III. MATERIAL UND METHODEN
7. Analyse der hämatologischen Parameter
Die Tabellen 3.14. bis 3.16. geben eine Übersicht über die analysierten Parameter, ihre Untersuchungsmethode, ihr Untersuchungssubstrat und die Zeitpunkte, an denen die Untersuchung erfolgte.
7.1. Laktat
Die quantitative Bestimmung der Laktatkonzentration erfolgte aus Li-Heparin-Vollblut. Dazu diente ein Accusport- Gerät (Fa. Boehringer Mannheim), Die Verwendbarkeit dieses ursprünglich für den Humanbereich entwickelten Gerätes wurde in den Untersuchungen von EVANS und GOLLAND (1996), LINDNER (1996) und WILLIAMSON et al. (1996) bereits untersucht und die
Übertragbarkeit auf das Pferd bestätigt. Weitere Validierungen zur Wiederholbarkeit wurden nicht vorgenommen.
Das Messsystem besteht aus einem Reflexionsphotometer und den zugehörigen Teststreifen mit dem im Testfeld aufgebrachten Enzymsystem. Laut Angabe des Herstellers ist das Gerät für die Bestimmung der Laktatkonzentration zwischen 0,8 und 26 mmol/l geeignet.
Zur Bestimmung des Laktatgehaltes in der Probe wurden 40 µl heparinisiertes Vollblut auf das Testfeld des Trägerstreifens aufgebracht und der Streifen in das Gerät eingeführt. Durch ein auf dem Testfeld aufgebrachtes Trennvlies wurden die Erythrozyten zurückgehalten und das Plasma konnte in die Reaktionsschicht diffundieren. Hier oxidiert die spezifische Laktatoxidase das im Plasma enthaltene Laktat zu Pyruvat und Wasserstoffperoxid. Letzteres oxidiert in Gegenwart einer Peroxidase das im Testfeld enthaltene Chromogen Molybdänblau in eine gefärbte Verbindung.
Nach 60 Sekunden misst das Reflexionsphotometer die Verfärbung des Testfeldes und errechnet den Laktatgehalt. Mittels eines geräteinternen Algorithmus wird der im Plasmakompartiment ermittelte Gehalt auf Vollblut umgerechnet und im Display in mmol/l angezeigt.
7.2. Gesamteiweiß
Zur Bestimmung des Gesamteiweißes wurde heparinisiertes Vollblut bei 3500 g für 10 min abzentrifugiert und anschließend refraktiometrisch der totale Plasma-Proteingehalt bestimmt. Dazu diente ein Handrefraktometer. 20 - 40 µl der Plasmaproben wurden auf das Sichtfenster pipettiert, nach Anpassung des Gerätes an die Umgebungstemperatur konnte der Gesamtproteingehalt in g/dl abgelesen werden.
7.3. Gesamtcalcium
Die Bestimmung des Gesamtcalciums erfolgte aus Li-Heparin-Plasma mittels Atomabsorptions-Spektralphotometrie (AAS, Unicam Solar 969, Fa. Unicam, Offenbach, Deutschland). Die AAS ist ein spezifisches Verfahren zur qualitativen und quantitativen Erfassung chemischer Elemente.
Hierbei wird die zu untersuchende Lösung, in diesem Fall Plasma, in eine Acytelen-Luftflamme gesaugt, wobei sie feinzerstäubt und verascht wird. Die durch die hohe Flammentemperatur freigesetzten Calcium - Atome absorbieren Licht einer bestimmten, atomspezifischen Wellenlänge.
Durch den Einsatz von spezifischen Hohlkathodenlampen, die Strahlung in einem engen, atomspezifischen, und in diesem Fall speziell auf Calcium zugeschnittenen Wellenlängenbereich
aussenden, wird die Empfindlichkeit der Methode erzielt. Die Lichtabsorption der Probe wird gemessen und ist der Atomkonzentration in der Probe proportional. Bezogen auf eine im Vorfeld erstellte Eichkurve lassen sich die Konzentrationen der gemessenen Proben bestimmen und ablesen.
Die ermittelten Werte werden in mmol/l angegeben.
7.4. Anorganisches Phosphat
Der Gehalt des anorganischem Phosphats wurde in Li - Heparin - Blutproben mittels eines UV - Testsatzes für anorganisches Phosphat (PHOS, Fa. Scill animal care company GmbH, Viernheim, Deutschland) bestimmt. Dieser Test basiert auf einer Molybdat - Reaktion; anorganisches Phosphat bildet in schwefelsaurer Lösung einen Amonium - Phosphomolybdat - Komplex. Anhand der optischen Dichte dieser Lösung konnte der Phosphorgehalt der Probe errechnet werden.
