der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft in Braunschweig
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Untersuchungen an Milchkühen zum Einfluss der Rationsgestaltung und einer Leinölzulage auf die Pansenfermentation sowie die Menge an Inhaltsstoffen,
insbesondere trans-Fettsäuren und CLA, im Duodenalchymus und in der Milch
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Kristin Erdmann
aus Nordenham
Hannover 2005
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet. G. Breves (TiHo) Univ.-Prof. Dr. agr. G. Flachowsky (FAL)
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. G. Breves (TiHo) 2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Martin Kaske (TiHo)
Tag der mündlichen Prüfung: 27.05.2005
ALLEN MEINEN LIEBEN
Erdmann, Kristin, P. Lebzien und G. Flachowsky (2004):
Influence of a linseed oil supplementation at different concentrate/roughage ratios on some rumen parameters in lactating dairy cows.
Proc Soc Nutr Physiol 13, 85
Erdmann, Kristin, P.Lebzien, G. Flachowsky, P. Möckel und G. Jahreis (2005):
Einfluss mehrfach ungesättigter Fettsäuren (PUFA) und der Rationsgestaltung auf die Fettsäurenzusammensetzung im Milchfett, insbesondere den Gehalt an trans- Fettsäuren (tFA) und konjugierten Linolsäuren (CLA) von laktierenden Kühen.
Proc Germ Nutr Soc 7, 57-58
Erdmann, Kristin, P. Lebzien, Liane Hüther, G. Flachowsky, P. Möckel und G.
Jahreis (2005):
Influence of polyunsaturated fatty acids (PUFA) and the rumen-milieu on ruminal pro- duction of trans-fatty acids (tFA) and conjugated linoleic acids (CLA), their flow into the duodenum and their content in the milk fat.
Proc Soc Nutr Physiol 14, 109
I
NHALTSVERZEICHNIS ABBILDUNGSVERZEICHNISTABELLENVERZEICHNIS
ANHANGSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
1.EINLEITUNG... 1
2.LITERATURÜBERSICHT UND ABLEITUNG DER AUFGABENSTELLUNG... 4
2.1.CHEMIE UND NOMENKLATUR... 4
2.1.1. TRANS-FETTSÄUREN... 4
2.1.2.KONJUGIERTE LINOLSÄUREN (CLA)... 5
2.2.PHYSIOLOGISCHE EIGENSCHAFTEN... 6
2.2.1. TRANS-FETTSÄUREN... 6
2.2.1.1. Atherogene Wirkung ... 6
2.2.1.2. Karzinogene Wirkung... 7
2.2.1.3. Diabetogene Wirkung ... 8
2.2.1.4. Weitere physiologische Wirkungen ... 9
2.2.2.KONJUGIERTE LINOLSÄUREN (CLA)... 10
2.2.2.1. Karzinogene Wirkung... 11
2.2.2.2. Metabolische Wirkung... 13
2.2.2.3. Immunmodulierende Wirkung ... 16
2.2.2.4. Atherogene Wirkung ... 18
2.2.2.5. Diabetogene Wirkung ... 19
2.3.QUELLEN UND SYNTHESE... 20
2.3.1.VORKOMMEN IN LEBENSMITTELN –AUFNAHME DURCH DEN MENSCHEN... 20
2.3.1.1. trans-Fettsäuren... 20
2.3.1.2. Konjugierte Linolsäuren (CLA) ... 23
2.3.2.CHEMISCHE-INDUSTRIELLE SYNTHESE... 24
2.3.2.1. trans-Fettsäuren... 24
2.3.2.2. Konjugierte Linolsäuren (CLA) ... 25
2.3.3.BIOHYDROGENIERUNG: TRANS-FETTSÄUREN UND KONJUGIERTE LINOLSÄUREN (CLA)... 26
2.4.BEEINFLUSSUNG DER RUMINALEN BIOHYDROGENIERUNG... 29
2.4.1.TIERINDIVIDUELLE EINFLÜSSE... 29
2.4.2.FÜTTERUNGSBEDINGTE EINFLÜSSE... 30
2.4.3. TRANS-FETTSÄUREN,CLA UND MILCHFETTDEPRESSION (MFD) ... 41
2.5.ABLEITUNG DER AUFGABENSTELLUNG... 43
3.MATERIAL UND METHODEN... 46
3.1.UNTERSUCHUNGEN AN FISTULIERTEN MILCHKÜHEN... 46
3.1.1.VERSUCHSAUFBAU UND PROBENUMFANG... 46
3.1.2.VERSUCHSTIERE:HALTUNG UND FÜTTERUNG... 47
3.1.2.1. Versuchsverlauf ... 50
3.1.3.PROBENENTNAHME UND -AUFBEREITUNG... 51
3.1.3.1. Pansensaft ... 51
3.1.3.2. Chymus am Duodenum ... 52
3.1.3.2.1. Herstellung und Verabreichung des Markers ... 52
3.1.3.2.2. Sammlung und Aufbereitung der Chymusproben... 52
3.1.3.3. Milchproben ... 53
3.1.3.4. Blutproben... 54
3.2.ANALYTISCHE MEßMETHODEN... 55
3.2.1.WEENDER ROHNÄHRSTOFFANALYTIK UND NDF... 55
3.2.2. PH-WERT UND AMMONIAK-STICKSTOFF IM PANSENSAFT... 55
3.2.3. KURZKETTIGE FETTSÄUREN IM PANSENSAFT... 56
3.2.4.CHROMKONZENTRATION IM DUODENALCHYMUS... 56
3.2.5. MIKROBIELLER ROHPROTEINANTEIL IM DUODENALCHYMUS... 57
3.2.6.MILCHINHALTINHALTSSTOFFE... 57
3.2.7.1. Lipidextraktion... 57
3.2.7.1.1. Milchfett ... 58
3.2.7.1.2. Plasma- und Erythrozytenproben ... 58
3.2.7.1.3. Wiesenheu-Proben... 58
3.2.7.1.4. Darmchymus- und Kraftfutterproben ... 59
3.2.7.2. Derivatisierung ... 59
3.2.7.2.1. Leinöl und Milchfett ... 60
3.2.7.2.2. Plasma-, Erythrozyten- und Kraftfutterproben ... 60
3.2.7.2.3. Wiesenheu-Proben... 61
3.2.7.2.4. Darmchymus ... 61
3.2.7.3. Dünnschichtchromatographische Reinigung... 63
3.2.7.4. Chromatographische Analysemethoden ... 64
3.2.7.4.1. GC-FID ... 64
3.2.7.4.2. Ag+- HPLC... 66
3.2.7.4.3. Berechnung der absoluten Mengen an Fettsäuren ... 67
3.2.7.4.3.1. Milchfett... 67
3.2.7.4.3.2. Darmchymus -, Kraftfutter- Wiesenheufett und Leinöl... 67
3.3.MATHEMATISCHE UND STATISTISCHE AUSWERTUNG... 69
4.ERGEBNISSE... 72
4.1.ZUSAMMENSETZUNG UND QUALITÄT DER VERABREICHTEN FUTTERMITTEL... 72
4.1.1.ROHNÄHRSTOFFGEHALTE IM WIESENHEU... 72
4.1.2.ROHNÄHRSTOFFGEHALTE IM KRAFTFUTTER... 73
4.1.3.FETTSÄURENVERTEILUNG IM LEINÖL... 74
4.2.FUTTERAUFNAHME UND NÄHRSTOFFAUFNAHME... 75
4.3.PANSENPHYSIOLOGISCHE PARAMETER... 78
4.3.1. PH-WERTE... 78
4.3.2.AMMONIAK-N-KONZENTRATION (NH3-N)... 79
4.3.3.KONZENTRATION AN KURZKETTIGEN FETTSÄUREN... 81
4.4.UNTERSUCHUNGEN AM DUODENUM... 82
4.4.1.NÄHRSTOFFFLUSS AM DUODENUM... 82
4.4.2.STICKSTOFF (N),NICHTAMMONIAK-STICKSTOFF (NAN) UND MIKROBENPROTEIN AM DUODENUM... 83
4.5.EINFLUSS DER FÜTTERUNG AUF MILCHLEISTUNG UND MILCHINHALTSSTOFFE... 86
4.6.GASCHROMATOGRAPHISCHE AUSWERTUNG DER GEWONNENEN PROBEN... 87
4.6.1.FETTSÄURENVERTEILUNG IM DARMCHYMUSFETT (DF) ... 87
4.6.2.FETTSÄURENVERTEILUNG IM PLASMA UND IN DEN ERYTHROZYTEN... 94
4.6.3.FETTSÄURENVERTEILUNG IM MILCHFETT (MF)... 96
5.DISKUSSION... 104
5.1.VERSUCHSKRITIK... 104
5.2.EINFLUSS DER FÜTTERUNG AUF PANSENPHYSIOLOGISCHE PARAMETER... 105
5.2.1. PH-WERT... 105
5.2.2.AMMONIAK-STICKSTOFF (NH3-N) ... 106
5.2.3.KURZKETTIGE FETTSÄUREN (SCFA) ... 107
5.3.EINFLUSS DER FÜTTERUNG AUF NÄHRSTOFF- UND FETTSÄURENFLUSS AM DUODENUM... 108
5.3.1.NÄHRSTOFFE... 108
5.3.2.FETTSÄUREN... 111
5.3.2.1. Leinöleinfluss auf MUFA und SFA ... 111
5.3.2.2. Leinöleinfluss auf tC18:1 und CLA... 112
5.3.2.3. Heueinfluss auf tC18:1 und CLA... 115
5.3.2.4. Wechselwirkungen... 119
