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Ulrike Schwittlick Hannover 2013
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1. Auflage 2013
© 2013 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-190-5
Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17
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Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen von Histaminrezeptoren am kaninen Darm und bei Hunden mit chronischen
idiopathischen Darmentzündungen
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Ulrike Schwittlick
Rostock
Hannover 2013
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Marion Hewicker-Trautwein Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med vet. Marion Hewicker-Trautwein 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. Korinna Huber
Tag der mündlichen Prüfung: 21.11.2013
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 3
2.1 Aufbau, Funktion und Histologie des kaninen Gastrointestinaltraktes ...3
2.1.1 Magen ...4
2.1.2 Dünndarm ...5
2.1.2.1 Duodenum ... 6
2.1.2.2 Jejunum ... 6
2.1.2.3 Ileum ... 6
2.1.3 Dickdarm und Analkanal ...6
2.2 Das Immunsystem des Gastrointestinaltraktes ...7
2.2.1 Physikalische und chemische Barrieren ...7
2.2.2 Immunologische Barrieren ...8
2.2.3 Orale Toleranz ... 11
2.3 Inflammatory bowel disease ... 12
2.3.1 Definition, klinische Symptome, Diagnostik und Differentialdiagnosen ... 12
2.3.2 Erscheinungsformen der kaninen IBD ... 14
2.3.3 Pathogenese der IBD ... 17
2.3.3.1 Immunpathologische Krankheitseinflüsse ... 17
2.3.3.2 Diätetische und mikrobielle Einflüsse ... 21
2.3.3.3 Genetische Krankheitseinflüsse ... 22
2.4 Histaminrezeptoren im Gastrointestinaltrakt ... 23
2.4.1 Funktionelle Aspekte von Histaminrezeptoren im Gastrointestinaltrakt ... 25
2.4.1.1 Gastrointestinale Motilität ... 26
2.4.1.2 Sekretion ... 28
2.4.1.3 Sekretion von Magensäure und Schleimhautschutz ... 28
2.4.1.4 Intestinale Hämodynamik und vaskuläre Permeabilität ... 29
2.4.1.5 Immunmodulation ... 30
2.4.2 Histaminrezeptoren im kaninen Gastrointestinaltrakt ... 32
2.4.3 Histaminrezeptoren bei IBD und anderen Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes ... 34
2.5 Immunhistochemische Methoden und deren Limitationen ... 37
2.5.1 Prinzip der Immunhistochemie und deren Fehlerquellen ... 37
2.5.2 Probleme der immunhistochemischen Darstellung im Falle des Histaminrezeptors 4 ... 41
3 Material und Methoden ...45
3.1 Untersuchungsmaterial ... 45
3.1.1 Kontrollhundegruppe ... 45
3.1.2 Hunde mit entzündlichen Läsionen des Gastrointestinaltraktes ... 48
3.1.2.1 Hunde mit lymphoplasmazellulären entzündlichen Läsionen des Gastrointestinaltraktes ... 48
3.1.2.2 Hunde mit eosinophilen entzündlichen Läsionen des Gastrointestinaltraktes ... 49
3.1.3 Altersabhängige Gruppeneinteilung ... 50
3.2 Aufarbeitung und Färbung der Gewebeproben ... 50
3.2.1 Fixierung und Aufarbeitung der Gewebeproben ... 50
3.2.2 Übersichtsfärbung ... 51
3.3 Immunhistochemische Reaktionen ... 51
3.3.1 Antikörper und Seren ... 51
3.3.2 Verstärkungsreaktion ... 52
3.3.3 Unspezifische Hintergrundfärbung ... 53
3.3.4 Kontrollen ... 54
3.3.5 Protokoll der immunhistochemischen Reaktionen ... 55
3.4 In situ-Hybridisierung ... 57
3.4.1 Herstellung der Sonde ... 57
3.4.1.1 RNA-Isolierung und Reverse Transkription ... 58
3.4.1.2 Primer ... 58
3.4.1.3 PCR und Gelelektrophorese ... 58
3.4.1.4 Klonierung und Isolierung der Plasmid-DNA ... 59
3.4.1.5 Kontrollen der Zielsequenz ... 59
3.4.1.6 PCR der Plasmidprodukte und Aufreinigung ... 60
3.4.1.7 Labelling der Sonden mit DIG ... 60
3.4.2 Durchführung der in situ-Hybridisierung ... 60
3.4.2.1 Material und Kontrollen ... 61
3.4.2.2 Protokoll der in situ-Hybridisierung ... 61
3.5 Auswertung und Dokumentation ... 64
3.5.1 Lichtmikroskopische Beurteilung ... 64
3.5.2 Auswertung der immunhistochemischen Reaktionen ... 64
3.5.3 Auswertung der in situ-Hybridisierung ... 65
3.5.4 Fotografische Dokumentation ... 65
3.5.5 Statistische Auswertung ... 65
4 Ergebnisse ...67
4.1 Pathologisch-anatomische und histopathologische Befunde der untersuchten Hunde... 67
4.1.1 Makroskopische und histopathologische Befunde der Kontrollhunde ... 67
4.1.2 Histopathologische Befunde der Hunde mit entzündlichen Läsionen des Gastrointestinaltraktes ... 68
4.1.3 Histopathologische Scores der untersuchten Hunde ... 68
4.2 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen ... 70
4.2.1 Kontrollen und Absorptionsreaktionen ... 70
4.2.2 Expression der Histaminrezeptoren 1, 2 und 4 bei den Kontrolltieren ... 73
4.2.2.1 Expression von Histaminrezeptor 1 ... 73
4.2.2.1.1 Expression von H1R im Magen ... 73
4.2.2.1.2 Expression von H1R im Dünndarm ... 74
4.2.2.1.3 Expression von H1R im Dickdarm ... 75
4.2.2.2 Expression von Histaminrezeptor 2 ... 80
4.2.2.2.1 Expression von H2R im Magen ... 80
4.2.2.2.2 Expression von H2R im Dünndarm ... 81
4.2.2.2.3 Expression von H2R im Dickdarm ... 83
4.2.2.3 Expression von Histaminrezeptor 4 ... 89
4.2.2.3.1 Expression von H4R im Magen ... 89
4.2.2.3.2 Expression von H4R im Dünndarm ... 90
4.2.2.3.3 Expression von H4R im Dickdarm ... 92
4.2.2.4 Zusammenfassung der immunhistochemischen Expressionsmuster von H1R, H2R und H4R bei den Kontrollhunden ... 96
4.2.2.5 Vergleich der immunhistochemischen Histaminrezeptorexpression bei gesunden Kontrolltieren verschiedener Altersstufen ... 97
4.2.2.5.1 Histaminrezeptor 1 bei den gesunden Kontrolltieren ... 97
4.2.2.5.2 Histaminrezeptor 2 bei den gesunden Kontrolltieren ... 100
4.2.2.5.3 Histaminrezeptor 4 bei den gesunden Kontrolltieren ... 101
4.2.2.5.4 Zusammenfassung ... 102
4.2.3 Expression von Histaminrezeptor 1, 2 und 4 bei Hunden mit entzündlichen Läsionen des Gastrointestinaltraktes ... 103
4.2.3.1 Vergleich der Expression des Histaminrezeptors 1 bei den Kontrolltieren und bei Hunden mit IBD ... 104
4.2.3.2 Vergleich der Expression des Histaminrezeptors 2 bei den Kontrolltieren und bei Hunden mit IBD ... 106
4.2.3.3 Vergleich der Expression des Histaminrezeptors 4 bei den Kontrolltieren und bei Hunden mit IBD ... 111
4.2.3.4 Korrelation ... 113
4.2.3.5 Zusammenfassung ... 114
4.4 Ergebnisse der in situ-Hybridisierung ... 116
4.4.1 Expression von H4R-mRNA im Dünn- und Dickdarm von Kontrollhunden und in Bioptaten von Hunden mit IBD ... 117
4.4.2 Kontrollen bei der in situ-Hybridisierung ... 123
5 Diskussion ...125
5.1 Expression von H1R, H2R und H4R im Gastrointestinaltrakt... 125
5.2 Expression von H1R, H2R und H4R bei Hunden mit inflammatory bowel disease ... 138
5.3 Methodische Aspekte der immunhistochemischen Darstellung von Histaminrezeptoren unter besonderer Betrachtung des H4R ... 143
5.4 Darstellung des H4R mittels in situ-Hybridisierung ... 146
5.5 Schlussbetrachtung... 149
6 Zusammenfassung ...151
7 Summary ...153
8 Literaturverzeichnis ...155
9 Anhang ...175
9.1 Angaben zu den untersuchten Hunden ... 175
9.2 Ergebnisse der eigenen Untersuchungen ... 178
9.3 Angaben zu den Ergebnissen der statistischen Untersuchungen ... 184
9.4 Angaben zur in situ-Hybridisierung ... 190
9.5 Färbeprotokoll der HE-Färbung im Färbegerät (Leica ST4040) ... 191
9.6 Lösungen und Materialien für die in situ-Hybridisierung ... 191
9.7 Bezugsquellen für Antikörper, Kits, Materialien, Geräte und Chemikalien ... 194
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
ABC Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex
AEC 3-Amino-9-Ethyl-Carbazole
Aqua bidest. Aqua bidestillata
Aqua dest. Aqua destillata
BSA bovines Serumalbumin
bp base pairs (Basenpaare)
bT biotylinisiertes Thyramin
bzw. beziehungsweise
cDNA englisch complemetary DNA (komplementäre DNA)
C Cytosin
°C Grad Celsius
CD englisch cluster of differentiation
(Differenzierungscluster)
DIG Digoxigenin
DNA englisch desoxyribonucleic acid
(Desoxyribonukleinsäure)
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EGE eosinophile Gastroenteritis
et al. Lateinisch et alii (und andere)
g Gramm
G Guanin
GALT englisch gut-associated lymphoid tissue (Darm- assoziiertes lymphatisches Gewebe)
ggr. geringgradig
HE Hämatoxylin-Eosin
