ERGEBNISSE UND DISKUSSION
4.1.4 Hydratationsstudien an okularen Geweben .1 Allgemeines
Der Hydratationsgrad der okularen Gewebe spielt insbesondere bei der Cornea eine große Rolle, da das Hornhautstroma nur transparent bleibt, wenn es sich in einem relativ dehydra-tisierten, durch Kollagen, Mucopolysaccharide und Salze bedingten hypertonen Zustand befindet. Dieser kommt in vivo dadurch zustande, dass die Grenzschichten der Hornhaut, nämlich Epithel und Endothel, den Einstrom von Wasser regulieren [173,174,175,176,177, 178].
Abb. 19: Schema der Wasseraufnahme und -abgabe in der Cornea (Endothel = Barriere und Pumpe) [38]
Das fünf- bis sechsschichtige Plattenepithel der Hornhaut ist besonders in seinen äußeren Schichten durch dichte, interzelluläre Verknüpfungen, die Zonulae occludentes, verbunden und bildet eine stabile Schutzschicht [179]. Die Zellen des Endothels sind nicht so lückenlos von Zonulae occludentes umgeben [180,181,182], so dass es nicht nur für Wasser, sondern auch für höher molekulare Substanzen leichter interzellulär passierbar ist [175,183]. Beiden Schichten ist ihre Funktion sowohl als Barriere als auch semipermeable Membran gemein-sam, wobei das Epithel weniger für Wasser, Ionen und andere Substanzen durchlässig ist als das Endothel. Die Wasserdurchlässigkeit ist an der normalen menschlichen Hornhaut für das Endothel 3.4mal größer als für das Epithel [184].
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Unter physiologischen Bedingungen fließen aus dem Kammerwasser kontinuierlich 5 µl/cm2 Flüssigkeit pro Stunde [176] in das Stroma und versorgen auf diese Weise das Gewebe mit Substraten für den Energie- und Baustoffwechsel [185]. Zum Ausgleich wird durch aktiven Bikarbonat-Transport der Endothelzellen kontinuierlich Wasser aus dem Stroma in das Kam-merwasser abgeführt, wobei gleichzeitig Stoffwechselprodukte in das KamKam-merwasser abge-geben werden (Abb. 19).
Sofern die Regulation dieses Wasseraustausches auf der endothelialen Seite versagt, nimmt das Stroma vermehrt Wasser auf, das in Richtung Epithel fließt. Dabei wird die geordnete Struktur der kollagenen Fibrillen verändert (Abb. 20), so dass Lichtstreuung und Hornhaut-trübung die Folge sind.
Abb. 20: Versagen der Endothelfunktion führt zur ungehinderten Flüssigkeitsaufnahme in das Stroma und Epithel [38]
Fließt das Wasser weiter in Richtung Epithel, kommt es wegen dessen geringer Durch-lässigkeit zur subepithelialen und intraepithelialen Wasseransammlung, also dem klinischen Bild der bullösen Keratopathie.
4.1.4.2 Schweinecornea
Die Hydratation von SC spielte bei den Penetrations- und Permeationsstudien dieser Arbeit insofern eine Rolle, da der Quellungszustand des Gewebes einen Einfluss auf den Arzneistoff-transport in und durch das Gewebe hat.
Zur Untersuchung gelangten intakte isolierte Hornhäute (SC), Hornhäute mit 50% Epithel (SC 50%) und ohne Epithel (SCo.E). Die Gewebe wurden jeweils über unterschiedlich lange
Zeiträume in Wasser, GBR oder GBR/PG inkubiert (vgl. 5.2.4), um den Einfluss der Inku-bationsmedien auf die Hydratation der Gewebe zu bestimmen.
