Chromatographische Analysemethoden

Zur Analyse der durch Umesterung gewonnenen FSME wurden zwei unterschiedli-che gaschromatographisunterschiedli-che Verfahren genutzt und zu einer genaueren Aufschlüsse-lung der CLA-Isomeren im Milchfett ein Ag⁺-HPLC-Verfahren. Die Kombination der beiden gaschromatographischen Methoden war nötig, um alle Fettsäuren, ein-schließlich der cis- und trans-Isomeren der Ölsäure, zu trennen (KRAMER u. ZHOU

2001, YURWECZ U.MOREHOUSE 2001).

Aufgrund des sehr seltenen Vorkommens (0,03%), der Lage im Chromatogramm und der Ähnlichkeiten zu den Analyten wurde Tritricosanoylglycerid (LORADAN FINE C HE-MICALS AB, Malmö, Schweden) als interner Standard (IST) verwendet, lediglich bei den Analysen der Wiesenheu-Proben diente Ricinolsäure als interner Standard. Um Verluste bei der Probenaufarbeitung erfassen zu können, wurde der interne Stan-dard, wie schon beschrieben, vor dem Methylierungsprozess den Proben zugesetzt.

3.2.7.4.1. GC-FID

Die gaschromatographischen Analysen (mit Ausnahme der Wiesenheu-Proben) er-folgten mittels eines GC 17-A V.3 (SHIMADZU, Kyoto, Japan). Die angewendeten GC-Bedingungen sind im Anhang IV näher beschrieben.

o GC-Analyse 1:

Eine kurze Säule mittlerer Polarität (CP Select^® DB 225 ms, CHROMPACK INC., Nieder-lande; 30 m x 0,25 mm, 0,20 µm df) ermöglichte eine Trennung und Quantifizierung der FSME von 60 Fettsäuren. Dabei erfolgte eine Trennung der FSME von C4 bis C25 (einschließlich verzweigtkettiger Strukturen) in relativ kurzer Zeit (ca. 1 Std.).

Ebenso konnte c9,t11/t8,c10-CLA von anderen CLA-Isomeren ohne weitere störende

Peaks getrennt werden. Eine detaillierte Analyse der Minor-CLA-Isomeren in den Milchfettproben wurde mit Hilfe der Ag⁺-HPLC erreicht.

o GC-Analyse 2:

An einer hochpolaren Säule (CP SIL 88, CHROMPACK INC., Niederlande; 100 m x 0,25 mm, 0,25 µm df) erfolgte die Trennung der geometrischen und Positionsisomeren der Octadecensäure (C18:1). Die Kalibrierung erfolgte mittels Referenzsubstanzen (S IG-MA, Deisenhofen, Deutschland; LORADAN FINE CHEMICALS AB, Malmö, Schweden). Als CLA-Standards wurden c9,t11, t10,c12, c9,c11 und t9,t11 (MATREYA, Pleasant Gap, PA, USA) verwendet. Unter Verwendung von hausinternen Standards des Instituts für Ernährungswissenschaften, Lehrstuhl für Ernährungsphysiologie der Friedrich-SchillUniversität Jena und zertifizierten Standards (BCR-Standard: CRM 164) er-folgte die Validierung der Methode.

Die Software CLASS VP 5.0 der Firma SHIMADZU (Kyoto, Japan) diente zur Auswer-tung. Die einzelnen Fettsäuren wurden durch den Vergleich ihrer Retentionszeiten mit den Retentionszeiten der Referenzsubstanzen identifiziert. Die Quantifizierung erfolgte über die Peakflächen. Die Ergebnisse der kurzen und der langen Säule wur-den miteinander verrechnet.

o GC-Analyse 3:

Die gaschromatographischen Analysen der Wiesenheu-Proben erfolgten an einer HEWLETT PACKERD GC 6890 (HEWLETT PACKERD GMBH, Waldbronn, Deutschland).

Die angewendeten GC-Bedingungen sind in Anhang IV näher beschrieben. Es wurde eine kurze Säule mittlerer Polarität (CP 7716) zur Trennung der FSME genutzt. Zur Auswertung wurde die Software HEWLETT PACKERD GC CHEMSTATION (Rev.A.06.03 [509]) verwendet. Als Referenzsubstanzen dienten die Lipidstandards 189-13 und 189-18 der Firma SIGMA (SIGMA, Deisenhofen, Deutschland). Die einzel-nen Fettsäuren wurden durch den Vergleich ihrer Retentionszeiten mit den Retenti-onszeiten der Referenzsubstanzen identifiziert. Die Quantifizierung erfolgte über die Peakflächen.