hgr. hochgradig
H1R Histaminrezeptor 1
H2R Histaminrezeptor 2
H3R Histaminrezeptor 3
H4R Histaminrezeptor 4
HUC englisch histiocytic ulcerative colitis (histiozytäre, ulzerative Kolitis)
IBD englisch inflammatory bowel disease
IHC Immunhistochemie
IFN-γ Interferon-γ
IgG Immunglobulin G
IL Interleukin
ISH in situ-Hybridisierung
J Jahre
lfd. Nr. laufende Nummer
LPE lymphoplasmazelluläre Enteritis
M Molarität
m männlich
mg Milligramm
mgr. mittelgradig
mk männlich-kastriert
ml Milliliter
Mo Monate
mRNA messenger RNA
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
n Anzahl
NB Nebenbefund
n.u. nicht untersucht
Nr. Nummer
obB ohne besonderen Befund
PAMP englisch: pathogen-associated molecular pattern (Pathogen-assoziierte molekulare Muster)
PBS englisch phosphate-buffered saline (Phosphat- gepufferte Kochsalzlösung)
PCR englisch polymerase chain reaction (Polymerase- Kettenreaktion)
RNA englisch ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) RT-PCR englisch reverse transcriptase polymerase chain
reaction (Reverse Transkriptase-Polymerase- Kettenreaktion)
T Thymin
TGF-β englisch transforming-growth factor β
TLR englisch toll-like receptor (Toll-ähnlicher Rezeptor)
TNF-α Tumor-Nekrose-Faktor-α
U Uracil
w weiblich
wk weiblich-kastriert
WSAVA englisch World Small Animal Veterinary Association
z.B. zum Beispiel
1 Einleitung
Bei der inflammatory bowel disease (IBD) des Hundes handelt es sich um eine chronische, idiopathische Enteropathie, die mit langanhaltenden oder rezidivierenden gastrointestinalen Symptomen wie Durchfall, Erbrechen und Abmagerung einhergeht. Der idiopathische Charakter dieser Erkrankung begründet sich durch den diagnostischen Ausschluss zahlreicher erregerbedingter und allergischer Differenzialdiagnosen sowie durch die bislang unbekannte Ätiologie und nicht vollständig geklärte Pathogenese dieses Krankheitskomplexes. Zahlreiche Forschungsergebnisse aus Human- und Veterinärmedizin deuten auf immunpathologische Dysregulationen, Umweltfaktoren und genetische Komponenten hin, die zur Entstehung der IBD beitragen. Dabei stehen intestinale Mastzellen und Histamin, als einer ihrer Hauptmediatoren, im Fokus vieler Fragestellungen. Histamin vermittelt seine Wirkung über vier bisher beschriebene Histaminrezeptoren (H1R, H2R, H3R, H4R) und ist beteiligt an der Regulation und Modulation zahlreicher Funktionen im Gastrointestinaltrakt. Nur wenige, fast ausschließlich humanmedizinische Untersuchungen haben sich mit der Expression und pathogenetischen Rolle von Histaminrezeptoren bei chronischen entzündlichen Darmerkrankungen beschäftigt. Dabei zeigt sich eine veränderte Expression von H1R und H2R bei verschiedenen Krankheitsbildern, während H3R im Gastrointestinaltrakt anscheinend eine untergeordnete Rolle spielt. Der erst kürzlich beschriebene H4R ist vor allem für immunmodulatorische Vorgänge von Bedeutung, zeigt jedoch keine Veränderung der Expression bei entzündlichen Enteropathien des Menschen.
Ziel dieser Arbeit war die Beschreibung des Expressionsmusters von H1R, H2R und H4R im kaninen Magendarmtrakt bezüglich ihrer anatomischen und zellulären Lokalisation mittels immunhistochemischer Methodik. Es wurde anhand einer semiquantitativen Untersuchung der Expressionsintensität, ein Vergleich der Expressionslevel bei gesunden Kontrolltieren und Hunden mit IBD vorgenommen.
Während der im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführten Untersuchungen erschien eine wissenschaftliche Arbeit, welche die Spezifität von polyklonalen Antikörpern gegen den humanen und murinen H4R in Frage stellt. Deshalb wurde
zusätzlich eine in situ-Hybridisierung zur Darstellung der H4R-mRNA im kaninen Darm und zur Identifizierung der H4R-exprimierenden Zellen etabliert.
2 Literaturübersicht
2.1 Aufbau, Funktion und Histologie des kaninen Gastrointestinaltraktes
Der Verdauungstrakt des Hundes kann in Kopf-, Vorder-, Mittel- und Enddarm sowie den Canalis analis eingeteilt werden (NICKEL et al. 2004). Mundhöhle und Pharynx gehören zum Kopfdarm. Ösophagus und Magen sind dem Vorderdarm zuzurechnen.
Der Dünndarm, bestehend aus drei Abschnitten, Duodenum, Jejunum und Ileum, gehört zum Mitteldarm, während die Dickdarmabschnitte Zäkum, Kolon und Rektum sowie der Afterkanal und After den Enddarm bilden (NICKEL et al. 2004).
Die Aufgaben des Verdauungssystems reichen von der Aufnahme der Nahrung und deren Transport, Zerkleinerung sowie enzymatischer Aufschließung, der Überführung von Energieträger-, Bau-, Nähr- und Wirkstoffen in den Körperkreislauf bis hin zur Ausscheidung des unverdaulichen Darminhalts (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998). Des Weiteren erfüllt der Gastrointestinaltrakt eine Barrierefunktion und stellt in seiner Gesamtheit flächenmäßig das größte, lymphatische Organ des Körpers dar (GEBBERS und LAISSUE 1989).
Der histologische Wandaufbau des gesamten Intestinaltraktes folgt einem einheitlichen Prinzip. Die Schleimhaut (Tunica mucosa) setzt sich zusammen aus dem Epithel (Epithelium mucosae), dem darunterliegenden Schleimhautbindegewebe (Lamina propria mucosae) und einer schmalen mukosalen Muskelschicht (Lamina muscularis mucosae) (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010). Angrenzend findet sich eine ausgeprägte, Blut- und Lymphgefäße, sowie den Plexus submucosus enthaltende Bindegewebsschicht (Tela submucosa), die als Verschiebe- und Verbundschicht der zweischichtigen Darmmuskulatur (Tunica muscularis mit Stratum circulare und Stratum longitudinale) aufliegt. Zwischen Zirkulär- und Längsschicht der Tunica muscularis befinden sich neben Gefäßstrukturen auch die neuronalen Strukturen des Plexus myentericus (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010). Die Tunica serosa bildet mit
dem mesothelialen Serosaepithel und der darunterliegenden Serosabindegewebsschicht (Lamina propria serosae) die äußere Abgrenzung des Darmrohres (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010).
Auf lokale Besonderheiten der Anatomie und Histologie der einzelnen Abschnitte wird im Folgenden kurz eingegangen.
2.1.1 Magen
Die Aufgabe des Magens liegt in der Futterspeicherung und Vorverdauung der Ingesta durch die Magensäure. Der Hund hat einen einhöhligen, einfachen Magen, der vollständig durch eine drüsenhaltige Schleimhaut (Pars glandularis) ausgekleidet ist (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010). Die Magenschleimhaut zeigt eine diffuse Felderung, die Areae gastricae, von denen aus die Magengrübchen (Foveolae gastricae) in die Tiefe ziehen. Die Pars glandularis wird weiterhin in eine Kardiadrüsen-, Fundusdrüsen und Pylorusdrüsenzone unterteilt (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010). Das einschichtige, hochprismatische Epithel des Magens enthält viele schleimproduzierende Zellen, deren Sekrete vor der selbstverdauenden Wirkung der Magensäure schützen. Die Kardiadrüsen, welche sich in einer ringförmigen Zone am Mageneingang befinden, produzieren ein exokrines, alkalisches, Lysozym-haltiges, schleimiges Sekret (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010). Der Magenfundus und –korpus besteht aus dicht gelagerten und langgestreckten Schlauchdrüsen. Diese Fundusdrüsen werden in verschiedene Abschnitte eingeteilt und zeigen charakteristische Wandzellpopulationen (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010). Der Isthmus enthält nicht ausgereifte Isthmusepithelzellen, die als Ersatzzellen der oberflächlichen Epithelzellen sowie zur Schleimproduktion dienen. Im Halsbereich der Fundusdrüsen finden sich die einzeln oder in kleinen Gruppen gelegenen Nebenzellen, die ein saures, Glykosaminoglykan-haltiges Sekret absondern. Im Mittelstück sowie im Drüsengrund finden sich in großer Zahl sekretorisch aktive Hauptzellen sowie die prominenten Belegzellen, deren Aufgabe in der Salzsäureproduktion und in der Synthese eines Intrinsic-Faktors zur Reabsorption
von Vitamin B12 liegen. Zusätzlich finden sich hier Zellen des enteroendokrinen Systems (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010).