Die durchschnittliche Hydratation unbehandelter Hornhäute direkt nach dem Isolieren vom Auge des Schlachttiers betrug 78.86 ± 2.07% und bestätigte damit die in der Literatur ange-gebenen Werte von 75-80% [172]. Frisch isolierte Hornhäute, denen vor dem Exzidieren 50%
des Epithels mit Hilfe eines Excimer-Lasers abladiert wurden (vgl. 5.2.8.2), wiesen eine Hy-dratation von 79.19 ± 0.26% auf. 80.26 ± 0.77% Hydratation zeigten frisch isolierte corneale Gewebe, die einer mechanischen, totalen Epithelabrasio mittels Skalpell unterlagen. Der be-rechnete Wassergehalt betrug zwischen 3.77 und 4.12 mg/mg Gewebe und ist mit den von Doughty [170] gefundenen Werten von 3.62 mg/mg Gewebe vergleichbar.
Zunächst soll der Einfluss unterschiedlicher Epitheldicke auf die Hydratation bzw. Wasser-aufnahme über einen definierten Zeitraum in den drei wässrigen Testmedien diskutiert werden.
In allen drei Inkubationsmedien war nach 5-stündiger Aufbewahrung eine statistisch signifi-kante Veränderung der Hydratation der Hornhäute gegenüber dem Ausgangswert zu verzeich-nen (Abb. 21). Im Medium Wasser steigerte sich die Hydratation aller Gewebe innerhalb der ersten Stunde um ca. 10% (Abb. 21A), gefolgt von einem nur noch minimalen Anstieg (3-5%) bis auf ~ 93% zu Versuchsende. Hierbei spielte es keine wesentliche Rolle, ob das Epithel intakt, zu 50% abladiert oder völlig entfernt war. Allerdings ergab sich lediglich für Hornhäute ohne Epithel eine über den gesamten Zeitraum signifikant erhöhte Hydratation, verglichen mit SC.
Bei Betrachtung des Wassergehaltes und der Wasseraufnahme (Tabelle 11) kann festgestellt werden, dass zu keinem Zeitpunkt ein signifikanter Unterschied zwischen SC und SC 50% im Medium Wasser auftrat, wohl aber zwischen SC und SCo.E. Nach 1, 2 und 5 h wiesen Horn-häute ohne Epithel einen signifikant höheren Wassergehalt auf, und die Wasseraufnahme er-folgte in erhöhtem Ausmaß.
Ein ähnlicher Kurvenverlauf ist für GBR zu beobachten, wobei die Zunahme der Hydratation bis zur ersten Stunde nicht so sprunghaft verläuft (Abb. 21B) wie in Wasser. Hier erfolgt eine mäßige Zunahme der Hydratation um 3-6%. Ähnlich wie bei Wasser als Inkubationsmedium
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unterscheiden sich die Hydratationswerte von SC und SC 50% nur nach 1 h signifikant und weisen danach fast identische Zahlenwerte auf. Ebenfalls wie in Wasser erfolgte in GBR eine signifikant stärkere Hydratisierung der epithelfreien SC im Vergleich zu intakter Hornhaut, ausgenommen nach 5 h.
Abb. 21: Hydratation von Schweinecornea (unbehandelt, 50% Epithel, ohne Epithel) nach Inkubation in Wasser, GBR bzw. GBR/PG, n=4, (*) p<0.05 verglichen mit SC Der Wassergehalt von SC 50% ist in Korrelation zur Hydratation nur nach 1 h signifikant höher als in SC (Tabelle 11). Die Wasseraufnahme ist zu jedem Zeitpunkt geringer, außer nach 4 h, als bei intakter Cornea. Das Fehlen des Epithels bei SCo.E zeigt sich deutlich in einem höheren Wassergehalt zu fast jedem Zeitpunkt, verglichen mit SC, ähnlich wie die Wasseraufnahme, die in allen Fällen signifikant erhöht ist.
