerkt, dass CDe in ihre kanalartigen Strukturen auch Octanolmoleküle einschlies-sen können [128], so dass dadurch eine Beeinflussung des VK erfolgen kann.
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4.1.3 Proteinbestimmung von okularen Geweben