Der Pylorusbereich ist durch stark verästelte und geknäulte Pylorusdrüsen und intraepithelial gelegene, endokrine, Gastrin-produzierende Zellen gekennzeichnet (LIEBICH 2010). Die Magenwand zeigt bei Fleischfressern eine verhältnismäßig prominente, durch Kreuzung der Muskelfasern dreischichtig erscheinende Schleimhautmuskelschicht (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998). Weiterhin findet sich als Besonderheit des Karnivorenmagens ein Stratum subglandulare, welches zwischen Drüsengrund und Schleimhautmuskulatur lokalisiert ist und aus zwei Anteilen besteht (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998). Das Stratum granulosum enthält zahlreiche Lymphozyten und Plasmazellen, während das Stratum compactum aus einer dichten Formation aus kollagenen Bindegewebsfasern besteht (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998).
2.1.2 Dünndarm
Der Dünndarm zeichnet sich durch das Vorhandensein von Schleimhautzotten (Villi intestinales) und unverzeigten, schlauchförmigen Drüsen (Glandulae intestinales, Lieberkühn-Drüsen, Krypten) aus. Diese vergrößern die Schleimhautoberfläche und unterstützen damit die Dünndarmfunktion, welche in der Verdauung der Ingesta sowie Aufspaltung und Absorption der Nährstoffe besteht (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010). Das einschichtige, hochprismatische Dünndarmepithel zeigt einen dichten Mikrovillibesatz und unterliegt durch ständige, mitotische Teilung der undifferenzierten Epithelzellen am Grund der Darmdrüsen einer permanenten Regeneration. Des Weiteren finden sich im Epithel auch zytoprotektiven Schleim produzierende Becherzellen und Sekretgranula-haltige, endokrine Zellen, welche intraepithelial im Kryptbereich liegen und ihre Produkte inkretorisch an das subepitheliale Kapillarnetz abgeben (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010). Paneth-Zellen fehlen beim Fleischfresser (BANKS 1993; LIEBICH 2010). Die Lamina propria mucosae bildet die bindegewebige Grundlage für die Darmzotten und enthält in großer Zahl und
unterschiedlicher Dichte Immunzellen, während sich in der Tela submucosa teils ausgeprägte, lymphatische Aggregate (Peyer-Platten) finden (LIEBICH 2010).
2.1.2.1 Duodenum
In diesem Abschnitt des Dünndarms finden sich submukosal vorwiegend tubuläre Drüsenstrukturen (Brunner-Drüsen), die ein visköses, glykoproteinreiches, alkalisches Sekret produzieren, welches Pufferwirkung gegen den sauren Magensaft besitzt und damit schleimhautprotektiv wirkt. Beim Hund finden sich diese Drüsenstrukturen, im Gegensatz zur anatomischen Ausdehnung des Duodenums vom Pylorus bis zur Flexura duodenojejunalis, jedoch nur auf einer Strecke von 1,5 bis 2 cm (LIEBICH 2010; NICKEL et al. 2004).
2.1.2.2 Jejunum
Das Jejunum ist der längste Dünndarmabschnitt. Es beginnt mit der Flexura duodenojejunalis am kranialen Ende der Plica duodenocolica und endet am freien Ende der Plica ileocaecalis (NICKEL et al. 2004). Histologisch sind die Darmzotten länger, schlanker und weniger dicht als im Duodenum und es finden sich vergleichsweise mehr intraepitheliale Becherzellen (BANKS 1993; LIEBICH 2010).
2.1.2.3 Ileum
Das kurze Ileum ist der Endabschnitt des Dünndarms und erstreckt sich vom oralen Ende der Plica ileocaecalis bis zum Ostium ileale, welches die Einmündung in den Dickdarm darstellt (NICKEL et al. 2004). Im Vergleich zu den anderen Dünndarmabschnitten sind die Zotten des Ileums kürzer und breiter und das Epithel weist vermehrt Becherzellen auf (LIEBICH 2010). In der Tela submucosa des Ileums finden sich prominente Peyer-Platten, welche in die Lamina propria mucosae reichen, die Zotten verdrängen und sich ins Darmlumen vorwölben können. Diese lymphatischen Aggregate dienen der lokalen Immunabwehr (LIEBICH 2010).
2.1.3 Dickdarm und Analkanal
Der Dickdarm umfasst Zäkum, Kolon und Rektum und dient funktionell der mikrobiellen Aufspaltung von Proteinen und Kohlenhydraten sowie der Wasser- und
Elektrolytresorption (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010). Im gesamten Dickdarm gibt es keine Darmzotten. Die Schleimhaut besteht aus einem oberflächlichen, hochprismatischen Epithel aus mit Mikrovilli besetzten Saumzellen und langgestreckten, unverzweigten und dicht nebeneinander liegenden Drüsenstrukturen. Das Epithel der Dickdarmdrüsen zeichnet sich durch eine große Anzahl von Becherzellen aus und unterliegt einer ständigen Regeneration. Auch im Dickdarm finden sich vereinzelt lymphatische Aggregate (WEYRAUCH und SCHMOLLICH 1998; LIEBICH 2010).
Der Analkanal ist gekennzeichnet durch den Übergang einer echten, durch prominente Längsfalten eingestülpten Schleimhaut in eine drüsenlose Schleimhaut und schließlich in die äußere Haut. Des Weiteren finden sich in diesem Bereich Analdrüsen, Zirkumanaldrüsen und die apokrinen Drüsen des Analbeutels (LIEBICH 2010).
2.2 Das Immunsystem des Gastrointestinaltraktes
Als epitheliale Oberfläche des Körpers ist gerade die Schleimhaut des Magen-Darm- Traktes einer großen Zahl von Antigenen, auch nicht pathogener Natur, ausgesetzt (JUNGI 2000; STOKES und WALY 2006; MURPHY et al. 2009a). Dabei fungiert das intestinale Epithel sowohl als physikalische als auch als immunologische Barriere (SANSONETTI 2004). Das mukosale Immunsystem verfügt neben besonderen anatomischen Merkmalen (Kompartimente aus diffusem Lymphgewebe in der Lamina propria mucosae, organisierte lymphatische Strukturen wie Peyer-Platten und isolierte Lymphfollikel) auch über spezielle Effektormechanismen und immunregulatorische Funktionen (MURPHY et al. 2009a).
2.2.1 Physikalische und chemische Barrieren
Das Epithel des Gastrointestinaltraktes wirkt vor allem durch feste Zell-Zell- Verbindungen (tight junctions) der Epithelzellen, durch die Produktion visköser Flüssigkeiten (Mukus) und den Mechanismus der Peristaltik als physikalische Barriere gegen infektiöse Erreger (STOKES und WALY 2006; MURPHY et al. 2009b;
SUCHODOLSKI 2011). Diese epitheliale Barriere besitzt eine hohe Regenerationsfähigkeit durch schnell teilungsfähige Kryptepithelzellen, die in Richtung Zottenspitze migrieren (SANSONETTI 2004). Weiterhin existiert auf der Oberfläche des Darms eine kommensale Bakterienflora, die im Sinne einer kompetitiven Hemmung mit pathogenen Mikroorganismen um Nährstoffe und Anheftungsstellen auf der Epitheloberfläche konkurriert (MURPHY et al. 2009b;
SUCHODOLSKI 2011).
Zusätzlich wirkt der saure pH im Magen des Gastointestinaltraktes als chemische Barriere (MURPHY et al. 2009b). Verdauungsenzyme aus dem Pankreas zerlegen die Nahrungsproteine, sodass nur wenige intakte Proteine mit der Mukosa in Kontakt kommen (ALLENSPACH und GASCHEN 2003). Die von Becherzellen im Dünn- und Dickdarm produzierte Mukusschicht enthält Muzine, die mit Oberflächenpolysacchariden und Proteinen bakterieller Organismen interagieren und diese in der Schleimschicht halten. Die Peristaltik des Magendarmtraktes ermöglicht den Abtransport vom Mukus und potentieller bakterieller Noxen (SANSONETTI 2004).
2.2.2 Immunologische Barrieren
Die immunologischen Verteidigungsmechanismen bestehen aus dem Zusammenwirken von Komponenten der unspezifischen bzw. angeborenen und der adaptiven bzw. erworbenen Immunabwehr.