5.3.2.5. Biohydrogenierungsrate... 121
5.4.EINFLUSS DER FÜTTERUNG AUF FETTSÄUREN IN PLASMA UND ERYTHROZYTEN.. 123
5.5.EINFLUSS DER FÜTTERUNG AUF FETTSÄUREN IM MILCHFETT UND MILCHIHALTSSTOFFE... 125
5.5.1.FETTSÄUREN... 125
5.5.1.1. Leinöleinfluss auf MUFA und SFA ... 125
5.5.1.2. Leinöleinfluss auf tC18:1, CLA und deren Isomeren... 128
5.5.1.3. Heueinfluss auf PUFA, tC18:1- und CLA-Isomeren ... 133
5.5.2.MILCHINHALTSSTOFFE... 135
6.SCHLUSSFOLGERUNGEN... 138
7.ZUSAMMENFASSUNG... 140
8.SUMMARY... 144
9.LITERATURVERZEICHNIS... 148
10.ANHANG... 179
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
ABBILDUNG 1: Strukturvergleich von Öl- (C18:1 ∆9 cis) und Elaidinsäure (C18:1 ∆9 trans) (ANON.2005)
S. 4
ABBILDUNG 2: Strukturvergleich von t10,c12- , c9,t11-CLA und Linolsäure
S. 5
ABBILDUNG 3: Biohydrogenierung von PUFA im Wiederkäuer
S.27 ABBILDUNG 4: Schematische Darstellung einer Versuchsperiode
S.47 ABBILDUNG 5: Dünnschichtchromatographischer Vergleich einer
Darmchymusfettprobe mit dem Mischstandard und einer veresterten Probe
S.62
ABBILDUNG 6: Isomerenverteilung der trans-Oktadecensäure
(tC18:1) im Darmchymusfett (0 ± SD)
S.89
ABBILDUNG 7: CLA-Isomeren-Verteilung im Darmchymusfett
(0 ± SD) S.90
ABBILDUNG 8: Isomerenverteilung der trans-Oktadecensäure (tC18:1) im Milchfett (nur die bei allen
Behandlungen vorkamen, 0 ± SD)
S.99
ABBILDUNG 9: Verteilung ausgewählter CLA-Isomeren im Milchfett (0 ± SD)
S.100 ABBILDUNG 10: Zusammenhang zwischen den Gehalten an
t11-C18:1 und CLA im Milchfett
S.101 ABBILDUNG 11: Vergleich der Mengen an tC18:1 im Darmchymus
(Tab.27) und im Milchfett (Tab.33), (unterschiedliche Buchstaben = P<0,05 bei Werten aus Tab.27: A, B und aus Tab.33: a, b)
S.129 ABBILDUNG 12: Vergleich der Mengen an CLA im Darmchymus-
(Tab.27) und im Milchfett (Tab.33), (unterschiedliche Buchstaben = P < 0,05 bei Werten aus Tab.27: A, B und aus Tab.33: a, b)
S.130 ABBILDUNG 13: Individuelle ∆9-Desaturase-Aktivitäten der einzelnen
Kühe (verschiedene Symbole) im Euter (beschrieben durch das C14:0/C14:1-Verhältnis im Milchfett)
S.132
TABELLENVERZEICHNIS
TABELLE 1: Entdeckungsgeschichte der CLA-Eigenschaften (KRAFT 2003)
S.10
TABELLE 2: Gesamt-tFA-Gehalt in verschiedenen Lebensmittelgruppen
(FRITSCHE u. STEINHART 1997)
S.21
TABELLE 3: Mittlerer c9,t11-CLA- und CLA-Gehalt in verschiedenen Lebensmittelgruppen(1FRITSCHE u. STEINHART 1998 und
2CHIN et al. 1992)
S.23
TABELLE 4: Diätische Faktoren mit Wirkung auf den CLA-Gehalt im Milchfett (modifiziert nach BAUMAN et al. 2001)
S.31
TABELLE 5: Beeinflussung der Biohydrogenierung durch die Fütterung von Fisch-, verschiedenen Pflanzenölen oder Talg
S.33
TABELLE 6: Beeinflussung der Biohydrogenierung durch die Fütterung
von ölhaltigen Samen
S.37 TABELLE 7: Beeinflussung der Biohydrogenierung durch unterschiedliche
Grundfutter-Kraftfutter-Verhältnisse in der Ration
S.39
TABELLE 8: Versuchsschema
S.46 TABELLE 9: Tägliche Milchleistung und Milchinhaltsstoffe der
Versuchstiere zu Versuchsbeginn (n=8)
S.48 TABELLE 10: Zusammensetzung der gefütterten Rationen in % bzw. kg T
S.49 TABELLE 11: Zusammensetzung des eingesetzten Kraftfutters
S.49 TABELLE 12: Rohnährstoffgehalte des eingesetzten Wiesenheus der 4
Versuchsperioden (n=1 pro Periode)
S.72
TABELLE 13: Mittlerer Fettsäurengehalt ausgewählter Fettsäuren im Wiesenheu (n=1 pro Periode)
S.73
TABELLE 14: Rohnährstoffgehalte des eingesetzten Kraftfutters der 4 Versuchsperioden (n=1 pro Periode)
S.73
TABELLE 15: Gehalt an ausgewählten Fettsäuren im Kraftfutter (n=1)
S.74
TABELLE 16: Gehalt an ausgewählten Fettsäuren im Leinöl (mg/g)
S.75
TABELLE 17: Mittlere tägliche Nährstoff- und Energieaufnahme der Milchkühe während der vier Versuchsperioden
S.76
TABELLE 18: Mittlere Menge an über das Futter verabreichten,
ausgewählten Fettsäuren
S.78
TABELLE 19: Einfluss der Rationsgestaltung auf den pH-Wert im
Pansensaft vor bzw. bis 300 min nach Fütterungsbeginn (n=6)
S.79
TABELLE 20: Einfluss der Rationsgestaltung auf die NH3-N-Konzentration im Pansensaft vor bzw. bis 300 min nach Fütterungsbeginn
S.80
TABELLE 21: Drei Stunden nach der Morgenfütterung ermittelte
Konzentration an SCFA sowie molare Anteile der einzelnen
SCFA im Pansensaft
S.81
TABELLE 22: Nährstofffluss am proximalen Duodenum
S.82
TABELLE 23: Darstellung des Flusses von Gesamt-Stickstoff (N) und Nicht-Ammoniak-Stickstoff (NAN) am Duodenum
S.83
TABELLE 24: Menge an fermentierter organischer Masse (FOM), nXP und UDP (unabgebautes Futterprotein), sowie Anteil des
mikrobiellen Proteins (MP) am Nicht-Ammoniak-Stickstoff (NAN) und Effizienz der mikrobiellen Protein-Synthese
S.85
TABELLE 25: Mittlere tägliche Milchleistung und Milchinhaltsstoffe
S.87 TABELLE 26: Fettsäurengehalte im Darmchymusfett (mg/g)
S.88 TABELLE 27: Mittlerer Fluss an Fettsäuren im Dünndarm (g/d)
S.91
TABELLE 28: Mittlerer Fluss der tC18:1- und CLA-Isomeren im
Dünndarm (g/d)
S.93
TABELLE 29: Fettsäurenanteile sowie einige ausgewählte Fettsäuren (in % der bestimmten Fettsäuren) im Plasma
S.95
TABELLE 30: Fettsäurenanteile sowie einige ausgewählte Fettsäuren (in % der bestimmten Fettsäuren) in den Erythrozyten
S.96
TABELLE 31: Mittlere Fettsäurenanteile im Milchfett (mg/g MF)
S.97
TABELLE 32: Vergleich des Fütterungseinflusses auf die de novo synthetisierten und die aus Vorstufen gebildeten
Fettsäuren (mg/g MF) sowie auf die Desaturaseaktivität
S.98 TABELLE 33: Mittlere tägliche mit der Milch sezernierte Menge an
Fettsäuren und einigen ausgewählten tC181- und
CLA-Isomeren (g/d)
S.102
TABELLE 34: Einfluss der Rationsgestaltung und der Leinölzulage auf
die Biohydrogenierung
S.121
ANHANGSVERZEICHNIS
ANHANG I: Zusammensetzung der Vitamin- und Mineralstoff-mischung für Milchkühe CIMBRIA 1101 ADE SUPER 5
S.179 ANHANG II: Zusammensetzung des rohen Leinöls (Protein-
Und Oelwerk Neuss GmbH & Co KG), Behandlungsstufe: roh, wasserentschleimt
S.179 ANHANG III: Zusammensetzung der Borsäure für die
NH3-N-Bestimmung im Pansensaft
(nach VOIGT u. STEGER 1967)
S.180 ANHANG IV: Bedingungen für die Gaschromatographie
S.180 ANHANG V: Fettsäurenverteilung im Kraftfutterfett und