Anders gestaltet sich der Kurvenverlauf für das Medium GBR/PG (Abb. 21C). Auch hier ver-ändert sich die Hydratation sowohl der unbehandelten als auch behandelten Hornhäute über den Versuchszeitraum von 5 h signifikant, jedoch ist das Vorzeichen der Änderung negativ, d.h., die Hydratation sinkt im Vergleich zum Ausgangswert. Dabei weisen corneale Gewebe mit nur 50% Epithel die größte Hydratation auf, so dass keine Korrelation mit der Epithel-dicke zu erkennen ist. So wies unbehandelte SC nach 5 h einen Hydratationsgrad von ~ 55%, SC 50% von ~ 69% und SCo.E von ~ 58% auf. SC und SCo.E erreichen nach 1-stündiger
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Inkubation in GBR/PG den niedrigsten Wert (Verringerung des Wassergehalts um ca. die Hälfte). Die Wasseraufnahme (Tabelle 11) hat für SC und SC 50% durchgängig ein negatives Vorzeichen, was bedeutet, dass Wasser dem Gewebe entzogen wird, wofür das PG im Lö-sungsmedium verantwortlich sein dürfte.
Aus Abb. 21 und Tabelle 11 wird deutlich, dass das Epithel bei der Regulierung des Wasser-gehaltes der Cornea, in Abhängigkeit vom kontaktierendem Medium, durchaus eine Rolle spielt. Auch wenn die Reduktion der Epitheldicke um die Hälfte, zumindest unter Einfluss von Wasser und GBR als Inkubationsflüssigkeit, kaum Effekte hervorbrachte, so waren deut-liche Einflüsse auf den Wassergehalt der cornealen Gewebe ohne Epithel zu erfassen, obwohl das Epithel vorrangig als Barriere dient und nicht aktiv an den Transportprozessen des Was-sers beteiligt ist (vgl. 4.1.4).
Im Folgenden sollen die gefundenen Hydratationseffekte der drei Inkubationsmedien auf die cornealen Gewebe (Tabelle 11) vergleichend betrachtet und interpretiert werden.
Auffällig ist die starke Hydratation während der ersten Inkubationsstunde in Wasser, was mit der hypertonen Natur der Cornea gegenüber Wasser erklärbar ist (vgl. 3.1.1). Demnach rufen die Mucopolysaccharide, das Kollagen und vor allem die darin gelösten Salze des Stromas einen osmotischen Druck hervor, der die Wasseraufnahme bewirkt, um einen Konzentrations-ausgleich herbeizuführen. Nach der ersten Stunde verringerte sich die Wasseraufnahme, und damit nahm die Quellung der Hornhäute nur noch geringfügig zu. Zwischen den Inkuba-tionszeiten 3, 4 und 5 h war kein signifikanter Unterschied hinsichtlich des Wassergehaltes mehr feststellbar, unabhängig von der Vorbehandlung des Gewebes.
Die Quellung der Hornhäute in GBR erfolgte dagegen über den gesamten Zeitraum von 5 h in signifikant geringerem Ausmaß (Tabelle 11). GBR wird in isotonisierter Form verwendet, d.h. die Tonizität liegt im physiologischen Bereich der Tränen- bzw. der Gewebeflüssigkeit.
Es wird angenommen, dass die Flüssigkeit des Stromas eine Mischung von Salzen mono- und divalenter Kationen mit einer Osmolalität von ca. 300 mOsmol/kg und einem pH zwischen 6.5 und 8.8 darstellt [186]. Somit sollte GBR keine Wasseraufnahme bzw. -abgabe in das Ge-webe verursachen, besonders da für das natürliche Puffersystem eine Bicarbonat/Kohlen-säure-Basis postuliert wird [187] und damit eine ähnliche Zusammensetzung von GBR (vgl.
5.1.5) und intrastromaler Flüssigkeit gegeben ist [170]. Gefundene Hydratationseffekte,
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1) p>0.05 kennzeichnet Daten, die sich nicht signifikant unterscheiden.
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sonders an SCo.E, lassen sich darauf zurückführen, dass die cornealen Gewebe isoliert vorlie-gen und damit das Endothel seine aktive Funktion als Pumpe und seine passive Funktion als Barriere nicht einwandfrei erfüllen kann. Außerdem fehlen umliegende Gewebe, wie z.B. die Sklera, die ein Eindringen von Wasser über die Seitenränder verhindern.