Wichtige Effektoren der unspezifischen Immunität sind antimikrobiell wirksame Peptide, mononukleäre Phagozyten (Makrophagen), neutrophile Granulozyten, dendritische Zellen, γδ-T-Zellen und natural killer-(NK)-Zellen (SANSONETTI 2004;
STOKES und WALY 2006).
Antimikrobielle Peptide (host defense peptides), wie Cathelicidin sowie α- und β- Defensine, interagieren mit den Membranen bakterieller Erreger und können zur Lyse dieser führen (SANSONETTI 2004). Während beim Menschen insbesondere die α-Defensine in den Paneth-Zellen des Dünndarms produziert werden, erfolgt die Synthese von Defensinen bei Kaniden, die keine Paneth-Zellen besitzen, in
Makrophagen, zirkulierenden neutrophilen Granulozyten und Dünndarmepithelzellen (SANDOW und WHITEHEAD 1979; SANSONETTI 2004; LINDE et al. 2007).
Funktionell wirken antimikrobielle Peptide chemotaktisch auf Immunzellen, fördern deren transepitheliale Migration und verstärken die zytotoxische Wirkung von NK- Zellen (LINDE et al. 2007).
Makrophagen können über Oberflächenrezeptoren wie Mannose- und Glucanrezeptoren, den Scavenger-Rezeptor und Lipopolysacharidrezeptoren (CD14) Pathogene erkennen, phagozytieren und abtöten sowie in der Folge proinflammatorische Zytokine wie Interleukine (IL-1β, IL-6) und Tumornekrosefaktor- α (TNF-α) freisetzen, die zur Rekrutierung weiterer Immunzellen führen (MURPHY et al. 2009b).
Eine Rekrutierung und Migration von neutrophilen Granulozyten erfolgt durch Ausschüttung von IL-8 und PEEC (pathogen-elicited epithelial chemoattractant) von Darmepithelzellen im Falle einer mikrobiellen Invasion oder Kolonisation. Ein Teil der neutrophilen Granulozyten gelangt auch in das Darmlumen und übt dort ihre antibakterielle Funktion aus (SANSONETTI 2004).
Die NK-Zellen und die intraepithelialen γδ-T-Zellen werden der Gruppe der innate like-Lymphozyten zugeordnet und sind in der Lage, schnell Zytokine zu produzieren (MURPHY et al. 2009b).
Nicht zuletzt spielen spezifische Rezeptoren von Epithelzellen und dendritischen Zellen, wie zellmembranständige und endosomale toll-like Rezeptoren und zytosomale NOD-Proteine zur Detektion von pathogenen Strukturen (PAMP, pathogen-associated molecular pattern) eine wichtige Rolle im Rahmen von Erkennungs- und Signaltransduktionsmechanismen der unspezifischen Immunabwehr und induzieren über den NFκB-Signalweg die Produktion von Chemokinen und Zytokinen (SANSONETTI 2004; MURPHY et al. 2009b).
Im Gastrointestinaltrakt existiert neben den Immunzellen der Lamina propria mucosae ein spezifisches lymphatisches Gewebe, bestehend aus Peyer-Platten und
isolierten Lymphfollikeln, welches als MALT (mucosa-associated lymphoid tissue) oder auch GALT (gut-associated lymphoid tissue) bezeichnet wird (ALLENSPACH und GASCHEN 2003; ALLENSPACH 2011). Im Rahmen der adaptiven Immunabwehr erfolgt hier die Antigenaufnahme über die M-Zellen des follikelassoziierten Epithels. Mittels Transzytose erfolgt eine Weiterleitung an subepithelial gelegene, Antigen-präsentierende Zellen (Makrophagen, Lymphozyten und dendritische Zellen) und nachfolgend eine Aktivierung von T-Lymphozyten und B-Vorläuferzellen (MURPHY et al. 2009a; ALLENSPACH 2011). Mit Hilfe ihrer charakteristischen Fortsätze können dendritische Zellen auch direkt Antigene durch eine intakte Epithelbarriere aufnehmen und präsentieren. Sie stellen damit ein wichtiges Bindeglied zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem dar. Die Sekretion von IL-6 durch dendritische Zellen induziert einen Switch zur IgA- Produktion der B-Zellen (MURPHY et al. 2009a; ALLENSPACH 2011).
Die Effektorzellen des spezifischen Immunsystems im Magendarmtrakt sind vor allem die intraepithelialen T-Lymphozyten (CD8+ T-Zellen) und die heterogene Zellpopulation der Lamina propria mucosae (CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten, Plasmazellen, Makrophagen, dendritische Zellen, eosinophile Granulozyten und Mastzellen) (MURPHY et al. 2009a).
Den vorherrschenden Antikörpertyp im mukosalen Immunsystem stellt das lokal von Plasmazellen produzierte, dimere IgA dar (RUAUX 2011). In den Peyer-Platten und den mesenterialen Lymphknoten kommt es unter Einwirkung des Zytokins TGF-β (transforming-growth-factor β) zur Aktivierung und zum Isotypenwechsel von naiven B-Lymphozyten zu IgA-produzierenden Plasmazellen. Mittels Rezeptor-vermittelter Transzytose (Poly-Ig-Rezeptor) durch unreife Epithelzellen am Grund der Darmkrypten gelangen die Antikörper als sekretorisches IgA ins Darmlumen, binden an die Schleimschicht der Enterozyten, verhindern damit die Anheftung von Mikroorganismen und neutralisieren deren Toxine und Enzyme (MURPHY et al.
2009a; ALLENSPACH 2011). Außerdem wurde ein Einfluss der IgA-Produktion auf die Zusammensetzung der mikrobiellen Flora festgestellt, da es bei IgA-Defizienzen zu einer hauptsächlich anaeroben Besiedlung kommt (ALLENSPACH 2011).
2.2.3 Orale Toleranz
Ein wichtiger Mechanismus des Darmimmunsystems ist die Entwicklung der oralen Toleranz, die eine adäquate Reaktion auf potentielle Pathogene ermöglicht und gleichzeitig eine überschießende Immunreaktion auf Antigene der kommensalen Bakterienflora oder der Nahrung verhindert (STOKES und WALY 2006;
ALLENSPACH 2011). Hierbei kommt den dendritischen Zellen eine besondere Bedeutung zu, die die Ausreifung naiver T-Zellen in Richtung einer Th1-, Th2- oder Th17-Antwort beeinflussen. Im Zustand der intestinalen Homöostase und in Gegenwart einer kommensalen, bakteriellen Flora besteht eine Balance zwischen Effektor- und regulatorischen T-Zellsubpopulationen, die durch ein enges Zusammenwirken verschiedener Zytokine gewährleistet ist (ALLENPACH 2011). Ein wichtiger Faktor zur Entwicklung der oralen Toleranz sind die Eigenschaften der kommensalen Bakterien selbst, denen im Gegensatz zu pathogenen Erregern Faktoren wie Adhäsine und Invasine fehlen und die deshalb kaum die intestinale Mukusschicht durchdringen (SANSONETTI 2004).
Die Immunantwort des Magendarmtraktes auf kommensale Mikroorganismen ist geprägt durch das Vorhandensein von regulatorischen T-Zellen, die durch Zytokine wie IL-10 und TGF-β die Aktivierung, Differenzierung und Proliferation anderer T- Zellen hemmen und damit eine entzündungshemmende und immunsuppressive Wirkung vermitteln. Weiterhin finden sich T-Helfer-Zellen vom Typ 2 (Th2), dendritische Zellen und Makrophagen (ALLENPACH und GASCHEN 2003;
SANSONETTI 2004). Die Organismen der kommensalen Bakterienflora werden im mukosalen Immunsystem erkannt, da deren Antigene durch dendritische Zellen ohne Expression von kostimulierenden Molekülen präsentiert werden. Gleichzeitig besteht jedoch keine systemische Immunantwort (systemische Ignoranz) (MURPHY et al.
2009a).
Kommt es zu Störungen der Schleimhautbarriere und zum Eindringen von Mikroorganismen oder Antigenen, verschiebt sich die Immunreaktion in Richtung einer pro-inflammatorischen, von T-Helfer-Zellen des Typ 1 (Th1) dominierten Reaktion unter der Wirkung von entzündungsfördernden Zytokinen wie IFN-γ und
TNF-α, die zu einer weiteren Schädigung der Darmschleimhaut führt und somit in einem circulus vitiosus resultiert (ALLENPACH und GASCHEN 2003).
Studien an Nagetieren zeigen, dass die Entwicklung der oralen Toleranz durch viele Faktoren, wie Alter des Tieres, genetische und diätetische Faktoren beeinflusst wird (STOKES und WALY 2006).