im Leinöl (mg/g)
S.181 ANHANG VA: Mittlerer Fettsäurenverteilung im Wiesenheu (mg/g)
S.181 ANHANG VI: Fettsäurenverteilung im Darmchymusfett (mg/g)
S.182 ANHANG VIA: Einfluss des Rationstyps und der Leinölzulage auf
ausgewählte Isomeren der CLA und tC18:1 im Darmchymus (mg/g DF) und auf die tägliche Flussmenge an C18:0 (g/d)
S.183 ANHANG VII: Fettsäurenverteilung im Darmchymusfett (g/d)
S.184 ANHANG VIII: Fettsäurenverteilung im Milchfett (mg/g) S.185 ANHANG VIIIA: Einfluss des Rationstyps und der Leinölzulage
auf ausgewählte Isomeren der CLA
und tC18:1 (mg/g MF)
S.186 ANHANG VIIIB: Einfluss des Rationstyps und der Leinölzulage
auf ausgewählte Fettsäuren im Milchfett (mg/g MF)
S.187 ANHANG IX: Fettsäurenverteilung im Milchfett (g/d)
S.188 ANHANG X: Mittlere tägliche Milchleistung und Menge an
Milchinhaltsstoffen
S.189
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ACC Acetyl-CoA-Carboxylase
Ag+-HPLC Silberionen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie BHG Biohydrogenierung
BHG-Rate Biohydrogenierungsrate BMI body mass index
CHD koronare Herzerkrankungen
CLA konjugierte Linolsäuren (conjugated linoleic acid) COX Cyclooxygenase-Enzyme
d Tag
DB Doppelbindung
DF Darmchymusfett
d.h. dass heißt
DOM verdauliche organische Masse Evtl. eventuell
FA Fettsäuren
FABP Fettsäuren-bindendes Protein
FAL Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft FAS Fettsäurensynthase
FCM fettkorrigierte Milch (4% Fett) FID Flammenionisationsdetektor FOM fermentierbare organische Masse FSME Fettsäuremethylester
GC-FID Kapillargaschromatographie gekoppelt mit Flammenionisationsdetektor GF Grundfutter
Gew.-% Gewichtsprozent
GF:KF Grundfutter-Kraftfutter-Verhältnis GPAT Glycerolphosphat-Acyltransferase H Heu
H:KF Heu-Kraftfutter-Verhältnis
IST interner Standard KF Kraftfutter
LA Linolsäure
α-LA α-Linolensäure
LO Leinöl
LPL Lipoproteinlipase ME umsetzbare Energie MF Milchfett
MFD Milchfettdepression
min Minute
MJ Megajoule
MN mikrobieller Stickstoff MP mikrobielles Protein
MUFA einfach ungesättigte Fettsäuren N Gesamt-Stickstoff
n Stichprobenumfang NAN Nicht-Ammoniak-Stickstoff NDF neutral detergent fibre NEL Nettoenergie für Laktation NfE N-freie Extrakstoffe NH3 Ammoniak
NIRS Nahinfrarot-Reflexions-Spektroskopie OM organische Masse
nXP nutzbares Rohprotein
P Irrtumswahrscheinlichkeit PGE2 Prostaglandin E2
PPAR Peroxisomproliferator-aktivierte Rezeptor PSEM pooled standard error mean
PUFA mehrfach ungesättigte Fettsäuren RNB ruminale Stickstoffbilanz
s. siehe
SCD ∆9-Desaturase (Stearoyl-CoA-Desaturase) SCFA kurzkettige Fettsäuren
SCID “serve combined immunodeficiency”
SFA gesättigte Fettsäuren T Trockenmasse
TA Trockenmasseaufnahme TBME Tertiär-Butylmethylether
tC18:1 trans-Isomeren der Ölsäure (trans-Oktadecensäuren) tFA trans-Fettsäuren
tlw. teilweise
TNF-α Tumornekrosefator TMG Tetramethylguanidin TMR total mixed ration
TMSDAM Trimethylsilyl-Diazomethan tVA trans-Vaccensäure
u. und u.a. und andere
UDP im Pansen unabbaubares Rohprotein
XF Rpohfaser
XL Rohfett
XP Rohprotein
XX N-freie Extraktstoffe
0 ± SD Mittelwert plus Standardabweichung z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
∆9-Index ∆9-Desaturaseindex Σ CLA Gesamt-CLA
1.EINLEITUNG
Sowohl trans-Fettsäuren (tFA) als auch konjugierte Linolsäuren (CLA) werden vom Menschen über Lebensmittel aufgenommen, die Wiederkäuerfette enthalten (Kapitel 2.3.1.). Während trans-Fettsäuren zusätzlich in größerer Menge in industriell herge- stellten, partiell hydrogenierten Fetten vorkommen, stellt das Fett von Wiederkäuern, vornehmlich das Milchfett, die Hauptquelle für die CLA-Aufnahme dar. Das Vorkom- men konjugierter Doppelbindungen in Wiederkäuerprodukten wurde erstmals 1935 (BOOTH et al. 1935) beschrieben. HA et al. (1987) klassifizierten diese später als kon- jugierte Linolsäuren (conjugated linoleic acids, CLA). In Deutschland liegt die mittlere tFA-Aufnahme für Männer und Frauen bei 2,3 bzw. 1,9 g/d (FRITSCHE u. STEINHART
1997), während eine mittlere CLA-Aufnahme für Männer von 0,43 g und für Frauen von 0,35 g pro Tag berechnet wurde (FRITSCHE u. STEINHART 1998).
Obwohl CLA zu den trans-Fettsäuren gehören, scheinen trans-Fettsäuren und CLA unterschiedliche Wirkungen auf die menschliche Gesundheit zu besitzen. Während für tFA eher negative Effekte beschrieben werden, weisen zahlreiche Untersuchun- gen auf einen anscheinend eher positiven Einfluss von CLA hin. In einem Gutachten des Wissenschaftlichen Gremiums für diätetische Produkte, Ernährung und Allergien der europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA 2004) über trans- Fettsäuren in Lebensmitteln und deren Wirkung auf die menschliche Gesundheit wird angenommen, dass tFA den LDL-Cholesterinspiegel erhöhen und dadurch wahr- scheinlich auch das Risiko, an einer koronaren Herzkrankheit zu erkranken. Wissen- schaftliche Hinweise aus Humanstudien auf einen möglichen Zusammenhang zwi- schen der tFA-Aufnahme und Krebs, Diabetes mellitus Typ-2 oder Allergien werden dagegen als nicht überzeugend und widersprüchlich bewertet. Bezüglich der Wirkung von tFA auf den LDL-Cholesterinspiegel ist jedoch zu beachten, dass in geringerem Umfang auch gesättigte Fettsäuren den LDL-Cholesteringehalt steigern, jedoch unter normalen Ernährungsbedingungen deutlich mehr gesättigte Fettsäuren mit der Nah- rung aufgenommen werden als tFA.
CLA wird eine antikarzinogene, antidiabetogene, immunmodulierende und die Kör- perzusammensetzung beeinflussende Wirkung zugeschrieben, die hauptsächlich an Tiermodellen und Zelllinien erforscht wurde. Bei verschiedenen Untersuchungen am Menschen konnten keine unerwünschten Wirkungen von CLA auf die Gesundheit beobachtet werden (zum Beispiel: BERVEN et al. 2000, BLANKSON et al. 2000). Nach Einschätzung der EFSA (2004) ist jedoch zu bedenken, dass der Einsatz von CLA bei Humanstudien nicht zu einheitlichen Ergebnissen führte und die bisherigen Er- kenntnisse über gesundheitliche Auswirkungen der aktuellen Aufnahmemengen pro Tag (ca. 0,3 g CLA) nicht überzeugend und zum Teil widersprüchlich sind.