Tabelle 11: Wassergehalt (WG) und Wasseraufnahme (WA) in [mg/mg Gewebe] von Schweinecornea (1) unbehandelt, (2) 50% Epithel und (3) ohne Epithel nach
Während das im Vergleich zu Puffer hypotone Wasser eine Verdreifachung des Wasserge-haltes im Gewebe nach 5 h verursachte, führte GBR nur zu einer Verdoppelung. Auch in GBR erfolgte die größte Wasseraufnahme innerhalb der ersten Stunde, jedoch verlief die an-schließende Quellung in geringerem Ausmaß. Die Wassergehalte unterscheiden sich nach der ersten Stunde teilweise nicht mehr signifikant.
Wie erwartet, erfolgte in dem Inkubationsmedium GBR/PG eine Entquellung der Hornhäute (Tabelle 11). Ursache ist die deutlich erhöhte Tonizität dieses Mediums (2518 mOsmol/kg), verglichen mit der Gewebeflüssigkeit. Nach 5 h ist der Wassergehalt der Cornea auf die Hälfte (SC 50%) bzw. auf ein Drittel (SC, SCo.E) des Ausgangswertes reduziert. Der größte Teil des Wassers wird den Hornhäuten innerhalb der ersten Stunde entzogen, danach ändert sich der Hydratationsgrad kaum noch. Im Vergleich zum Inkubationsmedium Wasser beträgt der Wassergehalt nach 5 h nur ca. 10-20% und im Vergleich zum Inkubationsmedium GBR ca. 20-30%. Anzumerken ist allerdings, dass die erschwerte Trocknung der in GBR/PG inku-bierten Gewebe eine Fehlerquelle darstellen kann.
Als Fazit dieser Hydratationsstudie erwies sich GBR als am besten geeignetes Versuchs-medium für die nachfolgenden Permeationsstudien, da der Einfluss auf den Wasserhaushalt der cornealen Gewebe am geringsten war. Allgemein werden bevorzugt CO2-gesättigte, bicar-bonathaltige Salzlösungen eingesetzt, um Gewebe nach der Isolierung so lange wie möglich nahe dem physiologischen Niveau zu halten [170].
Wasser als Inkubationsmedium verursachte eine deutlich stärkere Quellung der Hornhäute innerhalb der Versuchszeit von 5 h gegenüber GBR und GBR/PG. Ähnliches fand Doughty [170], der verschiedene Inkubationsmedien testete. Eine 35 mM Bicarbonat-Salzlösung, die mit CO2 abgesättigt war und Glucose enthielt, rief nur eine geringe stromale Quellung hervor (z.B. im Vergleich zu einer physiologischen Salzlösung oder phosphatgepufferten Kochsalz-lösung), während Wasser die deutlich stärkste Gewebequellung im Vergleich mit verschie-denen Puffersystemen verursachte. Innerhalb der Hydratationsstudien dieser Arbeit verrin-gerte GBR/PG die Hydratation um ca. 50-65% und verursachte damit eine Entquellung der Hornhäute.
Aus diesen Untersuchungen ist abzuleiten, dass sowohl Wasser als auch GBR/PG Einfluss auf das Penetrations- und Permeationsverhalten durch diese Gewebe nehmen könnten, da die Hy-dratationsniveaus außerhalb der physiologischen Grenzen liegen (vgl. 4.1.4.1).
4.1.4.3 Schweinesklera
Auch für die Sklera spielt der Hydratationszustand eine Rolle bezüglich des Arzneistoff-transportes durch dieses Gewebe. So berichteten Boubriak et al. [188], dass der
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koeffizient und der VK von Arzneistoffen auf veränderte Hydratation reagieren; beide Koeffi-zienten zeigten größere Werte bei steigender Hydratation.
In der vorliegenden Arbeit wurden die skleralen Gewebe mit den o.g. Inkubationsmedien über den gleichen Zeitraum behandelt wie die Hornhäute (vgl. 4.1.4.2). Die Bestimmung der Para-meter erfolgte ebenfalls in Analogie zu den cornealen Geweben (vgl. 5.2.4).