2.3 Inflammatory bowel disease
2.3.1 Definition, klinische Symptome, Diagnostik und Differentialdiagnosen
Die inflammatory bowel disease (IBD) umfasst eine Gruppe chronischer, idiopathischer Enteropathien, die definitionsgemäß mit anhaltenden oder wiederkehrenden, gastrointestinalen Symptomen wie Erbrechen, Durchfall, Gewichtsverlust und Inappetenz über einen Zeitraum von mindestens 3 Wochen sowie dem histologischen Nachweis von Immunzellinfiltraten in der Schleimhaut des Magen-Darm-Traktes einhergehen (ALLENSPACH und GASCHEN 2003;
CERQUETELLA et al. 2010; JERGENS und SIMPSON 2012). Das klinische Bild kann sich jedoch sehr heterogen darstellen. Ein Krankheitsverlauf in Schüben oder Rezidive sind möglich (HALL und GERMAN 2011). Die Diagnose IBD erfolgt als Ausschlussdiagnose und erfordert ein systematisches, diagnostisches Vorgehen zum Ausschluss der zahlreichen Differentialdiagnosen (siehe Tabelle 1) Die diagnostischen Schritte umfassen die Untersuchung von Kot, Urin und Blut, die medikamentöse, antiparasitäre Therapie, die Bestimmung der trypsinähnlichen Immunreaktivität (TLI), Vitamin B12- und Folatkonzentration, die mikrobiologische Untersuchung des Kotes, die sonografische Untersuchung des Bauchraumes, eine Eliminationsdiät und schließlich die endoskopische Untersuchung von Magen, Duodenum und ggf. Kolon mit Entnahme von intestinalen Bioptaten (ALLENSPACH und GASCHEN 2003; HALL und GERMAN 2011). Die histopathologische Untersuchung der Gewebeproben und ein Vorhandensein von intestinalen Entzündungszellinfiltraten und in einigen Fällen auch strukturellen Veränderungen
der intestinalen Mukosa sind für die Diagnosestellung essentiell (JERGENS und SIMPSON 2012).
Da die histopathologische Beurteilung starken Variablen wie der Anzahl und Qualität der Bioptate, der technischen Aufarbeitung der Proben und nicht zuletzt subjektiven Einflüssen durch die begutachtende Person (interobserver differences) unterliegt, wurde durch die World Small Animal Veterinary Association Gastrointestinal Standardization Group (WSAVA) ein standardisiertes Schema zur Beurteilung von entzündlichen Veränderungen des kaninen und felinen Gastrointestinaltraktes erarbeitet (DAY et al. 2008). Darüber hinaus existieren klinische Beurteilungssysteme, wie der canine inflammatory bowel disease activity index (CIBDAI) und der canine chronic enteropathy clinical activity index (CCECAI), die zur Beurteilung von Krankheitsverlauf und Behandlungserfolg verwendet werden können (JERGENS et al. 2003; ALLENSPACH et al. 2007; JERGENS und SIMPSON 2012) jedoch nicht mit dem Grad der histopathologischen Läsionen korrelieren (ALLENSPACH et al. 2007; CERQUETELLA et al. 2010).
Tabelle 1: Differentialdiagnosen zur IBD bei intestinalen Symptomen des Hundes, modifiziert nach ALLENSPACH und GASCHEN (2003)
Dünndarm Dickdarm
Diätetische Ursachen
Futtermittelintoleranz Laktoseintoleranz Futtermittelallergie
Futtermittelintoleranz Futtermittelallergie
Infektiöse Ursachen
Bakterielle Erreger (Campylobacter ssp., Salmonellen, Clostridien)
SIBO (small intestinal bacterial overgrowth)/ARD (antibiotic responsive diarrhoea)
Parasiten (Giardien, Kokzidien, Ancylostoma caninum)
Parasiten (Trichuris vulpis, Giardia intestinalis)
Neoplasie
Malignes Lymphom Mastzelltumor Gastrinom
Malignes Lymphom Adenokarzinom Weitere
Ursachen
Extraintestinale Erkrankungen (Leber- und Nierenfunktionsstörungen,
Pankreasinsuffizienz)
Rektale Polypen
2.3.2 Erscheinungsformen der kaninen IBD
Die Einteilung der verschiedenen Erscheinungsformen der inflammatory bowel disease erfolgt nach Lokalisation der Entzündungsprozesse und nach Art des entzündlichen Infiltrats (GERMAN et al. 2003; GERMAN 2012). Insgesamt tritt die IBD vermehrt bei mittelalten Hunden auf, es besteht jedoch keine Geschlechtsdisposition. Eine Prädisposition bestimmter Rassen ist für einzelne IBD- Formen bekannt (JERGENS et al. 1992; CERQUETELLA et al. 2010; GERMAN 2012).
Die häufigste Form der IBD stellt die lymphoplasmazelluläre Enteritis (LPE) dar (GERMAN et al. 2003; HALL und GERMAN 2011; GERMAN 2012). Hierbei kann sowohl der Magen (lymphoplasmazelluläre Gastroenteritis, LPGE), als auch das Kolon (lymphoplasmazelluläre Enterokolitis, LPEK) in den Entzündungsprozess mit einbezogen sein (GERMAN 2012). Das entzündliche Infiltrat der Mukosa besteht hierbei überwiegend aus Lymphozyten und Plasmazellen, wobei der Entzündungsgrad von einer geringgradigen Infiltration bis hin zu einer hochgradigen Entzündung variieren kann (HALL und GERMAN 2011). Weitere histologische Merkmale einer LPE können Zottenatrophien bzw. -verkürzungen, Epithelläsionen im Zottenbereich, Dilatation von Lymphgefäßen, Erhöhung der intraepithelialen Lymphozytenzahl sowie Kryptdilatationen und -abszesse darstellen. Diese Veränderungen können jedoch auch bei anderen Formen der IBD auftreten (VAN DER GAAG und HAPPÉ 1989; DAY et al. 2008). Betroffene Hunderassen sind vor allem Deutscher Schäferhund, Shar Pei, Rottweiler und Boxer (CRAVEN et al. 2004;
HALL und GERMAN 2011), aber auch Border Collies und Weimaraner zeigen eine erhöhte Inzidenz (KATHRANI et al. 2011a). Patienten mit LPE sind häufig mittelalte bis ältere Hunde. Eine Geschlechtsdisposition ist nicht bekannt (HALL und GERMAN 2011).
Gelegentlich tritt auch eine auf das Kolon beschränkte lymphoplasmazelluläre Entzündung (lymphoplasmazelluläre Kolitis, LPC) auf (HALL und GERMAN 2011).
Eine schwer abzugrenzende Erkrankung und gleichzeitig die wichtigste Differentialdiagnose der LPE stellt das intestinale Lymphom dar, vor allem wenn es sich um eine Neoplasie mit geringem Malignitätsgrad handelt (HALL und GERMAN 2011).
Die eosinophile Enteritis kommt im Vergleich zur lymphoplasmazellulären Enteritis selten vor, stellt jedoch die zweithäufigste Form der IBD dar (HALL und GERMAN 2011; GERMAN 2012). Auch hierbei können außer dem Dünndarm andere Lokalisationen des Gastointestinaltraktes in das Entzündungsgeschehen einbezogen sein (eosinophile Gastroenteritis, EGE; eosinophile Enterokolitis, EEK) (SIMPSON und JERGENS 2011). Histologisch lässt sich neben strukturellen Veränderungen der Schleimhautarchitektur wie einer Atrophie der Darmzotten, ein gemischtzelliges, überwiegend eosinophiles Entzündungszellinfiltrat feststellen. In einigen Fällen zeigen die erkrankten Hunde zusätzlich eine periphere Eosinophilie. Häufiger als bei anderen IBD-Formen zeigen die Tiere erosive und ulzerative Läsionen, die klinisch zu Hämatemesis und Meläna führen (HALL und GERMAN 2011). Oft sind junge Tiere, im Alter von 5 Jahren oder jünger, betroffen (QUIGLEY und HENRY 1981;
VAN DER GAAG und HAPPÉ 1989). Eine Prädisposition besteht für den Boxer, den Deutschen Schäferhund und den Dobermann. Aufgrund der Beteiligung von eosinophilen Granulozyten sind vor allem parasitär und allergisch bedingte Erkrankungen differentialdiagnostisch auszuschließen (VAN DER GAAG und HAPPÉ 1989; HALL und GERMAN 2011; SIMPSON und JERGENS 2011; GERMAN 2012).
Die granulomatöse Enteritis stellt beim Hund eine sehr seltene Form der IBD dar und geht mit einer oft unregelmäßigen Infiltration von Makrophagen und Granulomformationen in der Mukosa des Dünn- und Dickdarms einher (HALL und GERMAN 2011).
Darüber hinaus existieren rassespezifische Formen der inflammatory bowel disease.
Die immunproliferative Enteropathie der Basenjis betrifft vor allem den Magen und proximale Teile des Dünndarms. Klinisch geht diese Erkrankung vor allem mit progressiver, unstillbarer Diarrhö und Kachexie, aber auch mit Erbrechen einher. Die histopathologischen Läsionen umfassen eine Hypertrophie der Magenschleimhaut
mit Hyperplasie von Haupt- und Belegzellen, Ulzerationen, Zottenverkürzung und Infiltrationen der Lamina propria mucosae mit Lymphozyten, Plasmazellen und wenigen neutrophilen Granulozyten. Weiterhin ist klinisch ein Anstieg von IgA- Antikörpern im Serum festzustellen. Ein genetischer Einfluss auf die Pathogenese mit autosomal-rezessiver Vererbung wird vermutet (GERMAN et al. 2003; HALL und GERMAN 2011). Die Erkrankung verläuft progressiv und endet trotz medikamentöser Behandlung oft tödlich (GERMAN 2012).