Trans-Fettsäuren und CLA entstehen im Pansen von Wiederkäuern bei der Biohy- drogenierung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren durch Pansenbakterien. Eine weitere Quelle für CLA ist die Milchdrüse, in der mit Hilfe der ∆9-Desaturase aus trans-Fettsäuren CLA gebildet werden können. In der Literatur weisen verschiedene Autoren darauf hin, dass es möglich ist, über die Fütterung und damit einhergehende Veränderungen des Pansenmilieus Einfluss auf die Biohydrogenierung und somit auf die Synthese von trans-Fettsäuren und CLA im Pansen zu nehmen. So kommt es zum Beispiel durch die Supplementierung mit mehrfach ungesättigten Fettsäuren, in Form von Ölen und ölhaltigen Samen, ebenso wie durch die Wahl verschiedener Fut- terkomponenten und Rationstypen zu unterschiedlichen Veränderungen der Kon- zentration an tFA (hauptsächlich tC18:1) und CLA im Milchfett. Häufig wird beim Ein- satz dieser Rationen zusätzlich ein Rückgang des Milchfettgehaltes beobachtet, für den trans-10 Mono- und -Diene verantwortlich gemacht werden. Diese entstehen ebenfalls bei der ruminalen Biohydrogenierung. Die Beziehungen zwischen der Rati- onsgestaltung, der Zulage von mehrfach ungesättigten Fettsäuren, dem Milchfettge- halt und der Fettsäurenverteilung im Milchfett sind sehr komplex und nur ansatzwei- se geklärt. Deshalb sind auch die Ergebnisse bezüglich Milchfettgehalt und –menge sowie Fettsäurenverteilung im Milchfett zum Teil sehr widersprüchlich. Daraus resul- tierte die Aufgabenstellung der vorliegenden Arbeit.
Ziel dieser Untersuchung war es, einen Beitrag zur Aufklärung der Zusammenhänge zwischen der Rationsgestaltung und der ruminalen Biohydrogenierung zu leisten. Mit Hilfe unterschiedlicher Grund-Kraftfutter-Relationen sollte der pH-Wert im Pansen beeinflusst und untersucht werden, wie sich dieser auf die Biohydrogenierung nach Zulage von Leinöl auswirkt und welchen Einfluss diese Zulage auf den Milchfettge- halt und das Fettsäurenmuster im Milchfett hat.
2.LITERATURÜBERSICHT UND ABLEITUNG DER AUFGABENSTELLUNG
2.1.CHEMIE UND NOMENKLATUR
2.1.1. TRANS-FETTSÄUREN
Bei trans-Fettsäuren handelt es sich um ungesättigte Fettsäuren mit einer speziellen räumlichen Struktur. Eine Doppelbindung lässt innerhalb des Moleküls eine starre Achse entstehen, um die sich die beiden Molekülreste - hier Wasserstoffatome - in zwei verschiedenen räumlichen Anordnungen orientieren können. Es entstehen trans- oder cis-Isomere. Bei der trans-Konfiguration stehen sich die Wasserstoffato- me diagonal gegenüber, während bei der cis-Konfiguration die Molekülreste auf einer Seite der Kohlenwasserstoffkette liegen (Abb. 1). Cis-konfigurierte Fettsäuren weisen eine 30° Krümmung der Kohlenwasserstoffkette auf, die eine dichte Packung der Moleküle verhindert (VOET U.VOET 1994, Abb. 1). Im Gegensatz dazu besitzen trans- Fettsäuren eine langgestreckte Struktur, können dementsprechend dichter gepackt werden und weisen einen höheren Schmelzpunkt als das entsprechende cis-Isomer auf. So erhöht sich der Schmelzpunkt der Ölsäure (C18:1 ∆9 cis) von 14°C auf 52°C für die Elaidinsäure (C18:1 ∆9 trans) (KUMMEROW 1991).
ABBILDUNG 1: Strukturvergleich von Öl- (C18:1 ∆9 cis) und Elaidinsäure (C18:1
∆9 trans) (ANON. 2005)
2.1.2.KONJUGIERTE LINOLSÄUREN (CLA)
CLA (conjugated linoleic acid) steht als Sammelbegriff für alle Isomeren der Octade- cadiensäure (C18:2), die eine konjugierte Doppelbindung besitzen. Die konjugierte Doppelbindung zeichnet sich durch das Fehlen einer isolierenden Methylgruppe zwi- schen den Doppelbindungen aus, wie sie zum Beispiel bei der Linolsäure (C18:2) vorhanden ist. CLA bestehen sowohl aus Positions- als auch aus geometrischen I- someren. Dabei sind 14 Positionsisomere denkbar, die konjugierte Doppelbindung kann entlang der Kohlenstoffkette an den Positionen 2,4 bis 15,17 theoretisch vor- kommen. Jede dieser Doppelbindungen kann cis,cis-, trans,trans-, cis,trans- oder trans,cis-konfiguriert im Molekül vorliegen, wodurch insgesamt die Bildung von 56 verschiedenen CLA-Isomeren möglich ist. Entlang der Kohlenstoffkette sind bisher folgende Doppelbindungen lokalisiert worden: 6,8; 7,9; 8,10; 9,11; 10,12; 11,13;
12,14 und 13,15 (FRITSCHE et al. 2001, ROACH et al. 2002). Zu den physiologisch be- deutendsten Isomeren gehören c9,t11- und t10,c12-CLA (Abb. 2).
ABBILDUNG 2: Strukturvergleich von t10,c12- , c9,t11-CLA und Linolsäure (STEINHART 1996)
t10,c12-CLA
c9,t11-CLA
Linolsäure (C18:2)
Konjugierte Doppelbindung
Isolierende Methylgruppe
2.2.PHYSIOLOGISCHE EIGENSCHAFTEN
2.2.1. TRANS-FETTSÄUREN
Epidemiologische und experimentelle Studien an Menschen in den frühen 90er Jah- ren berichteten von einem möglichen Zusammenhang zwischen einem erhöhten Konsum von trans-Fettsäuren (tFA) und dem ansteigendem Risiko für koronare Herzerkrankungen (CHD). Zusätzlich wurden trans-Fettsäuren mit weiteren negati- ven physiologischen Eigenschaften, wie z.B. geringe Membranfluidität, geringeres Geburtsgewicht von Frühgeborenen und Beitrag zur Insulin-Resistenz in Verbindung gebracht (JAHREIS u. BOCHMANN 1998).
2.2.1.1. Atherogene Wirkung
In zahlreichen epidemiologischen Studien und klinischen Versuchen konnte ein di- rekter Zusammenhang zwischen dem Gesamt- oder dem LDL-Cholesterinspiegel und dem Auftreten von koronaren Herzerkrankungen aufgezeigt werden (u.a. SMITH
et al. 1992, LAW u. WALD 1994), wobei vor allem ein hohes LDL/HDL-Verhältnis mit einem erhöhten Risiko verbunden sein soll (ABBOTT et al. 1988). Es zeigte sich in Humanstudien, dass mit der Nahrung aufgenommene trans-Fettsäuren das LDL- Cholesterin erhöhen und gleichzeitig zu einer Abnahme des HDL-Cholesterins füh- ren, wodurch ein ungünstigeres LDL/HDL-Verhältnis entsteht (MENSINK u. KATAN
1990,JUDD et al. 1994, ZOCK 1995). Des Weiteren scheinen tFA Einfluss auf das Li- poprotein a (Lp[a]) zu nehmen, welches atherogene und thrombogene Potenz auf- weist und als Indikator für ein erhöhtes CHD-Risiko steht.NESTEL et al. (1992) konn- ten durch die Gabe einer Elaidinsäure-reichen Diät an Männer eine signifikante Er- höhung des Lp[a]-Spiegels feststellen. Ähnliche Ergebnisse erhielten auch MENSINK
et al. (1992), sie wiesen bei gesunden Männern und Frauen einen Anstieg des Se- rum Lp[a]-Spiegels nach, wenn diese eine tFA-Diät erhielten. Ein günstiger Effekt auf den Serum-Lipoprotein-Spiegel ergab sich bei Diäten, die nur wenig gesättigte und trans-Fettsäuren (< 0,5 trans-Fettsäuren/100 g Fett) enthielten (LICHTENSTEIN et al.
1999). In einer Fall-Kontroll-Studie, die einen evtl. Zusammenhang zwischen Auf- nahme und Einlagerung von tFA in das Fettgewebe und dem Auftreten von Myokard- infarkten aufzeigen sollte, schlussfolgerten CLIFTON et al. (2004), dass das Vorhan- densein von tFA im Fettgewebe mit einem erhöhten Risiko an den Herzkranzgefäßen zu erkranken einherging. Des Weiteren erhöht eine tFA-Diät bei einem gleichzeitigen Mangel an Magnesium das Risiko der Calcifizierung von humanen, arteriellen Endo- thelzellen (KUMMEROW et al. 1999). Der Calciumeinstrom in arterielle Endothelzellen gilt als ein Kennzeichen für die Arterienverkalkung. In einer weiteren epidemiologi- schen Studie wurde der Zusammenhang zwischen der Aufnahme von tFA und dem Risiko, einen Herzstillstand zu erleiden, untersucht. Hierbei konnte nur ein moderater Anstieg des Risikos bei trans-Isomeren der Ölsäure, jedoch ein stärkerer Anstieg des Risikos im Bezug auf trans-Isomeren der Linolsäure festgestellt werden (LEMAITRE et al. 2002). Auch in älteren Ernährungsstudien zum Einfluss von tFA auf Blutlipide in Kaninchen (GOTTENBOS 1983) oder in Menschen (MATTSON et al.1975) schien zu- mindest kein Unterschied zwischen cis- und trans-Fettsäuren zu bestehen. Die Mehrheit der Studien zeigte jedoch einen entsprechenden Einfluss der tFA auf das CHD-Risiko (PIETINEN et al. 1997, OOMEN et al. 2001).
