Kritik der Methoden

Für den Versuch standen 16 Traber zur Verfügung, von denen 15 zu Versuchsbeginn 2 - jährig und z.T. genetisch eng verwandt waren, sowie aus gleichen Aufzuchtsverhältnissen stammten. Pferd 11 war 7 - jährig und wurde als Ersatztier für den Versuch eingesetzt. In Studien (LEPAGE et al. 1990, PRICE et al. 1995a, OKUMURA et al. 1997, TODHUNTER et al. 1997, LEPAGE et al. 1998, BLACK et al. 1999, CHIAPPE et al. 1999, FLETCHER et al. 2000, MISUMI et al. 2002) wurde eine Altersabhängigkeit für verschiedene Marker nachgewiesen, daher ist die Verwendung einer alters- und rassemäßig weitgehend homogenen Versuchsgruppe von Vorteil. Jedoch müssen die Werte des Pferdes 11 im Zusammenhang mit dem höheren Alter dieses Pferdes betrachtet werden.

Für die Analytik der Ruhewerte und der Stufentests standen 12 bzw. 13 Pferde zur Verfügung, für den Versuch der postprandialen Kinetik 12 Tiere. In die Auswertung des Knorpelmarkers konnten die Ergebnisse von 10 Pferden eingehen. Diese Tierzahlen erscheinen im Rahmen eines standardisierten Versuchs angemessen und erlauben eine statistische Auswertung.

Während der gesamten Versuchsphase wurden alle Tiere unter identischen und unveränderten Bedingungen (Einzelboxen mit Stroheinstreu) gehalten, was für die Veränderungen der Knorpel- und Knochenmarker eine Rolle spielt (MÄENPÄÄ et al. 1988, HOEKSTRA et al. 1998, BELL et al. 2001). Außerhalb der Trainingsbelastungen hatten alle Tiere täglich für ca. 3 Stunden Zugang zu einem ca. 10 x 10 m großen Sandauslauf, die Beeinflussung dieses zusätzlichen Bewegungsreizes ist somit für alle Tiere einheitlich.

Die Fütterung aller Tiere erfolgte 3 mal täglich zu festen Uhrzeiten mit dem gleichen Kraftfutter und Heu einer Charge. Die Mengen wurden an das Körpergewicht und die Arbeitsintensität individuell angepasst und umfassten 5 - 6 kg Heu und 3 - 4 kg Kraftfutter; Sojaextraktionsschrot, Sojaöl und das Vit. E/Selen - Präparat wurde in gleichen Mengen gefüttert. Dies spielt insofern eine Rolle, als dass die Fütterung, speziell die Gehalte von Rohprotein, Calcium und anorganischen Phosphat, Einfluss auf die Konzentration von Knorpel- und Knochenmarkern haben kann (LENSING 1998, MANSELL et al. 1999, PORR et al. 2000, MICHAEL et al. 2001). Es bestehen zwar daher bezüglich der Fütterung Unterschiede in der Aufnahme an Energie, Protein und der Mengen- und Spurenelemente, jedoch sind die Variationen gering (s. Tab. 3.2. bis 3.8.).

Im Versuch wurde mit einer Versuchsgruppe (supplementiert mit 60 g Gelatine - Hydrolysat / Tag / Pferd) und einer Kontrollgruppe (unsupplementiert) gearbeitet, die Zuteilung in die Gruppen erfolgte per Losverfahren, um eine subjektive Zuteilung seitens des Untersuchers auszuschließen.

Von Vorteil wäre die Durchführung des Versuches als Doppelblindstudie gewesen, die als Untersuchungsmethode der Wahl in zukünftigen Studien berücksichtigt werden sollte. Ein Einfluss einer gleichzeitigen Supplementierung von L-Carnitin (NIEMEYER, Diss. in Vorbereitung) auf den Fett- und Energiestoffwechsel und damit auch auf die Laktatwerte kann durch eine gleichmäßige Gruppenzuteilung ausgeschlossen werden, d.h., in der Gelatine- und Kontrollgruppe waren identische Anzahlen an Pferden, die entweder Carnitin A oder Carnitin B erhielten. Zudem zeigten sich bezogen auf die Entwicklung der Laktatwerte keine Effekte einer L-Carntinsupplementierung (NIEMEYER, Diss. in Vorbereitung).

