Einfluss einer kaninen Staupevirusinfektion auf die Zytokinexpression von phocinen Lymphozyten

Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.

1. Auflage 2009

© 2009 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen Printed in Germany

ISBN 978-3-941703-45-2

Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17

35392 Gießen 0641/24466 geschaeftsstelle@dvg.net

www.dvg.net

Einfluss einer kaninen Staupevirusinfektion auf die Zytokinexpression von phocinen Lymphozyten

INAUGURAL - DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Henrike Seibel

Bielefeld

Hannover 2009

Institut für Pathologie

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, PhD

2. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. Ludwig Haas

Tag der mündlichen Prüfung: 19. November 2009

Meinen Eltern

Teile der hier vorliegenden Studie wurden bereits veröffentlicht:

SEIBEL, H., BAUMGÄRTNER, W., MÜLLER, G., WOHLSEIN, P., SIEBERT, U.

(2007). Retrospektive Analyse von zwei Staupeepidemien – ein Vergleich der Seehundstaupeepidemien in der Nord- und Ostsee 1988 und 2002. Deutsche Tierärztliche Wochenzeitschrift, 114 (8), 284-293.

Inhalt

1 Einleitung ... 1

2 Literaturübersicht ... 3

2.1 Der Seehund (Phoca vitulina) ... 3

2.1.1 Taxonomie ... 4

2.1.2 Biologie ... 5

2.2 Entwicklung der Seehundpopulation im Wattenmeer unter besonderer Berücksichtigung von Morbillivirusinfektionen ... 7

2.3 Morbillivirusinfektionen bei marinen Säugern ... 9

2.3.1 Das Staupevirus ... 9

2.3.2 Pathogenese und Morbillivirusinfektion bei Pinnipedia ... 14

2.4 Immunsystem und Zytokine bei marinen Säugern ... 15

2.4.1 Das Immunsystem im Allgemeinen ... 15

2.4.2 Zytokine ... 16

2.4.3 Das Immunsystem beeinflussende Faktoren ... 26

2.4.4 Lymphozytenstimulationstest ... 29

2.4.5 Durchflusszytometrie ... 30

3 Material und Methoden ... 32

3.1 Untersuchungsmaterial ... 32

3.1.1 Vacutainer® Cell Preparation Tubes ... 32

3.1.2 Durchführung der Dichtegradientenzentrifugation ... 33

3.1.3 Kultivierung ... 34

3.2 Bestimmung der geeigneten Mitogenkonzentration für eine maximale Lymphozytenstimulation ... 35

3.2.1 Untersuchungen zur Mitogenkonzentration mittels Durchfluss- zytometrie ... 35

3.2.2 Untersuchungen zur Mitogenkonzentration mittels BrdU-Test ... 37

3.3 Infektionsversuch ... 39

3.4 Nachweis von verschiedenen Zytokinen mittels RT-qPCR ... 41

3.4.1 Molekularbiologische Methoden ... 44

3.4.2 RT-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) ... 46

3.4.3 Quantitative RT-Polymerase Kettenreaktion (RT-qPCR) ... 48

3.4.4 Auswertung und Statistik der quantitativen PCR ... 54

4 Ergebnisse ... 56

4.1 Lymphozytenisolation ... 56

4.2 Bestimmung der geeigneten Mitogenkonzentration für eine maximale Lymphozytenstimulation ... 59

4.2.1 Untersuchungen zur Mitogenkonzentration mittels Durchfluss- zytometrie ... 59

4.2.2 Untersuchungen zur Mitogenkonzentration mittels BrdU-Test ... 63

4.3 Infektionsversuch ... 65

4.3.1 Antikörperaustitrierung ... 65

4.3.2 Auswertungen der Infektion von stimulierten und nicht-stimulierten Lymphozyten ... 65

4.4 Nachweis von verschiedenen Zytokinen mittels RT-qPCR ... 68

4.4.1 Untersuchungsmaterial ... 68

4.4.2 Allgemeines bezüglich der Auswertung ... 68

4.4.3 Nachweis der house-keeping Gen-Expression ... 70

4.4.4 Kontrollen ... 72

4.4.5 Nachweis der Gen-Expression von pro-inflammatorischen Zytokine und Einfluss des Stimulationszeitpunktes ... 73

4.4.6 Nachweis der Gen-Expression der anti-inflammatorischen Zytokine und Einfluss des Stimulationszeitpunktes ... 84

4.4.7 Zusammenfassung der Ergebnisse des Nachweises von pro- und anti-

inflammatorischen Zytokinen mittels RT-qPCR ... 94

5 Diskussion ...101

5.1 Isolierung phociner Lymphozyten mittels Dichtegradientenzentrifugation ..101

5.2 Stimulation phociner Lymphozyten mit Con A ...104

5.3 In vitro-Infektion phociner Lymphozyten mit CDV ...107

5.4 Einfluss einer in vitro CDV-Infektion phociner Lymphozyten auf die mRNA- Expression von pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen ...109