2.2.1.2. Karzinogene Wirkung
Der Einfluss von trans-Fettsäuren auf die Krebsentwicklung wird kontrovers disku- tiert. Ältere Studien weisen auf einen epidemiologischen Zusammenhang zwischen einer erhöhten Aufnahme an tFA und der Inzidienz von Tumorerkrankungen hin (zum Beispiel ENIG et al. 1978). Ebenso scheint eine Verbindung zwischen im Fettgewebe gespeicherten tFA und nach den Wechseljahren auftretendem Brustkrebs bei euro- päischen Frauen zu bestehen (KOHLMEIER et al. 1997). In einer weiteren epidemiolo- gischen Studie wurde jedoch kein Zusammenhang zwischen der Höhe der Aufnahme von tFA und der Inzidenz von Kolon-Krebs bei Männern beobachtet, während ein schwach positiver Zusammenhang bei Frauen nachgewiesen wurde (SLATTERY et al.
2001). Auch bewertet die EFSA (2004) die wissenschaftlichen Hinweise aus den
Humanstudien als nicht überzeugend. Ebenso konnte mit Hilfe von Tierversuchen kein eindeutiger Hinweis auf diesen vermeintlichen Zusammenhang hergestellt wer- den. In einem Tumormodell mit chemisch-induzierten Mammatumorzellen in Ratten war kein Unterschied zwischen der mit tFA und der mit cis-Fettsäuren gefütterten Gruppe in Bezug auf die Tumorgenese festzustellen (SELENSKAS et al. 1984). Dies gilt auch für die Tumorwachstumsrate oder die Endgröße von subkutan implantierten Mammatumorzellen in Mäusen (ERICKSON et al. 1984).
2.2.1.3. Diabetogene Wirkung
Ein Zusammenhang zwischen der Aufnahme von trans-Fettsäuren und einer Erkran- kung an Diabetes mellitus Typ-2 fand sich sowohl in epidemiologischen als auch in experimentellen Studien. Nach Einschätzung der EFSA (2004) sind die epidemiolo- gischen Beweise jedoch zu widersprüchlich, um einen möglichen Zusammenhang zwischen der Aufnahme von tFA und der Erkrankung an Diabetes mellitus Typ-2 zu bestätigen.
In einer humanen Ernährungsstudie mit Probanden, die übergewichtig und an Diabe- tes mellitus Typ-2 erkrankt waren, konnte eine Erhöhung des postprandialen Insulin- spiegels mit konstanter Glukosekonzentration im Serum bei einer tFA-Diät beobach- tet werden (CHRISTIANSEN et al. 1997). Einen eher ungünstigen Einfluss auf den Glu- kosemetabolismus und die Insulinresistenz von tFA stellten auch HU et al. (2001) bei ihren Untersuchungen fest. Bei der Inkubation von Murinen-β-Zellen mit tFA wurde zudem eine höhere maximale Sekretion von Insulin ausgelöst als bei den mit cis- Fettsäuren inkubierten Zellen (ALSTRUP et al. 1999). In einer humanen Ernährungs- studie von LEFEVRE et al. (1999) zeigte sich, dass bei Probanden mit einer Elaidin- säure-Diät signifikant höhere Insulinspiegel notwendig waren, um den gleichen Glu- kose-Status im Blut aufrecht zu erhalten, als bei der Ölsäure-Gruppe. Dies resultierte in einem höheren Insulin/Glukose-Verhältnis und suggerierte, dass tFA anscheinend eine akute Insulinresistenz induzieren können. Der Verdacht, dass tFA das Risiko, an Diabetes mellitus Typ-2 zu erkranken, erhöhen, führte zu der Forderung von Wissen-
schaftlern, gerade im Hinblick auf die Aufnahme der tFA durch Kinder, den tFA- Gehalt in Lebensmitteln zu deklarieren und zu reduzieren (DEMMELMAIR et al. 1996).
LOUHERANTA et al. (1999) dagegen konnten einen Effekt von tFA auf den Glukose- und Insulin-Metabolismus bei jungen Frauen nicht bestätigen. Bei einer Kohorten- Studie an Krankenschwestern in der USA erhöhten tFA das Risiko an Typ-2 Diabe- tes zu erkranken (SALMERÓN et al. 2001), jedoch zeigte eine Analyse der Untergrup- pen, dass die Effekte hauptsächlich bei übergewichtigen Frauen beobachtet wurden, welche an sich schon eine höhere Insulin-Resistenz aufweisen als nicht übergewich- tige Frauen (EFSA2004).
2.2.1.4. Weitere physiologische Wirkungen
Zwei ältere epidemiologische Studien (GUTHY 1982, 1983) deuten auf einen Zusam- menhang zwischen der Aufnahme von tFA und Morbus Crohn hin. Ferner scheinen tFA die Zusammensetzung der Zellmembran zu verändern, wobei eine Modifizierung der Membraneigenschaften nicht ausgeschlossen wird (HØY U. HØLMER 1979), wie z.B. die Steigerung der Viskosität (ENGELHARD et al. 1976). Ebenso führen tFA durch die Beeinflussung des Metabolismus von essentiellen Fettsäuren zu einem veränder- ten Muster der mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA) in den Strukturlipiden von Leber und Herz (HILL et al. 1982). KOLETZKO (1991) dokumentierte einen plazentären Transfer der tFA von der Mutter zum Fetus und belegte, dass Kleinkinder diese in endogene Lipide, subkutanes Fettgewebe und Zellmembranen inkorporieren. Eine weitere Studie zeigte, dass das Geburtsgewicht von Frühgeborenen umso niedriger ausfiel, je höher der Gehalt an tFA im Plasma war (KOLETZKO 1992a,JENDRYCZKO et al. 1993). Eine Störung des intrauterinen Wachstums erschien deshalb möglich(KO- LETZKO 1991). Es bestand außerdem eine negative Korrelation zwischen dem tFA- Spiegel und dem n-3 und n-6 PUFA-Gehalt bzw. dem Substrat/Produkt-Verhältnis der PUFA-Biosynthese im Blut (KOLETZKO 1992). DECSI et al. (2001) und ELIAS u. IN- NIS (2001) konnten dagegen keine negative Korrelation zwischen dem Geburtsge- wicht und der Geburtslänge und dem tFA-Spiegel im Plasma von Neugeborenen
feststellen. Um die Zusammenhänge besser beurteilen zu können, scheinen weitere Untersuchungen in Bezug auf die Wirkung von tFA auf das fötale und frühkindliche Wachstum notwendig zu sein (EFSA 2004).
2.2.2.KONJUGIERTE LINOLSÄUREN (CLA)
CLA-Isomeren sind unter physikalischen und chemischen Gesichtspunkten der Gruppe der trans-Fettsäuren zuzuordnen. Zahlreiche Untersuchungen, hauptsächlich an Zelllinien und Tiermodellen, weisen darauf hin, dass CLA einen Einfluss auf den Stoffwechsel ausüben (Tab. 1). Bei verschiedenen Untersuchungen am Menschen konnten keine unerwünschten Wirkungen von CLA auf die Gesundheit beobachtet werden (zum Beispiel: BERVEN et al. 2000, BLANKSON et al. 2000, BENITO et al.
2001a,b), jedoch ist nach der EFSA(2004)zu bedenken, dass der Einsatz von CLA bei Humanstudien nicht zu einheitlichen Ergebnissen führte und die bisherigen Er- kenntnisse über gesundheitliche Auswirkungen der aktuellen Aufnahmemengen pro Tag (ca. 0,3 g CLA) nicht überzeugend und widersprüchlich sind. Zudem werden in der Literatur unterschiedliche Effekte von CLA in Abhängigkeit von der im Experi- ment verwendeten Tierart, den eingesetzten Dosen und den verwendeten CLA- Isomeren beschrieben.
TABELLE 1: Entdeckungsgeschichte der CLA-Eigenschaften (KRAFT 2003)
Jahr Physiologische Wirkung
1987 Antikanzerogene Eigenschaften (HA et al. 1987) 1993 Immunmodulierende Eigenschaften (COOK et al. 1993) 1994 Antiatherogene Eigenschaften (LEE et al. 1994) 1995 Anabole Eigenschaften (PARK et al. 1995)
1997 Modulation der Knochenmasse (SEIFERT U.WATKINS 1997) 1998 Antidiabetogene Eigenschaften (HOUSEKNECHt et al. 1998) 1999 Antithrombotische Eigenschaften (TRUITT et al. 1999)
Die in der Tab. 1 beschriebenen physiologischen Eigenschaften sollen in den nach- folgenden Kapiteln näher erläutert werden.
2.2.2.1. Karzinogene Wirkung
Zahlreiche Untersuchungen belegen die antikanzerogenen Eigenschaften von diä- tisch verabreichten CLA anhand verschiedenster experimenteller Modelle der Krebs- forschung.
CLA (Mischung mit c9,t11-, t10,c12-, t9,t11-, und t10,c12-CLA als Hauptisomeren) wirkte zum Beispiel inhibierend auf die Entstehung von Hauttumoren und Neoplasien im vorderen Abschnitt des Magens von Mäusen (HA et al. 1987,1990). Ebenso wurde durch synthetisch hergestelltes CLA die Entwicklung von chemisch induzierten Mamma- und Kolontumoren bei Ratten gehemmt (IP et al. 1991, LIEW et al. 1995). IP
et al. (1991) kamen zu dem Ergebnis, dass der schützende Effekt von CLA bei der Entwicklung von Mammatumoren eine Dosisabhängigkeit aufweist. Bei einem Gehalt von bis zu 1% in der Diät (Gew-%, keine genauere Beschreibung der Aufnahme in der Literatur vorhanden) trat ein Schutzeffekt auf, der jedoch bei Erhöhung des CLA- Levels auf über 1% nicht gesteigert wurde. Nach der Transplantation von Brustkrebs- und humanen Prostata-Karzinom-Zellen in SCID-Mäuse, konnte eine Wachstumsre- duzierung der Krebszellen und eine geringere Metastasenbildung in der Lunge der Tiere festgestellt werden, die eine Diät mit 1% CLA-Zusatz erhielten (VISONNEAU et al. 1997,CESANO et al. 1998). Die Wirkung von CLA in der Brustkrebsprävention war sowohl unabhängig von der Menge oder der Art des in der Diät verwendeten Fettes (IP et al. 1996) als auch davon, ob die CLA in Form von freien Fettsäuren oder an Triacylglyceride gebunden im Fett vorlagen (IP et al. 1995). In einer Studie, bei der humanes Brustfettgewebe von Patientinnen, dass zum Zeitpunkt der operativen Ent- fernung von Karzinomen oder benignen Tumoren gewonnen und nach Alter, Meno- pause und BMI (body mass index) ausgewertet wurde, stellte sich eine reziproke Verbindung zwischen dem CLA-Gehalt im Brustfettgewebe und dem Brustkrebsrisiko dar (BOUGNOUX et al. 1999). Die antikanzerogene Wirksamkeit von c9,t11- und
t10,c12-CLA wurden von IP et al. (2002) durch Beobachtung der Reduktion von pre- malignen Läsionen und Karzinomen in der Milchdrüse von Ratten verglichen. Dabei konnte eine starke Ähnlichkeit der beiden CLA-Isomeren in ihrer antikanzerogenen Aktivität bei einer 0,5%igen Dosis in der Diät festgestellt werden. Bei der Inkubation von humanen, mammären MCF-7-Krebszellen mit c9,t11- bzw. t10,c12-CLA dage- gen zeigten sich deutliche Unterschiede in der Wirksamkeit. Während sich beim Ein- satz von c9,t11-CLA eine signifikante Reduzierung der Zellzahlen zeigte, hatte das t10,c12-Isomer keinen Einfluss auf das Wachstum der MCF-7-Zellen (O´SHEA et al.
2000).
Zur Zeit existieren verschiedene Erklärungsansätze, wie der antikanzerogene Effekt der CLA-Isomeren zustande kommt. IP et al. (1999) konnten durch die Nutzung eines physiologischen Modells nachweisen, dass CLA das Wachstum mammärer epithelia- ler Zellorganellen gesunder Ratten in Primärkultur hemmt. Dieser Effekt wurde durch eine Reduzierung der DNA-Synthese und einer Stimulation der Zellapoptose vermit- telt. Es konnte demonstriert werden, dass CLA einen direkten Einfluss auf das mammäre Epithelium haben. Als eine weitere Erklärung der antikanzerogenen Wir- kung wird das Verhältnis zwischen CLA und der Eicosanoid-Synthese erwähnt. Das Tumorzellwachstum scheint durch die Produkte der Cyclooxygenase, wie z.B. das PGE2, beeinflusst zu werden (KARMALI 1980). Ebenso wird von einer positiven Relati- on zwischen dem Level von PGE2 und der Tumorförderung und -entwicklung berich- tet. In experimentellen Tierstudien führt diätisches zugeführtes CLA zu einer Reduk- tion der PGE2-Synthese. WHIGHAM et al. (2001) zeigten, dass bei CLA gefütterten Meerschweinchen die Freisetzung von Histamin und PGE2 aus der sensibilisierten Trachea bei Antigenkontakt(Typ-I-Reaktion) signifikant reduziert war. Bei einem Ver- such von LIU u. BELURY (1998) kam es durch gefüttertes CLA zu einer Reduzierung von chemisch-induzierten Hauttumoren bei Mäusen, welche mit einer Abnahme der Arachidonsäure-Konzentration und einer geringeren PGE2-Synthese in den Keratino- zyten dieser Tiere einherging. Des Weiteren scheint eine Verbindung zwischen CLA und Peroxisomproliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR) im Hinblick auf die Anti- kanzerogenität zu bestehen. Bei PPAR handelt es sich um einen Steroidhormon- Rezeptor, der eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der Lipid-Homöostase sowie der
Metabolisierung von Arzneimitteln und von Umweltgiften spielt. MOYA-CAMARENA et al. (1999a,1999b) konnten nachweisen, dass sowohl in Sprague-Dawley-Ratten als auch in FaO-Rattenleberzellen eine Aktivierung des PPARα durch c9,t11-CLA her- vorgerufen wird. Der Ligand c9,t11-CLA zeigte dabei eine hohe Affinität zu dem PPARα und induzierte eine Erhöhung der mRNA-Level verschiedener Enzyme in den FaO-Rattenleberzellen. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass CLA regulie- rend in den Fettstoffwechsel eingreifen und so einen positiven Effekt auf metaboli- sche Störungen, die durch einen beeinträchtigten Fettstoffwechsel hervorgerufen werden können, wie z.B. Krebs, Arteriosklerose, Fettsucht und Diabetes mellitus Typ II, ausüben (MOYA-CAMARENA et al. 1999b).
Jedoch ist zu bedenken, dass die hier gezeigten Ergebnisse auf Experimenten an Tiermodellen oder an Zelllinien beruhen. Es ist fraglich, inwieweit die beschriebenen Zusammenhänge auf den Menschen zu übertragen sind. Zum anderen scheinen verschiedene CLA-Isomeren bei unterschiedlichen Spezies anders zu wirken. Wäh- rend IP et al. (2002) eine starke Ähnlichkeit zwischen der antikanzerogenen Wirkung von c9,t11- und t10,c12-CLA bei Ratten feststellten, konnten O´SHEA et al. (2000) bei humanen Krebszellen diese nur für c9,t11-CLA beobachten. Dies scheint ebenfalls die Übertragbarkeit auf den Menschen in Frage zu stellen.
2.2.2.2. Metabolische Wirkung
PARK et al. (1997) berichteten als erstes über den Einfluss von diätisch verabreich- tem CLA (Gemisch c9,t11- und t10,c12-CLA, 50:50) auf die Körperzusammenset- zung von Mäusen. Bei den mit 0,5% CLA gefütterten Tieren (5 g CLA in 1000 g Fut- ter, ad libitum Aufnahme) kam es zu einer signifikanten Reduzierung des Körperfet- tes, gekoppelt mit einer größeren fettfreien Körpermasse (lean body mass) relativ zu der Kontrollgruppe. Es gibt in der Literatur überzeugende Hinweise, dass Verände- rungen in der Körperzusammensetzung auf das t10,c12-CLA Isomer zurückzuführen sind (DEDECKERE et al. 1999, PARK et al. 1999b). Ein Erklärungsansatz für die Verrin- gerung des Körperfettes ist eine reduzierte Fettsäurenaufnahme durch Adipozyten,
die wiederum von dem Effekt der CLA auf die Stearoyl-CoA-Desaturase (SCD)(LEE
et al.1998, CHOI et al. 2000, SMITH et al. 2002) und die Lipoprotein-Lipase (PARK et al.1997,1999b) abhängig zu sein scheint. t10,c12-CLA vermindert wahrscheinlich sowohl die Genexpression (CHOI et al. 2000) als auch die Aktivität der SCD (PARK et al. 2000). Bei Zugabe des t10,c12-Isomers zu gezüchteten 3T3-L1-Adipozyten kam es zu einer signifikanten Reduzierung der Lipoprotein-Lipase-Aktivität und zu einer Abnahme der intrazellulären Konzentration von Triacylglycerin und Glycerin (PARK et al. 1999b). TSUBOYAMA-KASAOKA et al. (2000) berichteten hingegen bei einer Diät mit 1% CLA (mit ca. 36% t10,c12-CLA-Anteil in der Mischung) von einer Lipodystrophie, die mit einer Apoptose von Adipozyten einherging. Zusätzlich wurde eine deutliche Erhöhung des Tumornekrosefaktors (TNF-α), welcher Apoptose in Adipozyten indu- ziert, und des Entkopplungsproteins-2 (UCP-2) festgestellt.