Insgesamt überstieg die Proteinversorgung in beiden Gruppen deutlich den Bedarf, die Supplementierung von 60 g Gelatine - Hydrolysat/Tag für die Versuchsgruppe erbrachte daher nur eine geringe prozentuale Erhöhung des Einweißanteils, insbesondere im Bezug auf essentielle Aminosäuren.

Die Blutentnahmen zur Bestimmung der langfristigen Effekte fanden immer an Ruhetagen 2 h nach der morgendlichen Fütterung (Heu, Kraftfutter, Sojaextraktionsschrot, Sojaöl, ggf. Gelatine - Hydrolysatzulage) statt. An Versuchstagen mit Stufenbelastungstests wurde ebenfalls 2 h nach der morgendlichen Fütterung Blut entnommen, jedoch wurde an diesen Tagen vor der Belastung kein Heu gefüttert, was gegebenenfalls die Ca- und P- Werte modifiziert und Einfluss auf die Ergebnisse der Aminosäuren gehabt haben könnte. An Versuchstagen zur postprandialen Kinetik erfolgte die Fütterung ebenfalls ohne Heu.

Beide Versuchsgruppen absolvierten ein identisches Trainingsprogramm. Als Nachteil anzusehen ist die Tatsache, dass es in diesem Versuch keine gleichaltrige Gruppe ohne Belastung gab, die während des Versuchs unter gleichen Bedingungen gehalten wurde, vor allem, da die Veränderungen am Skelettsystem beim Pferd zwischen dem 1. und 3. Lebensjahr am ausgeprägtesten sind (LEPAGE et al. 1990, PRICE et al. 1995a). Dies erschwert die Einordnung der Ergebnisse als alters- bzw. wachstumsbedingte Veränderungen oder als trainingsbedingte Anpassung. Jedoch sind auch in der Literatur verschiedene Studien zu finden, die nur mit einer Trainingsgruppe und ohne Kontrollgruppe gearbeitet haben (NIELSEN et al. 1997, FLETCHER et al. 2000).

Aufgrund fehlender Stallkapazitäten mussten die Versuchstiere in 3 aufeinanderfolgenden Durchgängen von jeweils ca. 6 Monaten Dauer eingestallt werden. Versuchsdurchlauf 1 und 3 fanden von Januar bis Juni in 2 aufeinanderfolgenden Jahren statt, Versuchsdurchlauf 2 von Juni bis Dezember. Ein saisonaler Einfluss auf die Konzentrationen der Marker ist dabei nicht auszuschließen (PRICE et al. 1997, 2001).

1.2. Versuchsdurchführung

Alle Belastungen wurden auf einem Laufband absolviert, was im Gegensatz zu Feldversuchen eine gute Vergleichbarkeit und eine hohe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse ermöglicht und zudem störende Umwelteinflüsse und variierende Bodenverhältnisse ausschaltet. Das Laufband befand sich in einem überdachten, einseitig offenen Innenhof, die Beeinflussungen durch Außentemperatur und Luftfeuchtigkeit wurden in die Auswertung als Kovariablen aufgenommen und entsprechend berücksichtigt.

Die Eingewöhnungsphase von 4 - 6 Wochen, in der die Pferde an die Arbeit auf dem Laufband und den Umgang gewöhnt wurden, war für alle Tiere identisch. In diese Phase fand die Adaptation des Knorpel- und Knochenstoffwechsels auf die Umstellung von Weide- auf Stallhaltung statt. Wichtig war, dass diese Veränderungen vor Versuchsbeginn abgeschlossen waren, um Überlagerungen eines Trainings- und Behandlungseffekts mit Haltungseffekten auszuschließen. Nach Mc CARTHY und JEFFCOTT (1992) sind jedoch mindestens 2 Monate bei unveränderten Haltungsbedingungen nötig, um ein Steady - State des Knochenstoffwechsels zu erhalten. Gegebenenfalls war diese Phase also zu kurz gewählt.

