ERGEBNISSE UND DISKUSSION
4.3 Zellkulturen .1 Allgemeines
4.3.2 Kaninchencornea-Epithelzellkultur (KCEZ) .1 Bioelektrische Parameter
Ähnlich wie bei isolierter KK (vgl. 4.2.4.4) wurden die Lebensfähigkeit und Integrität der Zellkultur durch die Messung des TEER und der PD (vgl. 5.2.10.3) sowohl vor als auch nach dem Permeationsexperiment und während der Kultivierung überprüft.
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1) s. S. 58
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Die in dieser Studie initial gemessenen TEER- und PD-Werte (Tabelle 26) sind in vergleich-barer Größenordnung bereits veröffentlicht worden [345]. In Tabelle 26 sind sowohl der initiale als auch der finale Messwert dokumentiert, um den Einfluss der verschiedenen Para-meter auf die Lebensfähigkeit und Integrität der Monolayer zu untersuchen. Die Integrität der Zellkultur hat großen Einfluss auf die Permeabilität der Membran, besonders für Arzneistoffe wie P-HCl, die über den parazellulären Diffusionsweg die Kultur passieren. Auffällig war der Anstieg des TEER während des Permeationsexperimentes bei Formulierungsparametern, die keine Schädigung der Monolayer hervorriefen, wie z.B. eine Variation des pH-Werts (Tabelle 26). BR (pH 7.4, vgl. 5.1.5) scheint über die Dauer des Experimentes zellverdichtend auf die Kultur zu wirken. Der Einfluss der verschiedenen Parameter auf die Integrität der Monolayer wird im Zusammenhang mit den Ergebnissen der Permeationsstudie diskutiert.
Tabelle 26: Bioelektrische Parameter der cornealen Zellkultur
Basiszube-reitung Formulierungs-parameter
TEER (initial)
[kΩcm2] TEER [kΩcm(final)2] PD[mV](initial) PD[mV](final) Referenz 2.30 (0.42) 2.71 (0.63) 19.45 (2.32) 9.48 (3.93) BAC 0.005% 2.15 (0.51) 2.50 (1.04)* 16.78 (5.16) 4.92 (2.27) BAC 0.01% 2.32 (0.43) 0.39 (0.08) 19.62 (3.36) 1.26 (2.00) EDTA 0.025% 2.17 (0.22) 2.73 (0.28) 11.62 (1.35) 26.70 (7.17) EDTA 0.05% 2.36 (0.57) 2.13 (0.82)* 17.45 (5.28) 5.03 (3.93)
EDTA 0.05% 1.83 (0.57) 0.23 (0.05) 13.90 (6.72) 0.50 (0.67) pH 6.4 2.69 (0.31) 2.92 (0.28)* 19.04 (3.43) 51.75 (5.79) P-HCl 2%,
300
mOsmol/kg pH 8.4 2.75 (0.27) 2.75 (0.33)* 25.25 (1.89) 31.76 (6.04) 80 mOsmol/kg 2.36 (0.20) 1.44 (0.38) 16.25 (1.28) 0.20 P-HCl 2%,
pH 7.4 600 mOsmol/kg 2.26 (0.19) 1.85 (0.18) 13.67 (1.16) 11.25 (4.57)* n=5-8, (*) p>0.051) verglichen mit dem jeweiligen initialen Wert, SD in Klammern
4.3.2.2 Permeationsstudie
Abb. 47 gibt einen Überblick über den Einfluss unterschiedlicher Formulierungsparameter auf den Peff der P-HCl-Lösung unter Einbeziehung des finalen TEER, der Aussagen über die Dichtigkeit der Monolayer zulässt. Dabei wurde für die Zellkulturen eine indirekte Propor-tionalität zwischen TEER und Peff festgestellt (Abb. 47). Die Addition von 0.005% BAC zur
P-HCl-Lösung führte zu keiner signifikanten Steigerung des Peff, verglichen mit der Referenz-lösung, während ein Zusatz von 0.01% BAC einen ca. 4fach erhöhten Peff zur Folge hatte.
Tabelle 26 belegt, dass 0.01% BAC den TEER drastisch minimiert, was auf eine Auflok-kerung der Monolayer hindeutet und die erhöhte Permeabilität begründet. Chang et al. [346]
bewiesen, dass BAC konzentrationsabhängig Lecks in der Membran von kultivierten cor-nealen Epithelzellen verursacht. Diese Lecks in den einzelnen Membranen wirken sich nega-tiv auf die Integrität des gesamten Zellverbandes aus.