Die histiozytäre, ulzerative Kolitis des Boxers (HUC), auch als granulomatöse Kolitis der Boxer bezeichnet, tritt vor allem bei jungen Tieren (unter 4 Jahren) auf und zeichnet sich durch eine Kolitis mit Beteiligung von großen, in der Reaktion mit periodic acid Schiff (PAS) positiven Makrophagen sowie eine ulzerative Entzündungskomponente und den Verlust von Becherzellen aus (GERMAN et al.
2003; MANSFIELD et al. 2009; CRAVEN et al. 2011). In neueren Untersuchungen wurde ein Zusammenhang zwischen klinischer Symptomatik und dem Vorhandensein adhärenter und invasiver Escherichia coli Bakterien nachgewiesen (MANSFIELD et al. 2009), welche den idiopathischen Charakter und die Eingruppierung in den Krankheitskomplex der IBD in Frage stellen. In jüngster Zeit wurden auch Fälle von granulomatöser Kolitis bei jungen Französischen Bulldogen beschrieben, die starke Parallelen zum Krankheitsbild des Boxers zeigen und bei denen ebenfalls ein kausaler, pathogenetischer Zusammenhang mit adhärenten und invasiven Escherichia coli nachgewiesen wurde (CRAVEN et al. 2011;
MANCHESTER et al. 2013).
Die oft progressiv verlaufende Gastroenteropathie der Norwegischen Lundehunde (Lundehund syndrome) geht mit einer chronischen, atrophischen Gastritis, lymphoplasmazellulären Infiltraten und Lymphangiektasien im Dünndarm sowie einem Proteinverlust einher (BERGHOFF et al. 2007). Klinisch zeigen die Tiere neben Durchfall, Erbrechen und Gewichtsverlust auch Aszites, Hypalbuminämie und subkutane Ödeme. Histologische Veränderungen sind aber auch bei Tieren ohne klinische Symptomatik beschrieben worden (BERGHOFF et al.
2007).
Das klinische Bild der Protein-Verlust Enteropathie (protein losing enteropathy, PLE) und –Nephritis (protein losing nephropathy, PLN) beim Soft Coated Wheaten Terrier ist allem Anschein nach eine genetisch bedingte Erkrankung, die auf einen gemeinsamen, männlichen Vorfahren zurückzuführen ist. Somit sollte dieser Erkrankungskomplex nicht mehr unter dem Oberbegriff der idiopathischen IBD geführt werden (GERMAN et al. 2003; HALL und GERMAN 2011).
2.3.3 Pathogenese der IBD
Die Pathogenese der kaninen inflammatory bowel disease ist wahrscheinlich bedingt durch eine Dysregulation des intestinalen Immunsystems, wobei jedoch auch umweltbedingte Faktoren, insbesondere Nahrungsmittelantigene und intestinale Mikroorganismen sowie genetische Einflüsse eine Rolle spielen (ALLENSPACH und GASCHEN 2003; GERMAN et al. 2003).
2.3.3.1 Immunpathologische Krankheitseinflüsse
Die Aufgabe des intestinalen Immunsystems besteht in einer Barrierefunktion der Mukosa und der Kontrolle des Antigenkontaktes (GERMAN 2012). Dabei sorgen die Mechanismen der oralen Toleranz für eine Unterdrückung einer überschießenden Immunantwort gegen harmlose Umweltantigene. Die kanine IBD entwickelt sich, wenn diese Abläufe gestört werden, zu einer unkontrollierten immunologischen Reaktion auf Antigene aus Nahrung und kommensaler Bakterienflora, dem Zusammenbruch der intestinalen Barriere und endet in einer unkontrollierten Entzündungsreaktion (GERMAN 2012). Erkenntnisse zur Immunpathogenese der IBD bei Hunden sind begrenzt und zeigen in einigen Fällen gegensätzliche Ergebnisse.
Mehrere immunhistochemische Untersuchungen zeigten eine veränderte Immunzellpopulation in der Lamina propria mucosae bei Hunden mit IBD.
JERGENS et al. (1996) beschreiben eine Abnahme der CD3+ T-Zellen und IgG- produzierenden Plasmazellen im Duodenum erkrankter Tiere. Ähnliche Untersuchungen von Bioptaten aus dem Dickdarm von Tieren mit lymphoplasmazellulärer Kolitis (JERGENS et al. 1999) und von transmuralen
Bioptaten aus Magen, Duodenum, Ileum und Kolon von Tieren mit lymphoplasmazellulärer und eosinophiler Enteritis (KLEINSCHMIDT et al. 2006) zeigten wiederum einen deutlichen Anstieg von CD3+ T-Zellen sowie IgA- und IgG- produzierenden Plasmazellen. STONEHEWER et al. (1998) berichten von einem Anstieg von T- und B-Lymphozyten in der Mukosa des Kolons von erkrankten Hunden. Eine Studie von GERMAN et al. (2001) wies einen signifikanten Anstieg von IgG-positiven Plasmazellen, CD3+ und CD4+ T-Zellen, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten bei erkrankten Tieren als Ausdruck proinflammatorischer Veränderungen der Mukosa nach. Eine Untersuchung von DANDRIEUX et al. (2008) zeigte, dass die Apoptoserate von Lymphozyten im Bereich der Duodenalzotten bei gesunden Tieren höher ist als bei Hunden mit IBD und möglicherweise eine Apoptoseresistenz von Lymphozyten eine pathogenetische Bedeutung bei der kaninen inflammatory bowel disease zukommt.
Untersuchungen zum Verhalten von regulatorischen T-Zellen zeigten eine signifikante Abnahme dieser Zellen im Duodenum von Tieren mit lymphoplasmazellulärer und eosinophiler Enteritis, während in Magen und Kolon keine Unterschiede festgestellt wurden (JUNGINGER et al. 2012). Die Autoren vermuten eine gestörte Homöostase der regulatorischen T-Zellen als pathogenetischen Faktor bei der Krankheitsentstehung (JUNGINGER et al. 2012).
Eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der oralen Toleranz spielen antigen- präsentierende dendritische Zellen. Eine Untersuchung von KATHRANI et al. (2011c) mit einem Marker gegen CD11c, welcher vor allem kanine dendritische Zellen detektiert, zeigte eine signifikante Abnahme positiver Zellen in Fällen kaniner IBD.
Einige Untersuchungen beschäftigen sich mit der Rolle von Mastzellen bei der kaninen IBD. Während GERMAN et al. (2001) von einer verminderten Mastzellzahl in der Mukosa des Duodenums von IBD Tieren berichten, beschreiben die Ergebnisse einer anderen Studie (KLEINSCHMIDT et al. 2006) ein differenzierteres Bild. Diese Untersuchung zeigte eine Abnahme der Mastzellzahlen bei LPE, während bei EGE die Mastzellenzahlen erhöht waren und deutet auf unterschiedliche Pathogenesemechanismen beider Krankheitsformen hin (KLEINSCHMIDT et al.
2006). Die Autoren vermuten einen Th1-dominierten Entzündungsprozess bei lymphoplasmazellulärer IBD und eine pathogenetische Bedeutung einer Typ 1 Hypersensitivitätsreaktion mit Th2-dominierter Immunantwort bei eosinophilen Formen der IBD (KLEINSCHMIDT et al. 2006). Eine Untersuchung von LOCHER et al. (2001) zeigte erhöhte Mastzellzahlen und vermehrt IgE-positive Zellen bei erkrankten Tieren, welche auf eine IgE-vermittelte Hypersensitivitätsreaktion bei der Krankheitsentstehung hindeuten.
Verschiedene Studien untersuchten Veränderungen des Zytokinspektrums in Hinsicht auf pathogenetische Aspekte. GERMAN et al. (2000) beschrieben einen Anstieg proinflammatorischer und immunreguatorischer Zytokine (TNF-α bzw. TGF- β) auf mRNA-Ebene. Sowohl Zytokine einer Th1-Immunantwort wie IL-2, IL-12p40 und IFN-γ, als auch das für eine Th2-Immunreaktion charakteristische IL-5 waren aufreguliert, sodass ein uneinheitliches Zytokinprofil bei der kaninen IBD vermutet wird (GERMAN et al. 2000). PETERS et al. (2005) quantifizierten die mRNA- Expression verschiedener Interleukine und Zytokine mittels real time-PCR, stellten jedoch keine Unterschiede zwischen gesunden Tieren und Hunden mit chronischen Durchfallerkrankungen fest. Neuere Untersuchungen charakterisierten die Zytokinexpression verschiedener T-Zellsubpopulationen und stellten eine verminderte Expression von IL-17A-mRNA bei erkrankten Deutschen Schäferhunden und Hunden anderer Rassen fest, während die Expression weiterer Zytokine (IL-10, IL-22, IFN-γ, TGF-β) unverändert blieb und kein deutliches Th1/Th17-Zytokinmuster erkennen ließ (SCHMITZ et al. 2012). Die Autoren vermuten, dass ein Mangel an IL- 17A zu einer erhöhten Permeabilität der epithelialen Barriere mit nachfolgender Verstärkung der entzündlichen Prozesse führt (SCHMITZ et al. 2012). Eine weitere Untersuchung der mRNA-Expression intestinaler Zytokine mit Meta-Analyse anderer Untersuchungen zeigte ebenfalls keine Tendenzen zu einer Th1- bzw. Th2- dominerten Immunantwort (JERGENS et al. 2009). Es wurde eine konstitutive Expression von zahlreichen pro- und antiinflammatorischen Zytokinen im unveränderten Intestinaltrakt gesunder Tiere nachgewiesen, welche möglicherweise eine bedeutende Rolle für die intestinale Homöostase hat (JERGENS et al. 2009).