3.2.7.4.2. Ag⁺- HPLC

Mit einer HPLC der Firma SHIMADZU (Kyoto, Japan) wurde die Trennung der CLA-FSME der Milchfettproben vorgenommen. Dazu wurden drei ChromSpher 5 Lipids, analytische silberimprägnierte Säulen die in Reihe geschaltet waren, genutzt (4,6 mm i.d. x 250 mm Stahl, 5 µm Partikelgröße; VARIAN-CHROMPACK INTERNATIONAL, Middleburg, Niederlande). Die Detektion erfolgte mit Hilfe eines UV/Vis-Detektors bei einer Wellenlänge von 234 nm. Das Fließmittel, bestehend aus 0,1 % Acetonitril und 0,5 % Diethylether in n-Hexan, wurde täglich frisch angemischt. Zusätzlich verhinder-te ein Magnetrührer ein Entmischen. Das Sysverhinder-tem arbeiverhinder-teverhinder-te isokratisch bei einem Fluss von 1ml/min und das Injektionsvolumen der Test- bzw. Probenlösung betrug 5 - 20 µl (repräsentativ für < 250 µg Fett). Die einzelnen CLA-Isomere wurden entwe-der mit Hilfe von kommerziellen Referenzsubstanzen über die relative Retentionszeit oder mit Hilfe des Vergleichs der Elutionsreihenfolge der CLA-Isomeren mit verfüg-baren Literaturangaben (YURAWECZ et al. 1998, KRAMER et al. 1999) bestimmt. Reine Einzelisomeren der Firmen MATREYA (Pleasant Gap, PA, USA: c9,t11; t10,c12;

t9,t11; t10,t12 c9,c11) und LORADAN FINE CHEMICALS AB (Malmö, Schweden: t8,t10;

c11,t13) sowie ein Mischstandard der Firma SIGMA (Deisenhofen, Deutschland) wur-den als CLA-Referenzstandards genutzt.

Die Chromatogramme wurden anhand der Peakflächen ausgewertet. Über die Ge-samtmenge an CLA konnte der prozentuale Anteil der einzelnen Isomere bestimmt werden. Die zuvor ermittelten GC-Daten wurden verwendet, um den Gehalt der ein-zelnen CLA-Isomere an den Gesamtfettsäuren zu kalkulieren. Bei der gaschroma-tographischen Methode koeluiert das Haupt-CLA-Isomere c9,t11 mit dem Isomer t8,c10 (JAHREIS et al. 2000). Um den Gehalt der einzelnen CLA-Isomere zu berech-nen, wurden die gaschromatographischen Messdaten zu Hilfe genommen: die Flä-chen der beiden c9,t11- und t8,c10-CLA-Peaks der HPLC-Analyse wurden summiert und ins Verhältnis zu dem c9,t11-t8,c10-CLA-Peak der GC-Analyse gesetzt (KRAFT, 2003):

„Zwei-Isomeren“-PeakflächeGC = (c9,t11 + t8,c10)-PeakflächeHPLC

Die anderen CLA-Isomeren des Milchfettes wurden durch die Bildung des Verhält-nisses von deren Peakfläche zur Fläche des Hauptisomeres c9,t11 kalkuliert.

3.2.7.4.3. Berechnung der absoluten Mengen an Fettsäuren

Es wurden nur die für die Fragestellung relevanten Fettsäuren und einige andere Fettsäuren quantifiziert, so dass die Summe der bestimmten Fettsäuren nicht 100%

ergibt. Bei den Plasma- und Erythrozytenproben wurde lediglich die Verteilung der Fettsäuren ermittelt.

3.2.7.4.3.1. Milchfett

Die Quantifizierung der Fettsäuren der Milchfettproben erfolgte durch den Einsatz eines Korrekturfaktors von 0,875. Dabei wurde zu Grunde gelegt, dass das Milchfett nahezu vollständig aus Triacylglyceriden besteht (JENSEN et al. 1991: Triaclyglycerid-Anteil ca. 98,6% im Milchfett), und es wurde von einem Fettsäurenanteil von 87,5%

im Milchfett ausgegangen (SCHAUFF et al. 1992, CHOUINARD et al. 1999).