Weder ein Zusatz von 0.025% noch 0.05% EDTA konnte die P-HCl-Konzentration auf der Akzeptorseite erhöhen (Tabelle 27). Dies wiederum korreliert mit den dazugehörigen TEER-Werten, die sich während des Experimentes nicht signifikant veränderten. Meyer and Mc Culley [347] untersuchten den Effekt von Chelatoren auf die pH-Toleranz von cornealer Epithelzellkultur. Die Addition von 0.05% bzw. 0.1% EDTA zu einer physiologischen Salz-lösung (pH 7.5) verursachte keine Veränderungen der Zellkultur hinsichtlich Gewebeverlust bzw. Verletzungen des Gewebes, und die Formulierungen wurden als nicht-toxisch eingestuft.
Dieses Ergebnis steht im Einklang mit den Resultaten dieser Arbeit, wonach EDTA ebenfalls keinen erfassbaren Einfluss auf die KCEZ ausübte (Tabelle 26).
Eine Kombination aus 0.01% BAC und 0.05% EDTA verursachte die markanteste Störung der Integrität der Monolayer (Tabelle 26), verbunden mit einer ca. 5.3fach erhöhten Permea-bilität der Zellkultur gegenüber der Referenz (Abb. 47). Der Unterschied des Peff zur Zuberei-tung mit 0.01% BAC ohne EDTA ist jedoch nicht signifikant, so dass EDTA vermutlich nicht zu einer weiteren Erhöhung der P-HCl-Passage führt. Nach Literaturhinweisen ist es sogar möglich, dass EDTA die Biotoleranz von BAC erhöht [347] und dadurch die Membran-stabilität fördert. Dafür geben die vorliegenden Befunde allerdings keinen Hinweis.
Ein weiterer getesteter Formulierungsparameter war der pH-Wert der P-HCl-Lösung. Mit zunehmendem pH wurde ein Ansteigen des Peff durch KCEZ beobachtet (Abb. 47). Pilocarpin gehört zur Gruppe der ionisierbaren Stoffe mit basischen Eigenschaften (pKa1=6.85). Da die Cornea leichter für lipidlösliche Substanzen passierbar ist als für wasserlösliche, kann die nicht-ionisierte (lipidlöslichere) Form des Arzneistoffs das Gewebe leichter passieren als die ionisierte (wasserlöslichere) Form [63]. Der log VK von Pilocarpin steigt von –0.22 (pH 6.6) auf 0.46 (pH 7.65) [203], was auf eine direkte Proportionalität zwischen dem pH der Arzneistofflösung, der Konzentration an nicht-ionisiertem Arzneistoff und der Lipophilie des
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Arzneistoffs hinweist. Gemäss der Henderson-Hasselbalch-Gleichung liegen bei einem pH von 6.4 26.2% Pilocarpin in nicht-ionisierter Form vor, während sich 78% bei pH 7.4 bzw.
97.3% bei pH 8.4 als undissoziierter Anteil berechnen.
Abb. 47: Peff (Kolumne) durch corneale Epithelzellkultur und TEER (final) (Punkt), n=5-8, (*) p<0.05 verglichen mit Referenz (P-HCl 2%, pH 7.4, 300 mOsmol/kg)
Interessanterweise wurde eine Korrelation zwischen der sinkenden P-HCl-Permeation und der donatorseitig ansteigenden Tonizität der Arzneistofflösung festgestellt (Abb. 47) (80>300>600 mOsmol/kg). Eine Tonizität unterhalb des physiologischen Niveaus wurde schlecht von KCEZ toleriert, was durch eine signifikante Senkung des TEER nach dem Transportexperiment, verglichen zum TEER vor dem Versuch, angezeigt wird (Tabelle 26).
Daraus resultierte eine messbar erhöhte P-HCl-Konzentration im Akzeptormedium trotz des höheren osmotischen Drucks in der basolateralen Flüssigkeit, der mit einem Fluss von Mole-külen in Richtung Donatorkammer einhergeht.