Bei der Entstehung des Fettgewebes sind die Präadipozyten die vorherrschenden Zellen; nur Präadipozyten können proliferieren, differenzieren und mit Triacylglyceri- den gefüllt werden. CLA nahmen in vitro Einfluss auf die Adipozytengenese, indem Proliferation (SATORY u. SMITH 1999) und Differenzierung (BRODIE et al. 1999) der Präadipozyten gehemmt wurden. SATORY u. SMITH (1999) stellten dabei den oben beschriebenen cytotoxischen Effekt von CLA auf Adipozyten nicht fest. Ebenso inte- ressant ist die Tatsache, dass CLA bei einem Fütterungsversuch an wachsenden, weiblichen Ratten nicht die Adipozytenzahl, sondern deren Größe verminderte (AZAIN
et al. 2000). Bei Schweinen führte diätisch zugesetztes CLA zu einer Abnahme des subkutanen, aber zu einer Zunahme des intramuskulären Fettes (DUGAN u. AALHUS
1999). Betrachtet man die bisher aufgeführten Ergebnisse für die Wirkung von CLA, so ist es möglich, dass der Einfluss auf einen Adipozyten von dessen Lokalisation und Mikroumwelt abhängt (PARIZA et al. 2001).
In Humanstudien sind unterschiedliche Wirkungen von CLA auf das Körperfett und die fettfreie Körpermasse bekannt. BLANKSON et al. (2000) führten eine Studie durch, bei der übergewichtige oder fettleibige Personen CLA-Dosen (c9,t11- und t10,c12- CLA zu gleichen Teilen) von 1,7 bis 6,8 g pro Tag über 12 Wochen erhielten. Dabei konnte eine signifikante Reduzierung der Körperfettmasse (body fat mass) in den CLA-Gruppen im Gegensatz zu der Placebo-Gruppe festgestellt werden. Ein Unter-
schied hinsichtlich der fettfreien Körpermasse, des BMI oder der Blut-Lipide zwi- schen den Gruppen war nicht zu beobachten. Ebenso ist eine signifikante Reduzie- rung der Menge an Körperfett bei einer Studie an normalgewichtigen Personen mit einer täglichen Dosis von 1,8 g CLA zu erwähnen, bei der das Körpergewicht eben- falls nicht signifikant verändert worden ist (THOM et al. 2001). Die Gabe von CLA an Männer, die Ausdauersport betrieben, zeigte keine signifikanten Veränderungen der Körpermasse, des prozentualen Körperfettgehaltes oder der Menge an Fettfreier Körpermasse (KREIDER et al. 1999).
Neuere Untersuchungen zeigen, dass c9,t11-CLA wahrscheinlich für ein gesteigertes Wachstum verantwortlich ist, während das t10,c12-Isomer für die Abnahme von Kör- perfett verantwortlich gemacht wird (PARIZA et al. 2001). Dabei wird eine Beeinflus- sung der fettreduzierenden Eigenschaft des t10,c12-Isomers durch das c9,t11- Isomer ausgeschlossen (COOK et al. 1999). Ob eine Beeinflussung der Wachstums- stimulation und der verbesserten Futtereffizienz, die mit dem c9,t11-Isomer assoziiert war, durch das t10,c12-Isomer besteht, bleibt zu diskutieren (PARIZA et al. 2001).
Welpen von erstgebärenden weiblichen Ratten zeigten ein höheres postnatales Kör- pergewicht, wenn den Muttertieren CLA während der Trächtigkeit und Laktation ge- füttert wurde. Die Fortsetzung der CLA-Supplementation nach der Entwöhnung resul- tierte in einem signifikant höheren Zuwachs und einer verbesserten Futtereffizienz im Vergleich zu den Kontrolltieren (CHIN et al. 1994). Eine Reduktion der Menge an Kör- perfett und einen gleichzeitigen signifikanten Anstieg der Menge an Körperprotein bei Mäusen stellten PARK et al. (1997) bei einem Anteil von 0,5% CLA in der Diät fest.
Obwohl die Körpergewichte in den Gruppen nicht unterschiedlich waren, zeigte die CLA-Gruppe eine signifikant verbesserte Futtereffizienz. Ähnliche Ergebnisse erziel- ten auch DELANY et al. (1999). Relative und absolute Veränderungen in der Körper- fettmasse (reduziert in CLA gefütterten Mäusen) und relative Veränderungen im Ge- samt-Körperprotein und –Wasser (gesteigert in CLA gefütterten Mäusen) waren bei PARK et al. (1999a) zu beobachten, wobei der Effekt von CLA (c9,t11- und t10,c12- CLA zu gleichen Teilen in der Diät) auf das Gesamtkörperprotein wahrscheinlich der Reduktion des Gesamtkörperfettes vorausging.
Neuere Untersuchungen und klinische Studien lassen die Vermutung zu, dass diä- tisch verabreichte Lipide einen Einfluss auf die Knochenentwicklung und den Knor- pelstoffwechsel besitzen. WATKINS et al.(1996) berichteten von einer höheren Kno- chenwachstumsrate bei Hühnern, denen größere Mengen an n-6- und n-3- Fettsäuren verabreicht wurden. Bei mit 52 g Butter + 18 g Maiskeimöl gefütterten Hühnern (erhöhte Aufnahme von CLA) war die erhöhte Knochenwachstumsrate gleichzeitig mit einem reduzierten Arachidonsäurelevel und einer verringerten ex vivo PGE2-Produktion der Tibia sowie mit einem erhöhten IGF-1-Wert im Knochen ver- bunden (WATKINS et al. 1997). Es wird spekuliert, dass CLA auf die Cyclooxygenase- Enzyme (COX) - speziell die COX-2 - und somit auf die PGE2-Produktion im Kno- chen einwirkt (WATKINS et al. 1999). Ebenso wird von der Möglichkeit berichtet, dass CLA durch weitere Desaturation und Elongation zu konjugierten C20:4 Isomeren umgeformt werden (SÉBÉDIO et al. 1997). Diese wiederum könnten die Aktivität der COX-Enzyme ebenfalls beeinflussen (WATKINS et al. 1999).
Die dargestellten zahlreichen Studien, sowohl aus dem Tier als auch aus dem Hu- manbereich, zeigen eindrucksvoll, dass t10,c12-CLA massiv in den Fettstoffwechsel eingreifen können. Viele molekularbiologische Wirkungsmechanismen sind bis heute nicht vollständig geklärt. Auch konnten RISÉRUS et al. 2002 eine signifikante Zunah- me der Insulinresistenz beim Menschen, sowie Hyperglykämie und eine Reduzierung des HDL-Cholesterols bei der Gabe von 3,4 g t10,c12-CLA/d bei gleichzeitiger Ab- nahme des Körperfettes nachweisen, was für eine kritische Bewertung der Wirkung von CLA auf die menschliche Gesundheit spricht (EFSA 2004). Es ist jedoch zu be- denken, dass diese Aufnahme weit über der üblichen Tagesaufnahme von CLA in Europa lag.
2.2.2.3. Immunmodulierende Wirkung
Die während einer Immunantwort produzierten Zytokine steigern die Immunzellproli- feration, haben auf der anderen Seite jedoch auch einen katabolen Effekt auf nicht-
lymphoides Gewebe. Interleukin-1, ein von Monocyten gebildetetes immunregulie- rendes Peptid, führt zu einem Anstieg des Cholecystokinins, was die Nahrungsauf- nahme und die Magenentleerung unterdrückt und somit eine Anorexie begünstigt (DAUN U.MCCHARTY 1993). Zur Untersuchung der Hypothese, dass CLA immunindu- zierten Gewichtsverlust verhindert, führten COOK et al. (1993) CLA- Fütterungsversuche mit Hühnern und Ratten durch, denen Endotoxine (Lipopolysac- charid (LPS)) injiziert wurden. Die mit 0,5% CLA-gefütterten Hühner wiesen einen signifikant geringeren Gewichtsverlust auf als die Kontrollgruppe. Auch bei den Rat- ten war der Gewichtsverlust der CLA-Tiere nur halb so hoch wie der der Kontrolltiere.
Bei der intraperitonealen Injektion von Kaninchen-Anti-Schaferythrozyten wiesen die CLA gefütterten Hühner und die Kontrolltiere ähnliche Antikörperantworten auf, wäh- rend bei den Ratten eine gesteigerte Phagozytoseaktivität der Makrophagen beo- bachtet werden konnte. Ähnliche Ergebnisse konnten MILLER et al. (1994) an Mäusen nachweisen. Eine Immunsuppression wurde bei den mit 0,5% CLA gefütterten Tieren ebenfalls verhindert. CLA-gefütterte Hühner, Meerschweinchen und Mäuse weisen ebenfalls einen Anstieg der CD4+-Lymphozyten auf (DEVONEY et al. 1997).