Die experimentell ermittelte Hydratation von frisch isolierter SS (Referenz), die keiner Inku-bation in einem Medium unterlag, betrug 67.09 ± 1.03%. In der Literatur [188] findet sich eine Angabe von 71.3 ± 3.9% Hydratation (vgl. 3.1.2). Der ermittelte Wassergehalt des Re-ferenzgewebes (2.04 ± 0.10 mg/mg SS) ist ebenfalls mit Literaturangaben (2.6 ± 0.4 mg/mg Gewebe, Kaninchen) [188] und (2.9 ± 0.2 mg/mg Gewebe, Mensch) [189] vergleichbar.
Abb. 22: Hydratation von Schweinesklera nach Inkubation in Wasser, GBR bzw. GBR/PG, n=4, (*) p<0.05 verglichen mit GBR
Die Effekte der verschiedenen Inkubationsmedien auf die Hydratation von SS sind vergleich-bar mit den Ergebnissen, die für corneale Gewebe gefunden wurden (Abb. 22). Im Ergebnis der SS-Studie resultierte über den Versuchszeitraum von 5 h eine signifikante Erhöhung der Hydratation durch Wasser und GBR (Abb. 22). Allerdings war der Effekt von Wasser gerin-ger (ca. 5%) gegenüber SC (ca. 13%), und die Hydratation blieb in physiologischen Grenzen.
Im Gegensatz zu cornealen Geweben differierten jedoch Wasser und GBR nicht; tendenziell verursachte GBR sogar eine stärkere Zunahme der Hydratation. Die Quellung der Gewebe er-folgte hauptsächlich innerhalb der ersten Stunde und blieb dann auf dem gleichen Niveau.
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1) s. S. 58
Nach der Inkubation in GBR/PG weist die Wasseraufnahme in sklerale Gewebe ein negatives Vorzeichen auf, ausgenommen der 5 h-Wert, was einem Wasserentzug aus dem Gewebe ent-spricht. Bei Permeationsuntersuchungen an der Sklera könnte dieses Medium insofern den Arzneistofftransport beeinträchtigen.
Tabelle 12: Wassergehalt (WG) und Wasseraufnahme (WA) in [mg/mg Gewebe] von Schweinesklera nach Inkubation in Wasser, GBR oder GBR/PG
Wasser GBR GBR/PG
t[h] WG WA WG WA WG WA
0 2.04 (0.10)2 02 2.04 (0.10) 0 2.04 (0.10)2 02
1 2.46 (0.25)2 0.37 (0.06)2 2.47 (0.09) 0.50 (0.25) 0.76 (0.07) -0.23 (0.07) 2 2.50 (0.25)2 0.32 (0.08) 2.53 (0.15) 0.53 (0.13) 0.80 (0.02) -0.19 (0.06) 3 2.34 (0.17) 0.34 (0.12) 2.67 (0.23) 0.63 (0.19) 0.76 (0.03) -0.16 (0.03) 4 2.44 (0.14)2 0.29 (0.04) 2.61 (0.15) 0.51 (0.09) 0.76 (0.06) -0.05 (0.05) 5 2.34 (0.12) 0.20 (0.12) 2.55 (0.08) 0.47 (0.24) 0.86 (0.04) 0.02 (0.07) n=4, (1) p>0.051) verglichen mit 0 h, (2) p>0.051) verglichen mit GBR, SD in Klammern In Bezug auf die Hydratation der Sklera scheinen sowohl Wasser als auch GBR als Versuchs-medium geeignet zu sein. In beiden Fällen bleibt die Hydratation während 5 h im physio-logischen Bereich. Nicht auszuschließen ist allerdings ein Verlust an Proteinen durch Wasser.
Darüber wurde zwar bisher nur für corneales Stroma berichtet [170], ist jedoch auch für die Sklera aufgrund der ähnlichen Morphologie denkbar. Doughty [170] fand nach 9-stündiger Inkubation von Rinderstroma in Wasser einen Proteinverlust von 25.7%, während in einem bicarbonathaltigen Puffer, der mit CO2 abgesättigt war, lediglich 2.7%Verlust festgestellt wurden. Unter diesem Gesichtspunkt ist GBR für Untersuchungen an der Sklera der Vorzug zu geben.
4.1.5 Wirkstoffpenetration