Einschränkend muss bei diesen Studien beachtet werden, dass es sich um Untersuchungen auf genetischer Ebene und nicht um Messungen der Zytokine auf Proteinebene handelt. Diese können zum Beispiel durch posttranskriptionelle Regulationsmechanismen voneinander abweichen (GERMAN et al. 2000; PETERS et al. 2005; SCHMITZ et al. 2012). In einer Studie von MAEDA et al. (2012) hingegen wurden das proinflammatorische Zytokin IL-1β und dessen endogenen Antagonisten IL-1Ra auf mRNA- und Proteinebene untersucht, wobei eine Imbalance bei IBD- Fällen im Vergleich zu gesunden Tieren und Hunden mit einem intestinalen Lymphom nachgewiesen wurde.
MAEDA et al. (2011) untersuchten auch die Rolle von Chemokinen bei kaniner IBD und beschrieben eine Aufregulation verschiedener Chemokine, die zur Migration von Entzündungszellen beitragen. Die zugehörigen Rezeptoren zeigten keine veränderte Expression (MAEDA et al. 2011).
Neben den Mechanismen der adaptiven Immunantwort ist anscheinend aber auch eine Dysfunktion der angeborenen Immunität bei der Pathogenese der IBD von Bedeutung (CATCHPOLE und ALLENSPACH 2012). So zeigen Tiere mit IBD eine veränderte Expression, Dysfunktion oder Dysregulation von toll like-Rezeptoren (TLR), die der Detektion von pathogenen Strukturen (PAMP) dienen (CERQUETELLA et al. 2010; ALLENSPACH 2011). BURGENER et al. (2008) berichten von einer Aufregulation von TLR-2, -4 und -9 in Duodenum und Kolon bei Patienten mit kaniner IBD und vermuten eine Verstärkung der Entzündungsreaktion durch Interaktion mit mikrobiellen Antigenen. Der Umstand, dass auch nach klinischer Remission eine erhöhte Expression von mRNA für diese Rezeptoren bestand, deutet möglicherweise auf eine genetische Prädisposition hin. Eine andere Untersuchung zeigte eine ebenfalls eine erhöhte Expression von TLR-2, die eine leichte Korrelation mit der klinischen Symptomatik (Aktivitätsscore) aufwies (MCMAHON et al. 2010).
Neben Zytokinen und toll like-Rezeptoren wurden zahlreiche, weitere serologische und gewebsspezifische Biomarker, wie pANCA (perinuclear anti-neutrophil antibody), CRP (C-reaktives Protein) und NFκB (nuclear factor kappa light-chain enhancer),
bezüglich ihrer diagnostischen und prognostischen Aussagekraft untersucht, dienen zur Zeit jedoch nur als ergänzende, klinische Werkzeuge (ALLENSPACH 2011;
JERGENS und SIMPSON 2012).
2.3.3.2 Diätetische und mikrobielle Einflüsse
Die kommensale Bakterienflora des Intestinaltraktes erfüllt die Funktion einer Schutzbarriere gegen Pathogene. Gleichzeitig beeinflusst sie die Aufnahme von Nährstoffen und spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Immunsystems (SUCHODOLSKI 2011).
Bei Tieren mit IBD wurde eine veränderte intestinale Mikroflora festgestellt (JERGENS und SIMPSON 2012; SUCHODOLSKI 2011). Bei erkrankten Tieren fand sich ein erhöhter Anteil an Protobacteria einschließlich Enterobacteriaceae sowie ein verminderter Anteil an Bacteriodetes in der intestinalen Flora (XENOULIS et al. 2008;
JERGENS und SIMPSON 2012; SUCHODOLSKI 2011). Organismen der Gruppe Clostridiaceae wurden vermutlich aufgrund abweichender Probenentnahmeverfahren und Untersuchungspopulation sowohl vermehrt als auch in geringerer Menge bei Hunden mit IBD nachgewiesen (XENOULIS et al. 2008; SUCHODOLSKI et al. 2010).
Weiterhin zeigte sich eine verminderte Speziesdiversität der bakteriellen Flora im Dünndarm von IBD Tieren (XENOULIS et al. 2008; SUCHODOLSKI 2011). Inwieweit es sich dabei um primäre Veränderungen handelt, die der Entstehung einer IBD vorrausgehen oder ob es sich um unspezifische Veränderungen der intestinalen Flora im Rahmen einer allgemeinen Entzündungsreaktion handelt, bleibt unklar.
Nichtsdestotrotz wird eine Beteiligung intestinaler Mikroorganismen an der Pathogenese der kaninen inflammatory bowel disease in Form einer überschießenden Immunreaktion gegenüber kommensalen Antigenen von einigen Autoren vermutet (GERMAN et al. 2003; CERQUETELLA et al. 2010; SIMPSON und JERGENS 2011; JERGENS und SIMPSON 2012) und wurde im Falle der histiozytären, ulzerativen Kolitis des Boxers inzwischen auch nachgewiesen (MANSFIELD et al. 2009; CRAVEN et al. 2011).
Nicht zuletzt kann die Zusammensetzung der intestinalen Flora durch exogene Faktoren, wie die aufgenommene Nahrung, beeinflusst werden (SUCHODOLSKI 2011). Eine wichtige therapeutische Maßnahme bei IBD besteht in einer Umstellung der Fütterung auf leicht verdauliche Nahrung oder auf Futter mit nur einer Protein- und Kohlenhydratquelle (JERGENS und SIMPSON 2012; HALL und GERMAN 2011). Diese Maßnahme soll die im Darm vorhandene Antigenmenge vermindern und damit den Entzündungsprozess in der Mukosa reduzieren (HALL und GERMAN 2011). Zur Abgrenzung einer Futtermittelallergie oder –unverträglichkeit, die wichtige Differentialdiagnosen zu idiopathischen Enteropathien darstellen, wird die Durchführung einer Eliminationsdiät im Rahmen der Diagnostik in der Fachliteratur empfohlen (ALLENSPACH und GASCHEN 2003; CERQUETELLA et al. 2010;
SIMPSON und JERGENS 2011; HALL und GERMAN 2011).
2.3.3.3 Genetische Krankheitseinflüsse
Die Tatsache, dass bestimmte Hunderassen prädisponiert sind und somit ein höheres Risiko tragen, an IBD zu erkranken sowie das Vorkommen einiger spezifischer IBD-Formen nur bei bestimmten Rassen oder Zuchtlinien deutet auf eine genetische Komponente der Krankheitsentstehung hin (GERMAN et al. 2003;
KATHRANI et al. 2011a; SIMPSON und JERGENS 2011; JERGENS und SIMPSON 2012). Wie bei der Enteropathie des Basenjis ist jedoch oft der Vererbungsmodus nicht bekannt (HALL und GERMAN 2011).
Der Umstand, dass eine Aufregulation von TLR auch nach Besserung klinischer Symptome besteht, lässt eine genetische Prädisposition vermuten (BURGENER et al. 2008). Andere Autoren berichten von IBD-assoziierten, genetischen Polymorphismen (SNP, single nucleotide polymorphism) des TLR-4 und TLR-5 bei Deutschen Schäferhunden und des TLR-5 bei anderen Hunderassen, die möglicherweise mit Veränderungen der Proteinstruktur und Rezeptorfunktionalität einhergehen (KATHRANI et al. 2010; 2011b).
Bei der histiozytären, ulzerativen Kolitis des Boxers wurde ein krankheitsassoziierter Nukleotidpolymorphismus in einem Gen (NCF2) entdeckt, welches an der Funktion
des respiratory burst in neutrophilen Granulozyten beteiligt ist und somit möglicherweise deren Fähigkeit intrazelluläre Pathogene zu eliminieren beeinträchtigt (CRAVEN et al. 2011; SIMPSON und JERGENS 2011; JERGENS und SIMPSON 2012).