3.2.7.4.3.2. Darmchymus -, Kraftfutter- Wiesenheufett und Leinöl

Unter der Annahme, dass das Fett im Kraftfutter zu 100% aus Triacylglyceriden be-steht, wurde die Menge an reinen Fettsäuren bzw. der Glycerinanteil im Kraftfutterfett mit Hilfe eines Korrekturfaktors berechnet. Über das Fettsäurenmuster und die Mol-massen der einzelnen Fettsäuren sowie des verbleibenden „Glycerinrestes“ (C3H2) konnte die Menge an „Glycerinrest“ berechnet werden, die in 100 g Fett vorlag. Der mittlere Glycerinrestanteil in den Triacylglyceriden betrug etwa 5%, es wurde dem-entsprechend ein Korrekturfaktor von 0,95 angewendet. Bei der Quantifizierung der Fettsäuren im Leinöl wurde ebenfalls von der allgemeinen Annahme ausgegangen, dass das in den Proben vorliegende Fett fast ausschließlich aus Triacylglyceriden

besteht (GULATi et al. 1997) und dass der Anteil an Fettsäuren, bis auf wenige Aus-nahmen, bei etwa 90% (SÜDEKUM 2004) liegt. Es wurde dementsprechend der Kor-rekturfaktor 0,9 zum Berechnen der Menge an Fettsäuren im Probenfett verwendet.

Bei den Wiesenheu- und Darmchymusfettproben konnte eine Berechnung der abso-luten Mengen der Fettsäuren über einen Korrekturfaktor nicht erfolgen, da Wiesen-heu und Darmchymusfett (sowohl durch die Fütterung des Tieres als auch durch die Umsetzung der Fette durch die Pansenbakterien) verschiedene Lipidklassen aufwei-sen (siehe Kapitel 3.2.7.2.3.). Die Quantifizierung der Fettsäuren in den Wieaufwei-senheu- und Darmchymusfettproben erfolgte daher mit Hilfe des internen Standards wie nachstehend beschrieben: Vorausgesetzt wurde, dass bei dem vor der Bearbeitung der Fettprobe zugesetzten internen Standard (IST) dieselben Verluste durch die Pro-benaufarbeitung auftraten wie bei den im Fett enthaltenen Fettsäuren.

Mit Hilfe der Fläche der Probenkomponentei und der Fläche des internen Standards im externen Standard wurde der Responsefaktor fi für jede einzelne Fettsäure (FSi) mit folgender Formel berechnet:

Standard) externen

(im IST Fläche

FS Fläche ktor

Responsefa

f_i = _i = ⁱ

Dabei stellt der Responsefaktor das Peakflächenverhältnis von FSi und IST bei glei-cher Konzentration dar.

Unter der Annahme, dass die Fläche des internen Standards in der Messlösung der zur Probe zugesetzten Menge des IST entsprach, konnte über die gemessene Flä-che der jeweiligen Fettsäure, der gemessenen FläFlä-che des IST korrigiert mit dem Responsefaktor und der eingesetzten Menge des IST die Menge der jeweiligen Fett-säure in der Einwaage berechnet werden. Folgende Formel gibt diesen Sachverhalt wieder:

zugesetzt

Die lange, hochpolare Säule konnte aufgrund ihrer spezifischen Eigenschaften den internen Standard nicht mit erfassen, so dass eine Quantifizierung der cis- und trans-Isomeren der Oktadecensäure nur über eine Abschätzung aufgrund der chroma-tographischen Daten möglich war (Darmchymus proben). Als Bezugspunkt galt dabei die Stearinsäure (C18:0), die sowohl auf der kurzen als auch auf der langen Säule erkannt und gemessen wurde. Die Fläche der C18:0 auf der kurzen Säule entsprach nach vorangegangener Quantifizierung einer gewissen Menge an Fettsäure. Dem-entsprechend war diese Menge an C18:0 der Fläche C18:0 auf der langen Säule gleichzusetzen und über folgenden Dreisatz die Menge der cis- und trans-Isomeren der C18:1 zu berechnen: