Mitochondrienmembran erreicht werden. Nur die interne, nicht aber die externe Form des alternativen Enzyms kann die Elektronentransportfunktion des Komplex I ersetzen und ermöglicht so das Überleben von Komplex I-Nullmutanten. Um ein Screening-System für Mutationen in Komplex I zu entwickeln, wurde die interne Version von NDH2 unter die Kontrolle des Promotors des Isocitrat-Lyase-Gens von Y. lipolytica gebracht, der durch Wechsel des Substrats reguliert werden kann.
Die Arbeiten zur Mutagenese in der Region des Ubichinon-Reduktionszentrums, des „catalytic core“
von Komplex I, wurden fortgesetzt. Hierbei wurde insbesondere die Funktion konservierter saurer Reste in der PSST-Untereinheit untersucht. In Zusammenarbeit mit Dr. P. Rustin und P. Bénit (INSERM U393, Hôpital Necker-Enfants Malades, Paris, Frankreich) wurde begonnen, menschliche Mutationen in den 24 kDa und 30 kDa Untereinheiten von Komplex I zu rekonstruieren und in vitro zu charakterisieren.
In Zusammenarbeit mit Prof. Dr. M. Radermacher, Dr. T. Ruiz (MPI für Biophysik, Frankfurt, jetzt University of Vermont, USA) wurde Komplex I mit Hilfe der kryo-elektronenmikroskopischen Einzelpartikelanalyse untersucht, um 2D und 3D Strukturinformationen mit einer Auflösung von ca.
20 Å zu erhalten. Außerdem wurden in Zusammenarbeit mit C. Hunte (MPI für Biophysik, Frankfurt) konformationsspezifische monoklonale Antikörper erzeugt und zur Aufklärung der Positionen einzelner Untereinheiten innerhalb des Enzyms eingesetzt. Ein überraschendes und wichtiges Ergebnis dieser Arbeiten war, dass ein Epitop der 49 kDa Untereinheit, die am „catalytic core“ zentral beteiligt ist, ca. 70-80 Å von der mitochondrialen Membran entfernt lokalisiert ist. Damit erscheint ein indirekter Protonen-Pumpmechanismus für Komplex I wahrscheinlich.
Diese Arbeiten wurden von der DFG im Rahmen des SFB 472 (Molekulare Bioenergetik) und des SFB 628 (Functional Membrane Proteomics) sowie vom Fonds der Chemischen Industrie gefördert.
In Zusammenarbeit mit Prof. Dr. C. Griesinger (MPI für Biophysikalische Chemie, Göttingen) und Prof. Dr. H. Schwalbe (Fachbereich Chemie) wurden NMR-spektroskopische Untersuchungen zur Chinonbindung am mitochondrialen und bakteriellen Komplex III der Atmungskette durchgeführt.
Hierzu wurden auch molecular modelling Studien in Kooperation mit C. Roy Lancaster (MPI für Biophysik, Frankfurt) durchgeführt. Am gleichen Enzym wurden in einer Kooperation Prof. Dr. B. L.
Trumpower (Dartmouth Medical School, USA) EPR-Spektroskopische Studien durchgeführt.
Im Rahmen einer Kooperation mit der Aventis Pharma GmbH, Frankfurt, wurden potentielle Antidiabetika im Hinblick auf ihre hemmende und entkoppelnde Wirkung auf die oxidative Phosphorylierung von Rattenlebermitochondrien untersucht. In Kooperationen mit Dr. P. Hanley (Universität Marburg) und Prof. Dr. H. Böhles (Zentrum für Kinderheilkunde) wurden verschiedene Untersuchungen zum mitochondrialen Fettsäuremetabolismus durchgeführt.
Forschergruppe Prof. Dr. Hermann Schägger:
Das Arbeitsgebiet "Oxidative Phosphorylierung" umfasste Themen der biochemischen und klinischen Grundlagenforschung:
• Aufklärung der funktionellen Rolle der Respirasom-Bildung (der Assoziation von Atmungskettenkomplexen zu Superkomplexen in der mitochondrialen Membran) und der Notwendigkeit von Cardiolipin zur Stabilisierung dieser Respirasome.
• Untersuchung von Redox-induzierten Übergängen im Komplex III der Atmungskette mit der Perfusions-induzierten ATR-FTIR Spektroskopie.
• Isolierung, Charakterisierung und elektronenmikroskopische Einzelpartikelanalyse des Komplexes I aus Aquifex aeolicus.
• Es konnte gezeigt werden, dass bestimmte Nieren-Tumore (Oncozytome) einen spezifischen Defekt des Atmungskettenkomplexes I aufweisen. Die Spezifität des Defektes, der ohne Ausnahme in allen Oncozytomen anzutreffen war, und die gleichzeitig gesteigerte mitochondriale Proliferation, deuten auf einen Komplex I-Defekt als primäre Ursache dieser Nierentumore hin.
Als weitere Themen wurden bearbeitet:
• Die Charakterisierung der Benzoat-Coenzym A Ligase aus Thauera aromatic.
• Die Entwicklung einer Strategie zur temporären Verknüpfung von Kohlenhydraten mit Cyclopeptiden zur Analyse von multivalenten Neoglycopeptiden.
Diese Themen wurden in Zusammenarbeit mit zahlreichen Kollegen aus dem In- und Ausland bearbeitet. Die Arbeiten wurden von der DFG im Rahmen des SFB 472 (Molekulare Bioenergetik) und des SFB 628 (Functional Membrane Proteomics) gefördert.
Institut für Biochemie II
Direktor: Prof. Dr. Werner Müller-Esterl
1. Medizinisches Leistungsangebot (Krankenversorgung) Entfällt
2. Lehre
Das Institut für Biochemie II beteiligt sich an der Grundausbildung der Medizinstudenten im Rahmen der Vorlesungen „Biochemie“, des Praktikums „Physiologische Chemie“, des Seminars „Ausgewählte Themen aus der Biochemie“ sowie des Prüfungskurses „Biochemie kompakt“.
3. Forschung
3.1 Forschungsschwerpunkte und Projekte
Schwerpunkt der Forschungsaktivitäten am Institut für Biochemie II ist die Untersuchung der molekularen Mechanismen zellulärer Signaltransduktion. Folgende Teilaspekte stehen dabei im Vordergrund des Interesses:
Regulation der zellulären Translokation endothelialer NO-Synthase
Endotheliale NO-Synthase (eNOS) spielt eine zentrale Rolle bei der Blutdruckregulation. Unter Ruhebedingungen ist eNOS mit der Plasmamembran assoziiert. Wird eine Endothelzelle durch Schubspannung oder endogene Effektoren wie Bradykinin stimuliert, kommt es zur Umverteilung („Translokation“) des Enzyms von der Plasma- an die Golgi-Membran und retour. Dabei assistieren Translokatorproteine wie das eNOS-interagierende Protein NOSIP und der NOS traffic inducer NOSTRIN, die an das Enzym binden und seine Aktivität und Lokalisation beeinflussen. NOSIP ist gut konserviert und findet sich bei Vertebraten, Invertebraten und Pflanzen, während NOSTRIN wohl nur bei Säugern vorkommt. Derzeit wird an der gezielten Deletion der NOSIP/NOSTRIN-Gene in der Maus gearbeitet (gefördert mit Mitteln des Sonderforschungsbereich SFB 553, Teilprojekt B3 und der Forschergruppe 501 „Vaskuläre Homöoostase“, TP5).
Modulation der Aktivität von löslicher Guanylylcyclase
In einem weiteren Forschungsprojekt befasst sich das Institut mit Interaktionspartnern eines NO-abhängigen Enzyms, der löslichen Guanylylcyclase. Dabei wird das yeast two hybrid-System verwendet, um neue Bindungsproteine zu identifizieren und zu klonieren. Der Prototyp eines solchen Guanylylcyclase-interagierenden Proteins („GCIP“) erwies sich als neuartiges Protein mit einer ausgeprägten Domänenstruktur, die charakteristisch für eine ganze Familie solcher GCIP-ähnlicher Proteine ist. Derzeit wird versucht, die funktionellen Auswirkungen von GCIP auf lösliche Guanylylcyclase zu analysieren, die subzelluläre Lokalisation dieses Proteins zu untersuchen, sowie die organ- und gewebsspezifischen Expressionsmuster des Proteins in der Maus zu bestimmen (gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG, Projekt Mu598/6-1 bzw. SFB 553, TP C11).
Molekulare Ziele von cGMP-gesteuerten Kinasen
Die vielfältigen zellulären Wirkungen von NO und cGMP werden z.T. über cGMP-abhängige Proteinkinasen (cGK) vermittelt, die u.a. den Tonus der glatten Gefäßmuskulatur und die Aktivität von Blutpättchen regulieren. Ebenso steuern cGKs die Sekretion von Proteinen, den Transport von Ionen über Membranen sowie Zellwachstum und Genexpression. Sowohl spezifische Funktionen dieser Kinasen als auch Wechselwirkungen mit anderen Signalwegen in vaskulären Zellsystemen werden untersucht. Mit der KESTREL-Methode (kinase substrate tracking and elucidation) wird versucht, neue cGK-Substrate zu identifizieren. Dabei werden zunächst in vitro Kandidaten in franktionierten Zelllysaten identifiziert und dann in vivo mit phosphospezifischen Antikörpern verifiziert.