5.4.1 UV-Inaktivierung ...110

5.4.2 Zytokin-Expression ...110

5.4.3 Stimulationszeitpunkt ...116

5.4.4 Zusammenfassung ...117

5.5 Bedeutung einer CDV Infektion für das phocine Immunsystem...118

6 Zusammenfassung ...120

7 Summary ...123

8 Literaturverzeichnis ...126

9 Anhang ...152

9.1 Bezugsquellen für Reagenzien und Einmalware ...152

9.2 Bezugsquellen für Geräte ...155

9.3 Lösungen und Puffer ...156

9.3.1 Histologie ...156

9.3.2 Immunhistologie ...157

9.3.3 Molekularbiologie ...157

9.4 Tabellen ...159

10 Abkürzungen ...172

11 Danksagung ...177

1 Einleitung

Der Seehund (Phoca vitulina) ist eine unserer heimischen marinen Säugetierarten.

Neben der Nordsee und dem deutschen Wattenmeer ist er auch in der Ostsee und im gesamten Nord-Atlantik verbreitet (BONNER, 1989). Die Populationsentwicklung der Seehunde weist Schwankungen auf. Aktuell leben im Wattenmeer 20 250 Tiere, davon 5 844 in Schleswig-Holstein (BRASSEUR et al., 2008). 1988 reduzierte eine Seehundstaupevirusepidemie innerhalb eines Jahres die Population der Seehunde im Wattenmeer um ca. 40 %. In Nord- und Ostsee zusammen starben mehr als 18 000 Seehunde (DIETZ et al., 1989, CWSS, 1991). Nach einer deutlichen Erholung der Population bis zum Jahr 2001 (TRILATERAL SEAL EXPERT GROUP, 2001), kam es im Wattenmeer durch eine erneute Seehundstaupevirusepidemie 2002 zu Verlusten von insgesamt ca. 21 000 Tieren (REINEKING und COMMON WADDEN SEA SECRETARIAT, 2002; MÜLLER et al., 2004). Bei beiden Epidemien waren insbesondere die Jungtiere betroffen (HÄRKÖNEN et al., 2006).

Seehunde können sich sowohl mit dem Seehund- als auch mit dem Hundestaupevirus infizieren und zeigen dann Veränderungen in lymphatischen Organen (KENNEDY, 1998; JENSEN et al., 2002). Durch diese besondere Affinität des Virus, die sich bei Seehunden in einer ausgeprägten Lymphozytolyse mit lymphozytärer Depletion in Lymphknoten, Milz, Thymus, Mandeln und Schleimhaut- assoziierten lymphatischen Geweben äußert (WÜNSCHMANN et al., 2000; MÜLLER et al., 2004), kommt es zu einer Immunsuppression. Bei einer Infektion werden histopathologisch vorwiegend respiratorische Veränderungen in Form einer interstitiellen Pneumonie, oftmals durch bakterielle Sekundärinfektionen in Form einer eitrigen Bronchopneumonie verkompliziert, mit einem alveolären und interstitiellen Emphysem, sowie nicht-eitrige Enzephalitiden mit Degeneration und Nekrose der Neuronen gefunden (KENNEDY et al., 1989; BERGMAN et al., 1990;

KENNEDY, 1998; BAUMGÄRTNER et al., 2003; LAWSON und JEPSON, 2004;

PHILIPPA et al., 2009).

Die Immunsuppression begünstigt die Ausbreitung von bakteriellen Sekundärinfektionen und wird bei Hunden durch den lytischen Effekt von CDV auf

Lymphozyten und Makrophagen zu Beginn der Infektion verursacht (KRAKOWKA et al., 1978). Es wird diskutiert, dass in Analogie zur Masernvirusinfektion des Menschen bei einer Hundestaupevirus-Infektion die zelluläre Immunantwort wichtiger ist als die humorale (GERBER und MARRON, 1976; KRAKOWKA et al., 1978;