Vor Beginn der Supplementierung des Gelatine - Hydrolysats erfolgte ein standardisierter Stufentest auf einem Hochgeschwindigkeitslaufband. Um Entwicklungen der Marker und Trainingseffekte beurteilen zu können, erfolgte jeweils nach Beendigung beider Trainingsperioden ein weiterer Stufentest. Der Aufbau des Trainingsprogramms lehnt sich im allgemeinen an die Trainingsbedingungen für junge Vollblüter an, die Trainingsbelastungen setzten sich zusammen aus alternierend durchgeführten Intervall- und Ausdauerbelastungen, zwischen denen jeweils ein Ruhetag lag. Diese Form des Trainings erbringt einen ausreichenden Trainingseffekt, da sowohl der

ermittelten Laktatwerte bestimmt. Dabei wurde nach dem ersten und zweiten Stufentest individuell für jedes Pferd anhand der Laktatwerte eine Trainingsgeschwindigkeit ermittelt, bei der rechnerisch 1,5 bzw. 2 mmol Laktat/l Blut in der Ausdauerbelastung und 9 bzw. 10 mmol Laktat/l Blut in der Intervallbelastung erreicht wurde. Auf dieser Grundlage wurden die Pferde nach ihrem individuellen Leistungsvermögen optimal so trainiert, dass jedes Pferd einen Trainingseffekt erzielen konnte und dennoch eine Vergleichbarkeit der Pferde untereinander gewährleistet war, obwohl sich die Tiere auf einem z.T. sehr unterschiedlichen Trainingsniveau befanden.

Um einen Trainingseffekt auch in der 2. Trainingsperiode zu provozieren, hätten die Trainingsgeschwindigkeiten nach dem 2. Stufentest anhand der individuell ermittelten Laktatwerte angepasst werden müssen. Dabei wären die errechneten Geschwindigkeiten nach dem 2. Stufentest zu hoch ausgefallen, so dass zu befürchten war, dass vermehrt Lahmheiten und Ausfälle durch eine Überbelastung auftreten würden. Daher wurden die Trainingsgeschwindigkeiten für die 2.

Trainingsperiode nicht anhand der ermittelten aktuellen Laktatwerte aus dem 2. Stufentest gewählt, sondern die Geschwindigkeiten der ersten Trainingsperiode für jedes Pferd sowohl in der Ausdauer- als auch in der Intervallbelastung um 0,5 m/s erhöht (Tabelle 5.1.). Diese Steigerung war frei gewählt und versucht, einen Kompromiss zu schließen zwischen dem Anspruch, die Belastung weit genug zu erhöhen, um erneut einen Trainingsreiz zu setzen, und der Vermeidung von Überbelastungen und Ausfällen durch eine zu große Steigerung der Belastung. Zwischen dem 2.

und 3. Stufentest waren in der Laktatentwicklung keine weiteren Unterschiede festzustellen, wodurch sich andeutet, dass die Trainingsanpassung eventuell zu gering ausgefallen ist. Jedoch ist aus der Literatur bekannt, dass die größten Trainingseffekte in den ersten 4 - 6 Wochen nach Trainingsbeginn auftreten, daher war eventuell in der 2. Trainingsperiode unabhängig von der Höhe der Trainingsanpassung keine große Leistungssteigerung zu erwarten.

Alle Belastungen erfolgten bei 3 % Steigung des Laufbandes, um während der Trainingsarbeit das Gewicht vermehrt auf die Hinterhand zu bringen und die Vorhand zu entlasten. Dadurch sollte einem gehäuften Auftreten von Vorhandlahmheiten entgegengewirkt werden. Dennoch waren auftretende Lahmheiten zu gleichen Anteilen Vor- und Hinterhandlahmheiten, deren Ursachen nicht in jedem Fall klar waren.