CLA haben eventuell auch einen Einfluss auf allergische Reaktionswege, indem sie die Immunglobuline (Ig) im Serum verändern. Die Konzentrationen von IgA, IgG and IgM waren gesteigert, währenddessen IgE, beteiligt an anaphylaktischen Reaktionen, in Serum und Milz-Lymphozyten von CLA (1 g/100 g Futter) gefütterten Ratten ver- mindert war (SUGANO et al. 1998). Bei einer Humanstudie konnte unter CLA-Einfluss keine Veränderung der Anzahl der Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten und der Lymphozyten-Proliferation festgestellt werden. In einem anderen Experiment, bei einer Gabe von c9,t11- und t10,c12-CLA (50:50) und einer anschließenden Vakzina- tion mit Hepatitis B wies die CLA-Gruppe einen signifikant höheren Antikörper-Level auf als die Kontrollgruppe; andere Parameter der Immunantwort wie die Aktivität der natürlichen Killerzellen, die Lymphozyten-Proliferation und die Produktion von TNF-α und anderen Zytokine waren nicht beeinflusst (ALBERS et al. 2003). Um den Einfluss von CLA auf autoimmune Erkrankungen, hier Lupus erythematodes, zu erforschen, wurden NZB/W F1 Mäuse mit CLA (Hauptisomere der Mischung: c9,t11- und t10,c12-CLA) gefüttert. Die Entstehung der Proteinurie wurde zwar beschleunigt,
gleichzeitig konnte allerdings ein deutlich geringerer Gewichtsverlust zwischen dem Beginn der Proteinurie und dem Tod und eine Verlängerung dieses Zeitraumes in der CLA-Gruppe beobachtet werden. Dies suggeriert, dass CLA in einem späteren Sta- dium der Krankheit die Symptome von Lupus erythematodes verzögert (YANG et al.
2000). Bei einer Untersuchung des Einflusses von 0,25% CLA auf die Freisetzung von Leukotrienen und Prostaglandinen in sensibilisierten Meerschweinchen-Lungen und -Luftröhren nach Antigenkontakt wurde eine signifikante Reduzierung dieser festgestellt. Ein positiver Einfluss von CLA bei klinischen Erkrankungen, die auf eine allergische Reaktion vom Soforttyp beruhen, wäre hierbei denkbar (WHIGHAM et al.
2000).
2.2.2.4. Atherogene Wirkung
Eine weitere Rolle scheint CLA in Bezug auf die Arteriosklerose zu spielen. Bei der Arteriosklerose handelt es sich um einen multikausalen Prozess, der durch Perfusi- onsstörungen und Mikrothrombosen an den Gefäßwänden, sowie diverse Arten von Hypo- und Hypertonien, Hyperkalzämien und Hyperlipämien bedingt wird.
Gesamt-, Low Density Lipoprotein (LDL) und Triacylglyceride waren bei CLA gefüt- terten Kaninchen geringer. Das Verhältnis von LDL zu High Density Lipoprotein (HDL) war in dieser Gruppe gleichzeitig signifikant reduziert (geringeres Arterioskle- rose-Risiko) und die Aorten wiesen weniger Arteriosklerose auf (LEE et al. 1994). Zu ähnlichen Ergebnissen kamen KRITCHEVSKY et al. (2000). 0,1 % CLA in der Diät von Kaninchen führten zu einer verminderten Atherogenese, während 1% CLA in der Diät zu einem substantiellen Rückgang (30%) von Arteriosklerose führte. In einem Mo- dellversuch an Hamstern konnte für das t10,c12-Isomer, nicht jedoch für c9,t11-CLA, eine verringernde Wirkung auf LDL und HDL (DEDECKERE et al. 1999) bzw. Gesamt- Cholesterin festgestellt werden (GAVINO et al. 2000). Eine Studie an C57BL/6 Mäu- sen führte zu widersprüchlichen Ergebnissen. Trotz einer signifikanten Reduzierung der Triacylglyceride wiesen die CLA gefütterten Tiere eine Zunahme des HDL/Gesamt-Cholesterin-Verhältnisses und signifikant größere Areale mit Einlage-
rung von Fettstreifen in der Aorta auf (MUNDAY et al. 1999). Bei einer Humanstudie zur Untersuchung des Effektes von CLA auf Lipoproteine im Plasma und die Fettsäu- renzusammensetzung im Gewebe trat im Gegensatz zu den erwähnten Versuchen an Tieren keine Veränderung des Plasmalevels von Cholesterin, LDL, HDL und Tria- cylglyceriden auf (BENITO et al. 2001b). Auch BLANKSON et al. (2001) und SMEDMAN u.
VESSBY (2001) konnten in klinischen Humanstudien, bei denen Konzentrationen von 1,7 bis 6,8 g CLA pro Tag verabreicht wurden, keine Effekte auf die Konzentration der Blutfette nachweisen.
In Bezug auf den antiatherogenen Effekt von CLA könnte auch die verminderte Pro- duktion von Thromboxan (WHIGHAM et al. 2000) und die verminderte Thrombozyte- naggregation (TRUITT et al. 1999) durch CLA eine Rolle spielen. In einem in vitro Ex- periment inhibierten c9,t11- und t10,c12-CLA eine durch Arachidonsäure, Kollagen oder Thrombin induzierte Thrombozytenaggregation. Einen Einfluss auf die Blutge- rinnung und die Thrombozytenaggregation beim Menschen konnten BENITO et al (2001a) dagegen nicht feststellen. Auch hier zeigen sich beim Wirkungsvergleich von CLA bei Tier- und Humanstudien deutliche Unterschiede. Weiterer Forschungsbedarf scheint vorhanden, um Aussagen darüber treffen zu können, ob CLA auch beim Menschen eine antiatherogene Wirkung besitzt.
2.2.2.5. Diabetogene Wirkung
Zurzeit gibt es in Deutschland ca. 8 Millionen Patienten mit diagnostiziertem Diabetes mellitus Typ-2, der sich durch eine Insulinresistenz, einen relativen Insulinmangel und einem postprandial erhöhten Blutglucosespiegel auszeichnet. Bei etwa 95% aller Diabetes-Erkankungen handelt es sich dabei um Diabetes mellitus Typ-2 (RÖHRIG
2004).
Die antidiabetogenen Eigenschaften von CLA werden kontrovers diskutiert. ZDF- Ratten (Zucker Diabetic Fatty fa/fa Rats) zeigten eine Normalisierung der gesteiger- ten Glukosetoleranz und eine Verbesserung der Hyperinsulinämie, die bei CLA- Supplementierung mit einer Aktivierung des PPAR-γ einherging (HOUSEKNECHT et al.
1998). Ebenfalls an Ratten untersuchten RYDER et al. (2001), ob ein Wirkungsunter- schied zwischen den CLA-Isomeren besteht. Dafür wurde eine Diät mit c9,t11- und t10,c12-CLA (50:50) und eine reine c9,t11-CLA–Diät verwendet. Eine Reduzierung der Fettleibigkeit sowie eine Verbesserung der Glukosetoleranz, des insulinstimulier- ten Glukosetransports und der Glykogensynthase-Aktivität im Skelettmuskel war nur bei den 50:50 gefütterten ZDF-Ratten zu beobachten. Bei einer weiteren Studie stell- te sich dagegen eine deutliche Insulinresistenz bei Mäusen, mit gesteigerten Insulin- werten im Blut, durch den Einfluss von CLA heraus (TSUBOYAMA-KASAOKA et al.
2000). In einer Humanstudie, bei der fettleibige Männer entweder ein CLA-Gemisch oder reines t10,c12-CLA (3,4 g/d) verabreicht bekamen, konnte ebenfalls in der CLA- Gruppe eine erhöhte Insulinresistenz und Hyperglykämie, einhergehend mit einer erniedrigten HDL Konzentration im Serum nachgewiesen werden (RISERUS et al.
2002). Die hier beschriebenen unerwünschten Wirkungen von t10,c12-CLA auf den Lipid- und Glukosestoffwechsel und die Insulinresistenz beim Menschen bei einer Dosis, die jedoch zwei- bis dreimal höher als die geschätzte Tagesaufnahme (Euro- pa: ca. 0,3 g/d) lag, zeigt, dass weiterer Forschungsbedarf vorhanden ist, um die ge- sundheitlichen Wirkungen von CLA auf den Menschen sicher beurteilen zu können (EFSA 2004).
2.3.QUELLEN UND SYNTHESE
2.3.1.VORKOMMEN IN LEBENSMITTELN –AUFNAHME DURCH DEN MENSCHEN
2.3.1.1. trans-Fettsäuren
Die Aufnahme von trans-Fettsäuren erfolgt hauptsächlich über zwei Gruppen von Lebensmitteln. Trans-Fettsäuren kommen auf der einen Seite in gehärteten Pflan- zenfetten, wie z.B. Margarine, Frittier- und Backfetten bzw. in Lebensmitteln mit ge- härteten oder teilweise gehärteten Pflanzenfetten (PRECHT u. MOLKENTIN 1997) vor, auf der anderen Seite sind sie in Wiederkäuerfetten bzw. in daraus hergestellten Le- bensmitteln (WOLFF 1994, 1995) enthalten. Im Milchfett werden dabei trans- Hexadecensäuren, trans-Isomere der Linol- und Linolensäure sowie hauptsächlich