Dazu wurden aus 20 µl destilliertem Wasser und 1000 µl des Testreagenz ein Reagenzienleerwert und aus 20 µl eines gebrauchsfertig mitgelieferten Kalibrators und 1000 µl des Testreagenz ein Standard hergestellt. Aus der zu analysierenden Blutprobe wurden 20 µl Plasma mit 1000 µl Testreagenz vermischt. Anschließend wurden die optischen Dichten dieser drei Lösungen in einem Photometer bei 340 nm und einer Inkubationstemperatur von 20-37 °C in Küvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm bestimmt.
Um den Gehalt anorganischen Phosphats in der Blutprobe zu erhalten bedient man sich abschließend folgender Formel:
EPr - ERL
CPr = CStd
EStd. - ERL
CPr = Phosphor-Konzentration der Probe; CStd = Konzentration Standard; EPr = Extinktion Probe;
EStd = Extinktion Standard; ERL = Extinktion Reagenzienleerwert 7.5. Osteocalcin
Die quantitative Bestimmung des intakten Osteocalcins erfolgte aus Li - Heparin - Plasma mittels eines kompetitiven Enzymimmunoassays (NovoCalcin-Kit, Fa. Metra Biosystems, Osnabrück).
HOYT und SICILIANO (1999) bestätigen durch ihre Untersuchungen die Anwendbarkeit des
Testprinzip:
Das auf der Festphase in den Kavitäten der Strips gebundene Osteocalcin konkurriert mit dem Osteocalcin der Proben, Standards und Kontrollen um die Bindungsstellen der im Unterschuss vorliegenden monoklonalen Osteocalcin-Antikörper. Im folgenden Waschschritt werden alle ungebundenen Reaktionspartner entfernt. Anschließend werden mit alkalischer Phosphatase markierte Sekundärantikörper zugegeben, die spezifisch an gebundene Osteocalcin - Antikörper binden. Die an die Sekundärantikörper gebundene alkalische Phosphatase setzt p-Nitrophenyl-Phosphat, das als Substrat im folgenden Schritt zugegeben wurde, enzymatisch zu einem farbigen Endprodukt um. Nach Zugabe einer Stopplösung wird die enzymatische Reaktion unterbrochen und es erfolgt die Messung der Enzymaktivität im Enzymimmunoassay-Reader bei einer Wellenlänge von 405 nm. Die gemessene optische Dichte verhält sich indirekt proportional zur Osteocalcin-Konzentration. Der im Assay eingesetzte monoklonale Antikörper erkennt spezifisch nur intaktes Osteocalcin, keine Fragmente.
Testdurchführung:
Je 25 µl der Plasmaproben (1:4 Verdünnung), der testeigenen Kontrollen und der Standards wurden in die entsprechenden Kavitäten pipettiert. Nach Zugabe von 125 µl Osteocalcin - Antikörperlösung in jede Kavität wurden die Strips abgedeckt und für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend folgten drei Waschgänge mit je 300 µl verdünnter Waschlösung pro Kavität. Nach Zugabe von 150 µl Enzym - Konjugat - Lösung wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Wiederum folgten drei Waschschritte.
Schließlich wurden die Strips nach Zugabe von 150 µl Substratlösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, danach 50 µl Stopplösung in jede Kavität pipettiert und die Enzymaktivität bei 405 nm im Enzymimmunoassay-Reader bestimmt.
Auswertung der Assays:
Die Osteocalcin - Konzentrationen der Proben wurden anhand einer Standardkurve ermittelt, die mit Hilfe von sechs Osteocalcin - Standards erstellt wurde. Dazu wurden die optischen Dichten aller Standards durch die optische Dichte des Null-Standards dividiert, wodurch man die prozentuale Bindung erhält. Diese werden gegen die Osteocalcin - Konzentrationen der Standards logarithmisch aufgetragen. Durch Division der optischen Dichten der Proben jeweils durch den Null - Standard konnte man anhand der erstellten Standardkurve die Osteocalcin - Konzentration der Proben in ng/ml ablesen.
7.6. Carboxyterminales Telopeptid der Typ-I-Kollagens (ICTP)
Die quantitative Bestimmung von ICTP im Li-Heparin-Plasma erfolgt mittels eines Radioimmunassays (ICTP - RIA, Fa. Orion Diagnostica, Espoo, Finnland). In den Untersuchungen von PRICE et al. (1995a) und LEPAGE et al. (1998) wurde die Übertragbarkeit auf das Pferd geprüft und bestätigt. Der Variationskoeffizient für ICTP beträgt 6,07 ± 6,61.
Testprinzip:
Bei dem Radioimmunassay handelt es sich um einen einseitigen kompetetiven Assay, bei dem
125Jod - markiertes ICTP mit dem ICTP aus der Probe um Bindungsstellen an einem ICTP - bindenden Antikörper konkurriert. Zum Nachweis des gebundenen 125Jod-markierten ICTP diente ein proteinfällender zweiter Antikörper. Dabei verhält sich der ICTP - Gehalt in den Proben umgekehrt proportional zu der Radioaktivität des Niederschlages.