Aus der Gelatinegruppe schieden 3 Pferde aus: Pferd 4 zog sich einen Sehnenschaden im Auslauf zu, bei Pferd 1 konnte für dessen Lahmheit keine Ursache gefunden werden, beide Tiere wurden nach der Hälfte der 1. Trainingsperiode aus dem Versuch genommen. Bei Pferd 15 war die Lahmheit auf eine zu dünne Sohle, wahrscheinlich hervorgerufen durch den Abrieb auf dem Laufband, zurückzuführen, dieses Tier benötigte einen Beschlag und schied daher nach dem 2.

Stufentest aus. Aus der Kontrollgruppe wurde Pferd 16 nach der Hälfte der 1. Trainingsperiode aufgrund einer Thrombophlebitis aus dem Versuch genommen. Pferd 2 und 14 waren über einen Zeitraum von ca. 2 Wochen lahm, ein Einfluss des Trainings kann nicht ausgeschlossen werden.

Pferd 7, ein Pferd der Kontrollgruppe, verletzte sich dagegen im Auslauf und fiel für 2 Wochen aus, alle drei Pferde konnten nach Ausheilung wieder in den Versuch einbezogen werden. Es kann dagegen nicht ausgeschlossen werden, dass diese Ruhephasen keinen Einfluss auf die Marker - Konzentrationen hatten, zumal die Untersuchungszeitpunkte z.T. in diese Phasen fielen.

Bei der Beurteilung der Langzeitentwicklung der Parameter wurden die Ruhewerte herangezogen, die an Ruhetagen 2 Stunden nach der Fütterung ermittelt wurden. Da die Tiere am Vortag trainiert wurden, ist die Möglichkeit der Beeinflussung der Parameter durch vorangegangene Belastung nicht auszuschließen. Die Ergebnisse von WEDEMEYER (2000) zeigen, dass noch 24 h nach verschiedenen Belastungen erniedrigte Werte der Knochenmarker vorliegen. Jedoch ist dieser Einfluss bei allen Pferden und zu jedem Blutentnahmetag gleich, so dass die Entwicklungen der Parameter vergleichbar bleiben.

Vor der Ermittlung der postprandialen Kinetik lagen mindestens 2 Ruhetage. Der Versuch wurde bei allen Tieren zur gleichen Uhrzeit begonnen und unter identischen Bedingungen durchgeführt.

Die Tiere waren dabei sowohl natürlichem als auch zusätzlich künstlichem Licht ausgesetzt, wobei allerdings keine Taglicht - Vollspektrum - Leuchtstoffröhren genutzt wurden. Es bestand freier Zugang zu Wasser, jedoch wurde während der Versuchsphase nicht gefüttert, so dass weitere Einflüsse auszuschließen sind.

Die vorliegende Trainingsstudie umfasst insgesamt einen Zeitraum von 10 Wochen, der für die Beurteilung von Langzeiteffekten ausreichend erscheint.

1.3. Auswahl der Untersuchungsparameter

Knochenmarker erlauben zwar eine dynamische Einsicht in die Vorgänge des Knochenstoffwechsels und erlauben die Beobachtung von Veränderungen über einen gewissen Zeitraum, sie liefern jedoch keinerlei Informationen zur Knochenmasse, Knochendichte oder Knochenarchitektur. Statische Knochenmasse und dynamischer Knochenumsatz sind nach SEIBEL et al. (1993) zwei komplementäre Größen, die sich in der Beurteilung ergänzen und gemeinsam bestimmt werden sollten. Es wäre daher wünschenswert gewesen, mit Hilfe von bildgebenden Verfahren Informationen über die Knochendichte und - struktur zu gewinnen. Diagnostische Mittel dieser Art standen jedoch im Rahmen dieser Studie nicht zur Verfügung.