Längerfristige Wirkungen der cGKs auf das Genexpressionsprofil von Zellen werden mit Hilfe der
SAGE-Methode (serial analysis of gene expression) untersucht. Mit dieser Technik gewinnt man zusätzlich Informationen über das gesamte Transkriptom von Zellen. Letztlich zielen diese Arbeiten auf ein tieferes Verständnis der molekularen Abläufe am „Fußpunkt“ der NO-Kaskade (gefördert durch SFB 553, TP C11).
Molekulare Mechanismen der Tumorentwicklung und –ausbreitung
Die Tumorentwicklung ist ein vielstufiger Prozess, bei dem Änderungen wachstumsregulierender Gene oftmals den Übergang von normalen zu malignen Zellen vorantreiben. Die Kombination von solchen Mutationen, verbunden mit weiteren genetischen und immunologischen Veränderungen, bestimmt den onkogenetischen Phänotyp und die Tumorausbreitung in vivo. Ziel dieser Arbeiten ist die Analyse regulatorischer Signalwerke bei der Tumorentstehung. Angesichts der multikausalen Entstehung von Krebs konzentrieren sich die Arbeiten des Instituts auf ausgewählte Proteine mit onkogenetischem Potential, wie z.B. Tyrosinkinase-Rezeptoren für den Epidermalen Wachstumsfaktor, Ubiquitin-Ligasen wie Cbl und Adapterproteine wie CIN85. Genutzt wird dabei das DNA-Mikroarray-Verfahren und transgene Technologie, um Funktion und Bedeutung dieser Proteine bei Zelltransformation und Metastasierung besser verstehen zu lernen (gefördert vom Boehringer Ingelheim Fonds sowie der DFG, Projekt DI 931-1).
Rolle von „Membrane Rafts“ bei der Entstehung von Zellpolarität
„Membrane Rafts“ sind cholesterinreiche, spezialisierte Mikrodomänen in Zellmembranen. Eine wichtige Funktion von „Rafts“ liegt darin, dass sie an Signaltransduktionsprozessen beteiligt sind.
Viele für die Signaltransduktion wichtige Moleküle wie z.B. Proteinkinasen sind in „Rafts“
angereichert, wodurch eine bessere Kontrolle der Signalübertragung gewährleistet wird. „Rafts“
spielen auch bei zellulären Transportprozessen, Phagozytose, Zellmigration und Aktivierung der Immunzellen eine Rolle. Viele dieser Prozesse setzen eine Signalleitung von „Rafts“ zum Aktinzytoskelett in Gang, was zur Polarisierung der Zelle führt. Die Moleküle, die diese Signale vermitteln, sind noch weitgehend unbekannt. Das Institut konnte zeigen, dass die nahezu ubiquitären
„Raft“-assoziierten Reggie-Proteine – auch Flottiline genannt - als Bindeglieder zwischen Zytoskelett und „Rafts“ dienen können und via Src-Kinasen und PI3-Kinase mit intrazellulären Signalketten gekoppelt sind. Das Hauptziel der Arbeiten des Instituts ist es, die molekularen Mechanismen der Signaltransduktion von „Rafts“ und Reggie-Proteinen zum Aktinzytoskelett zu charakterisieren (Förderung beantragt).
Interaktion von Angiotensin Converting Enzyme und Bradykinin-Rezeptor
„Angiotensin Converting Enzyme“ (ACE) kommt in großen Mengen in Lungenkapillaren vor und hat dort zwei Effekt: es „konvertiert“ Angiotensin I zum aktiven Hormon Angiotensin II und inaktiviert Bradykinin durch gezielte Proteolyse. Nettoeffekt dieser kombinierten Wirkung ist eine Blutdrucksteigerung durch vermehrte Bildung des vasokonstriktorischen Angiotensin II und den Abbau von vasodilatierendem Bradykinin. Auf diesem Prinzip basieren Inhibitoren von ACE (ACE-Hemmer) in der Therapie des Bluthochdrucks. Neuere Untersuchungen zeigen, dass ACE-Hemmer noch weitere, durch den geschilderten Mechanismus nicht ohne weiteres zu erklärende Wirkungen haben, so z.B. Kardio- und Vasoprotektion, welche die Mortalität von Risikopatienten erheblich senken können. Gemeinsam mit der Arbeitsgruppe von Prof. Busse wird versucht, die molekulare Basis dieser „protektiven“ Effekte aufzuklären; dabei konzentrieren sich die Arbeiten des Instituts vor allem auf die Interaktion von ACE mit dem Bradykinin-B2-Rezeptor (gefördert durch SFB 628, TP B1 und die Firma Aventis).