2.4 Histaminrezeptoren im Gastrointestinaltrakt
Histamin ist ein biogenes Amin mit vielfältigen physiologischen und pathologischen Funktionen, dessen Effekte im Gastrointestinaltrakt erstmalig im Jahre 1910 beschrieben wurden (DALE und LAIDLAW 1910; PARSON und GANELLIN 2006;
CORUZZI et al. 2012). Histamin wird durch das Enzym Histidindecarboxylase synthetisiert und in Mastzellen, basophilen Granulozyten und enterochromaffin- ähnlichen Zellen sowie im Magendarmtrakt auch in Nervenfasern und endokrinen Zellen gespeichert (PANULA et al. 1985; JUTEL et al. 2009; PARSON und GANELLIN 2006; CORUZZI et al. 2012). Andere Zellen, wie dendritische Zellen, neutrophile Granulozyten, Thrombozyten, Makrophagen und T-Lymphozyten sind nach Aktivierung durch verschiedene Stimuli zur de novo-Synthese von Histamin befähigt (JUTEL et al. 2002; WU et al. 2004; HUANG und THURMOND 2008; JUTEL et al. 2009; BÄUMER und ROßBACH 2010; CORUZZI et al. 2012).
Bis heute wurden durch zahlreiche, mehrheitlich funktionelle Untersuchungen vier verschiedene Histaminrezeptoren beschrieben, die in der Reihenfolge ihrer Entdeckung als Histaminrezeptor 1 (H1R), Histaminrezeptor 2 (H2R), Histaminrezeptor 3 (H3R) und Histaminrezeptor 4 (H4R) bezeichnet werden (HILL et al. 1997; NAKAMURA et al. 2000; ODA et al. 2000). Alle Histaminrezeptoren gehören zur Gruppe der G-Protein-gekoppelten Proteine und besitzen sieben Transmembrandomänen, unterscheiden sich jedoch bezüglich der intrazellulären Signalübertragungsmechanismen (HILL et al. 1997; DE ESCH et al. 2005; AKDIS und SIMONS 2006; HUANG und THURMOND 2008; JUTEL et al. 2009) (siehe Tabelle 2).
Tabelle 2: Signalübertragungswege der Histaminrezeptoren nach HILL et al.
(1997), DE ESCH et al. (2005), AKDIS und SIMONS (2006), HUANG und THURMOND (2008) und JUTEL et al. (2009)
Rezeptor G-Protein Signalübertragung
H1R Gq
Aktivierung der Phospholipase C, Anstieg von
Inositoltriphosphat (IP3), Freisetzung von intrazellulären Ca2+-- Ionen
Aktivierung von NFκB H2R Gs
Aktivierung der Adenylylcyclase, Erhöhung intrazellulärer cAMP- Level
H3R Gi/o
Inaktivierung der Adenylylcyclase, Verminderung intrazellulärer cAMP-Level
H4R Gi/o
Inaktivierung der Adenylylcyclase, Verminderung intrazellulärer cAMP-Level
Aktivierung von Phospholipase C, Freisetzung von intrazellulären Ca2+-Ionen
SANDER et al. (2006) beschreiben die Expression von Histaminrezeptoren im humanen Gastrointestinaltrakt mittels molekularbiologischen und immunhistochemischen Methoden sowohl auf mRNA-, als auch auf Proteinebene.
Die Ergebnisse zeigen eine ubiquitäre Expression von H1R und H2R in mehreren Lokalisationen des Darmtraktes (Duodenum, Ileum, Kolon, Rektum) sowie eine H4R- Expression auf niedrigerem Level. Immunhistochemisch wurde H1R in Enterozyten, Bindegewebszellen, Immunzellen, Blutgefäßen, Myozyten und Zellen des enterischen Nervensystems dargestellt. H2R zeigte ein ähnliches immunhistochemisches Expressionsmuster in Enterozyten, Immunzellen, glatten Muskelzellen und Ganglienzellen, während H4R immunhistochemisch nur in intravasalen Leukozyten, neuroendokrinen Zellen und einigen Enterozyten (apikal der Lieberkühn-Krypten) nachgewiesen wurde. Der H3R konnte weder in der Darmwand noch in enterischen Nervenfasern immunhistochemisch dargestellt werden (SANDER et al. 2006).
Auch eine Arbeit von BOER et al. (2008) beschäftigt sich mit der Expression von Histaminrezeptoren im humanen Kolon, wobei neben kolorektalen Neoplasien auch unverändertes Dickdarmgewebe untersucht wurde. Mittels real time-PCR und
Western Blot wurden H1R-, H2R- und H4R-mRNA und -protein in Kolongewebe nachgewiesen, während niedrige Level von H3R-mRNA nur in 7,9% der Proben aufgefunden wurden (BOER et al. 2008). Eine immunhistochemische Untersuchung im Rahmen derselben Arbeit zeigte eine kräftige Expression von H1R, H2R und H4R durch Enterozyten in unverändertem Gewebe. Eine deutliche Expression von H1R und H2R zeigten auch andere, nicht näher spezifizierte Zellen der Lamina mucosa sowie submukosale Bindegewebszellen, während die H4R-Expression dieser Zellen schwächer ausgeprägt war und im Falle der Bindegewebszellen der Tela submucosa nur sporadisch festgestellt wurde (BOER et al. 2008)
Eine andere Studie wies eine mRNA-Expression von H1R, H2R und H4R in humanen CD8+ Lymphozyten nach, während H3R nicht nachgewiesen werden konnte (GANTNER et al. 2002). CD4+ Lymphozyten exprimieren niedrige Level der H4R- mRNA, jedoch keine H3R-mRNA (LING et al. 2004). Hohe Level von H4R-mRNA wurden wiederum in eosinophilen Granulozyten und dendritischen Zellen festgestellt (GANTNER et al. 2002; LING et al. 2004). Dendritische Zellen tragen alle vier Histaminrezeptoren (GANTNER et al. 2002; AKDIS und SIMONS 2006; JUTEL et al.
2009).
2.4.1 Funktionelle Aspekte von Histaminrezeptoren im Gastrointestinaltrakt
Histaminrezeptoren vermitteln verschiedenste intestinale Effekte und die Rolle von Histamin in der Physiologie und Pathologie des Gastrointestinaltraktes war und ist Gegenstand vieler wissenschaftlicher Studien. Dabei wurde ein Teil der Untersuchungen an humanen Proben und Geweben durchgeführt (STEAD et al.
1989; KEELY et al. 1995; BARBARA et al. 2004; LING et al. 2004; BREUNIG et al.
2007). Forschungsergebnissen aus Tiermodellen, vor allem Studien mit Meerschweinchen, Mäusen und Ratten, kommt jedoch ebenfalls eine große Bedeutung zu (HARRY 1963; BARKER und EBERSOLE 1982; RANGACHARI und MCWADE 1986; YAMANAKA und KITAMURA 1987; WANG und COOKE 1990;
TRAYNOR et al. 1992; KHAN et al. 1994; COOKE et al. 1995; IZZO et al. 1998;
HEMEDAH et al. 2000; HOFSTRA et al. 2003). Die Ergebnisse aus einer Vielzahl
dieser, oft funktionellen Untersuchungen zeigen die Bedeutung und Wirkungsweise von Histamin und seinen verschiedenen Rezeptoren für die Motilität, Sekretion, vaskuläre Permeabilität, Hämodynamik und immunologische Vorgänge in Magen und Darm (FOGEL et al. 2005a).
Dabei ist zu beachten, dass ein Teil der Untersuchungen zu einem Zeitpunkt durchgeführt wurde, an dem noch nicht alle vier Histaminrezeptoren entdeckt beziehungsweise funktionell beschrieben waren. Eine Verwendung von pharmakologischen Substanzen, die hierbei als vermeintlich spezifische Liganden eingesetzt wurden, tatsächlich jedoch auch an bis zu diesem Zeitpunkt unbekannte Rezeptoren banden, kann somit zur Verzerrung von Ergebnissen geführt haben (POLI et al. 2001; AKDIS und SIMONS 2006; BÄUMER und ROßBACH 2010;
CORUZZI et al. 2012). Darüber hinaus bestehen mitunter starke speziesspezifische Unterschiede in Verteilungsmuster, Proteinstruktur und Nukleotidsequenzen der einzelnen Histaminrezeptoren, die sich möglicherweise auch funktionell auswirken können (KHAN et al. 1994; XIE und HE 2005; PARSON und GANELLIN 2006;
JIANG et al. 2008; BÄUMER und ROßBACH 2010).
2.4.1.1 Gastrointestinale Motilität
Bereits im Jahre 1910 beschrieben DALE und LAIDLAW (1910) einen Effekt von Histamin auf den Tonus von Dünndarmschlingen. Es gibt zahlreiche, meist funktionelle Studien, die verschiedene Mechanismen der Wirkung von Histamin auf die gastrointestinale Motilität beschreiben.
Direkte kontraktile Effekte von Histamin auf die glatte Muskulatur des Ileums über postsynaptische, nicht cholinerge Rezeptoren wurden von HARRY (1963) im Meerschweinchenmodell gezeigt. Im Jahre 1977 zeigten HILL et al. die spezifische Bindung eines H1R-Antagonisten an den H1R in glatter Muskulatur des Darmtraktes von Meerschweinchen. Untersuchungen an der Lamina muscularis mucosae des Magens von Hunden zeigten abhängig von der Histaminkonzentration einen kontraktilen, über H1R vermittelten und einen entspannenden, via H2R vermittelten Effekt (MULLER et al. 1993). Ähnliche Beobachtungen machten auch YAMANAKA