Zudem besteht eine große Variabilität zwischen einzelnen Individuen und bezüglich der Beziehung zwischen der Knochenmarker - Konzentration und der Rasse, dem Alter, dem Körpergewicht und der Jahreszeit, so dass eine Einzelmessung wenig Wert für ein Monitoring von Knochenmarkeraktivitäten hat, sondern eine Serie von Messungen über einen gewissen Zeitraum notwendig sind (PRICE 1998, LEPAGE et al. 2001, PRICE et al. 2001). Im Rahmen dieser Studie erfolgte die Messung kontinuierlich im Abstand von 1 - 2 Wochen.

Die Bestimmung aller Parameter erfolgte im Blut. Wünschenswert wäre ein Versuchsdesign gewesen, das zusätzlich eine Analyse der Knorpelmarker in der Synovia ermöglicht hätte.

1.3.1. Osteocalcin

Bei der Auswahl von Osteocalcin als Marker der Knochenformation lagen vor allem die Untersuchungen von RISTELI und RISTELI (1993) und SEIBEL et al. (1993) zugrunde. Nach CHRISTENSON (1997) ist es jedoch noch nicht ganz geklärt, ob Osteocalcin ein Marker der Osteoblasten - Aktivität ist oder eher ein Indikator für den Knochenstoffwechsel und die Umsatzrate, denn Osteocalcin, das im Blut zirkuliert, kann sowohl während der Formation von den Osteoblasten neu synthetisiert, als auch aus dem Knochen während der Resorption freigesetzt worden sein. HINEY et al. (2000) nehmen an, dass Osteocalcin als Marker der Knochenformation und der Mineralisation fungiert. Zudem soll Osteocalcin aber nicht nur in der Knochenformation, sondern auch in der Regulation und Rekrutierung von Osteoklasten eine Rolle spielen und damit auch die Knochenresorption beeinflussen. Die Osteocalcin - Synthese steigt unter Einfluss von PTH, das die Knochenresorption und die Calcium - Freisetzung fördert. PTH hat demnach beim Pferd sowohl formative als auch resorptive Einflüsse. Daher scheint Osteocalcin ein Indikator für

eine gesteigerte Gesamt - Knochenstoffwechselrate zu sein und auch eine Rolle sowohl in der Knochenresorption als auch in der Knochenmineralisation zu spielen.

In dieser Studie wurde Osteocalcin mittels eines Enzymimmunoassays nachgewiesen, der nur intaktes OC erfasst. HOPE et al. (1993) validierten auch einen Radioimmunoassay für das Pferd, jedoch bewiesen HOYT und SICILIANO (1999), dass der ELISA dem RIA hinsichtlich Sensitivität und Reproduzierbarkeit überlegen ist.

1.3.2. ICTP

Als Marker der Knochenresorption wurde ICTP gewählt, ein Abbauprodukt aus dem Stoffwechsel des Kollagen - Typ I. Dieser Kollagen - Typ kommt nur im Knochen vor, daher gilt ICTP als spezifischer Marker des Knochenabbaus (ERIKSEN et al. 1993, RISTELI u. RISTELI 1993, KENT 1997). ICTP wird dabei über den Abbau von Kollagen - Typ I durch Osteoklasten freigesetzt und kann im Blut nachgewiesen werden.

Im Rahmen dieser Studie wurde für die Bestimmung der ICTP - Konzentrationen im Plasma ein kommerziell erhältlicher Radioimmunoassay genutzt.

1.3.3. Keratansulfat

Keratansulfat ist ein Glykosaminoglykan, das hauptsächlich im Gelenkknorpel zu finden ist, jedoch tritt es auch in der Cornea, Trachea, den Zwischenwirbelscheiben und dem lockerem Bindegewebe auf. Die Konzentration des KS steigt bei einer Degradation der Matrix des Knorpels an, daher wird KS als Marker der Knorpeldegeneration eingestuft (ALWAN et al. 1990, RATCLIFFE et al. 1992, FRISBIE et al. 1999, OKUMURA et al. 2000). Dabei dient KS der Diagnostik von frühen Knorpelveränderungen, bevor erste klinische Symptome einer Osteoarthritis sichtbar werden. Die Messung von KS im Blut ist beim Pferd bereits etabliert (THONAR 2005, persönliche Mitteilung).