Testdurchführung:
Je 100 µl der Plasmaproben, der testeigenen Kontrollen und der Standards wurden mit je 200 µl ICTP - Antiserum und je 200 µl 125Iod-markiertes ICTP in ein Polypropylenröhrchen pipettiert und für zwei Stunden bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde eine Separationslösung, bestehend aus dem zweiten, proteinfällenden Antikörper, zugegeben und die Röhrchen für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Röhrchen für 30 min bei 2000 g zentrifugiert, der Überstand abpipettiert und verworfen. Die Radioaktivität des Sedimentes wurde über den Zeitraum von einer Minute im Gamma - Szintillations - Zähler bestimmt.
Auswertung der Assays:
Mit Hilfe von sechs gebrauchsfertigen ICTP - Standards wurde eine Standardkurve erstellt, an der die ICTP - Gehalte der Proben abgelesen werden konnte.
Dazu wurden von den Doppelwerten der Standards die Mittelwerte errechnet und um die Zählrate der unspezifischen Bindung korrigiert. Im Verhältnis zur Negativkontrolle wurde aus den Mittelwerten die prozentuale Bindungsrate jeder einzelnen Standardkonzentration berechnet. Dabei wurde die Reaktionsrate der Negativkontrolle mit 100 % eingesetzt.
Die prozentuale Bindung wurde gegen die Konzentration jedes Standards aufgetragen und mittels Regressionsgleichung im Näherungsverfahren als Kurve dargestellt. Anhand dieser Kurve konnten anschließend die Konzentrationen der Proben in µg/l abgelesen werden.
7.7. Keratansulfat
Die Untersuchung der Li - Heparin - Plasma - Proben erfolgte mittels eines kompetitiven, indirekten ELISA, der polysulfatierte Epitope auf dem Keratansulfat - Molekül detektiert. Dieser Testkit wurde von THONAR und GLANT (1992) für den Humanbereich entwickelt. Die Analytik der Plasmaproben sowie die Verifizierung für Pferde wurde durch Herrn Prof. E.J. Thonar, Ph.D, Chicago, USA durchgeführt (THONAR 2005, persönliche Mitteilung). Der Variationskoeffizient für Keratansulfat beträgt 5,45 ± 4,15.
Testprinzip:
Verwendet wird ein monoklonaler Antikörper (1/20/5-D-4), der die zahlreich wiederholten polysulfatierten Sequenzen des Disaccharids Keratansulfat erkennt. Diese Sequenzen sind jedoch nur auf langen Keratansulfat - Ketten vollständig vorhanden, nicht auf Fragmenten.
Testdurchführung:
Anfangs werden die Proben und die mitgeführten Standards zur Bestimmung der Standardkurve mit einem gleichen Volumen des monoklonalen Antikörpers in einer Phosphatpufferlösung gemischt und bei 4°C über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag werden die Kavitäten, die ein mit einer Chondroitinase behandeltes bovines Proteoglykan aus der Nasenscheidewand enthalten, 3 mal gewaschen und mit 200 µl der Antigen - Antikörper - Mischung befüllt. Nach 1 h werden die Kavitäten erneut gewaschen und mit 200 µl einer Peroxidase - gekoppelten Anti - Maus - IgG - Lösung beschickt. Anschließend wird nach einer weiteren Stunde erneut ein Waschschritt durchgeführt und in jede Kavität 200 µl eines Substrates für die Peroxidase pipettiert, woraufhin eine Farbumwandlung beginnt. Die Bildung der Chromophore wird 30 - 60 min später durch Zugabe von 50 µl einer 2 molaren Schwefelsäure gestoppt.
Auswertung der Assays:
Die Konzentration von Keratansulfat in den Proben wird kalkuliert durch einen Farbvergleich mit den bekannten Standards. Dazu wird die Absorption der Proben gemessen und in die Standardkurve eingeordnet.
7.8. Aminosäuren Aufschluss der Proben:
500 µl der Probe werden zusammen mit 125 µl einer 10 %igen Sulphosalicylsäurelösung in ein Zentrifugenröhrchen gegeben. Die Lösung wird für 30 min bei +4 °C im Kühlschrank gelagert und anschließend für 10 min bei 3000 g zentrifugiert. Der klare Überstand wird mit einem Probenverdünnungspuffer 1:1 verdünnt.
Bestimmung der Aminosäuren:
Die Untersuchung des nun aufgeschlossenen Probenmaterials erfolgte als Ionenaustauscherchromatographie im Aminosäurenanalysator LC 3000 (Fa. Biotronic, Maintal).
Die Trennsäule (Länge 21 cm, Durchmesser 3,2 mm) war mit einem Ionenaustauscherharz (sulfoniertes Polystyrol mit Divinylbenzol), das als austauschbare Ionen Lithium enthielt, als stationäre Phase beschickt. Als mobile Phase diente ein Lithium - Acetat - Puffer (0,1 n; pH 2,2).
Die Aminosäuren wurden entsprechend ihrer Dissoziationsfähigkeit an der Säule getrennt und durch ein Detektorsystem nach Anfärbung mit Ninhydrin photometrisch gemessen.