Die Wirkstoffpenetration in bzw. -permeation durch Corneaepithel wurde durch eine Osmo-lalität der Donatorlösung von 80 mOsmol/kg tendenziell gesteigert, verglichen mit einer iso-tonen Lösung von 300 mOsmol/kg (Abb. 47). Eine Erhöhung der Tonizität der applizierten Tropfen (600 mOsmol/kg) führte, wie in der Studie dieser Arbeit (Abb. 47), zu einer Senkung der Arzneistoffaufnahme und nachfolgenden Permeation. Obwohl Lee und Lee [278] einen signifikant erniedrigten finalen TEER nach der Permeation von Atenolol aus einer Lösung von 600 mOsmol/kg, verglichen mit dem initialen Widerstand, fanden, resultierte auch in ihrem Zellkulturversuch ein Peff der gegenüber einer Atenolol-Lösung von 300 mOsmol/kg gesenkt war. Wahrscheinlich konkurrieren die Pufferelektrolyte und P-HCl um den parazel-lulären Weg, die Zellkultur zu passieren, um den Konzentrationsgradienten zwischen Dona-tor- und Akzeptorlösung auszugleichen. Podder et al. [283] untersuchten in vivo die Aufnah-me von Timolol in verschiedene okulare Gewebe des Kaninchens nach topischer Applikation in Abhängigkeit von verschiedenen Formulierungsparametern und kamen zum gleichen Er-gebnis.
Tabelle 27: Permeationsparameter von P-HCl aus BR durch corneale Epithelzellkultur
Basiszube-reitung Formulierungsparameter Peff
[10-6 cm/s] log Peff Q240
[µg]
Referenz 2.19 (0.47) -5.66 30.56 (6.55)
BAC 0.005% 3.36 (0.92) -5.47 48.12 (14.31) BAC 0.01% 8.62 (1.64)* -5.06 120.96 (24.39)* EDTA 0.025% 2.22 (0.17) -5.65 31.22 (2.16) EDTA 0.05% 2.03 (0.23) -5.69 29.06 (4.25) P-HCl 2%,
pH 7.4, 300
mOsmol/kg
BAC 0.01% + EDTA 0.05% 11.51 (2.76)* -4.94 162.50 (40.31)*
pH 6.4 1.37 (0.18) -5.86 19.58 (2.49)
P-HCl 2%, 300
mOsmol/kg pH 8.4 2.62 (0.21) -5.58 38.25 (2.80)
80 mOsmol/kg 2.84 (0.21) -5.55 39.80 (3.72) P-HCl 2%,
pH 7.4 600 mOsmol/kg 1.70 (0.11) -5.77 23.48 (1.36) n=5-8, (*) p<0.05 verglichen mit Referenz, SD in Klammern
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Die bioelektrischen Parameter von KKEZ, gemessen in dieser Studie (Tabelle 28), stimmen gut mit bereits veröffentlichten Daten überein [206,258,348]. Wie bei KCEZ wird der Ein-fluss der Formulierungsparameter auf die Integrität der Monolayer im Zusammenhang mit den Ergebnissen der Permeationsstudie diskutiert.
Tabelle 28: Bioelektrische Parameter der konjunktivalen Zellkultur Referenz 0.66 (0.21) 0.22 (0.11) 7.78 (4.29) 0.50 (0.01) BAC 0.005% 0.85 (0.21) 0.01 9.60 (3.78) 0.78 (0.64) BAC 0.01% 0.69 (0.13) 0.02 10.63 (2.55) 0.32 (0.28) EDTA 0.025% 0.78 (0.56) 0.01 8.79 (1.64) 0.51 (0.05) EDTA 0.05% 0.46 (0.25) 0.03 8.69 (2.30) 0.31 (0.01) P-HCl 2%,
pH 7.4, 300
mOsmol/kg
BAC 0.01% +
EDTA 0.05% 0.91 (0.34) 0.01 11.74 (3.51) 1.03 (0.58) pH 6.4 0.90 (0.44) 0.68 (0.24)* 8.69 (4.50) 16.78 (3.81) P-HCl 2%,
300
mOsmol/kg pH 8.4 0.76 (0.20) 0.75 (0.10)* 10.11 (2.51) 15.31 (2.49) 80 mOsmol/kg 0.76 (0.19) 0.31 (0.14) 9.55 (0.11) 0.20 P-HCl 2%,
pH 7.4 600 mOsmol/kg 0.85 (0.41) 0.44 (0.31)* 10.55 (0.73) 9.39 (0.64)* n=3-6, (*) p>0.051) verglichen mit dem jeweiligen initialen Wert, SD in Klammern
4.3.3.2 Permeationsstudie
Deutlich höhere Peff für die P-HCl-Permeation durch KKEZ (Tabelle 29) im Vergleich zu KCEZ (Tabelle 27), weisen auf eine geringer ausgeprägte Barrierefunktion von KKEZ hin.
Dieses Ergebnis steht im Zusammenhang mit den unterschiedlichen TEER-Werten der Zell-kulturen (Tabellen 26 und 28) und korreliert mit den jeweiligen Geweben in vivo. Klyce und Crosson [253] berichteten über einen Widerstand von 15 kΩcm2 an Kaninchencornea,