BLIXENKRONE-MÖLLER et al., 1993). Masernvirusinfektionen induzieren eine Th2- Antwort und es ist anzunehmen, dass diese Zytokinimbalanzen eine entscheidende Rolle in der Ausbildung der Immunsuppression spielen (GRIFFIN, 1995; KARP et al., 1996; MOSS et al., 2002; MOSS et al., 2004). In der frühen Phase einer CDV- und Masernviren-Infektion finden sich vermehrt pro-inflammatorische Zytokine der Th1- Zellen, wie Interleukin-1, -6, -12 und Tumor-Nekrose-Faktor  (DINARELLO, 2000;

MARKUS et al., 2002; KIECOLT-GLASER et al., 2003). Bei Ausbreitung der Infektion und Persistenzen sind hauptsächlich anti-inflammatorische Th2-Zytokine mit einer spontanen Sekretion von Interleukin-4, -10 und Transforming Growth Factor β nachweisbar (GRIFFIN und WARD, 1993; FRISK et al., 1999; MOSS et al., 2002;

KERDILES et al., 2006; BEINEKE et al., 2009a). Die Entwicklung einer guten Immunantwort ist für das Überleben junger Seehunde essentiell, doch es gibt bisher nur wenige Studien zu diesem Thema (ROSS et al., 1993; ROSS et al., 1994). Es konnte jedoch gezeigt werden, dass schon bei den Jungtieren eine effiziente T-Lymphozytenfunktion gegeben und eine starke Mitogen-induzierte Lymphozytenproliferation nachweisbar ist (ROSS et al., 1993; ROSS et al., 1994;

KAKUSCHKE et al., 2005).

Ziel dieser Arbeit war es, die Gen-Expression von verschiedenen pro- und anti- inflammatorischen Zytokinen in stimulierten und nicht-stimulierten phocinen Lymphozytensuspensionszellkulturen nach einer in vitro-Infektion mit einem kaninen Staupevirus (Ond-Stamm) zu untersuchen. Dadurch sollten Aussagen zu einer möglichen Virus-assoziierten Immunsuppression bei juvenilen Seehunden getroffen werden.

In Vorversuchen wurden dazu die Reaktionsbedingungen für eine reverse Transkriptase quantitative Polymerase-Kettenreaktion und die geeignete Mitogen- Konzentration zur maximalen Stimulation der Lymphozyten etabliert.

2 Literaturübersicht

2.1 Der Seehund (Phoca vitulina)

Der Seehund (Abbildung 1), die Kegelrobbe und der Schweinswal sind bekannte heimische marine Säugetierarten. Neben der Nordsee und dem deutschen Wattenmeer ist der Seehund (Phoca vitulina) auch in der Ostsee und im gesamten Nord-Atlantik verbreitet. Er kommt an den Küsten Norwegens, Englands, Islands, Süd-Ost- und West-Grönlands sowie in der kanadischen Arktis bis zum Kap Cod bei Boston vor (BONNER, 1989).

Abbildung 1: Juveniler Seehund (Phoca vitulina) in der Seehundstation Friedrichskoog e.V., Foto: J. SUNDERMEYER.

2.1.1 Taxonomie

Taxonomisch wird der Seehund der Ordnung der Carnivora (Fleischfresser; KING, 1983), der Unterordnung Pinnipedia (Flossenfüßler), der Familie Phocidae und der Unterfamilie Phocinae, sowie der Gattung Phoca zugeordnet.

Früher wurde die Spezies Phoca vitulina auf Grund von Verbreitungsunterschieden in vier weitere Unterarten Phoca vitulina steijnegeri (ALLEN, 1902), Phoca vitulina richardsi (GRAY, 1864), Phoca vitulina concolor (DE KAY, 1842) und Phoca vitulina vitulina (LINNAEUS, 1758) unterteilt. Als eine fünfte Subspezies wurde die Ungava Robbe Phoca vitulina mellonae (DOUTT, 1942) angeführt, was jedoch umstritten blieb (REIJNDERS, 1992). Die Zuordnung der Arten Phoca sibirica, Phoca hispida und Phoca caspica erfolgte zu der Gattung Pusa, da sie sich von der Gattung Phoca durch Kopfform, Geruch, Wurfplatz und Nahrung unterschieden. Nach weiteren Untersuchungen, unter anderem zur Kopfmorphologie, konnte diese Unterteilung nicht aufrecht erhalten werden. Die Gattung Phoca umfasst nach neusten Erkenntnissen insgesamt sieben Arten: Phoca fasciata, Phoca groenlandica, Phoca sibirica, Phoca hispida, Phoca caspica, Phoca vitulina und Phoca largha (KING, 1983).

Ordnung: Carnivora

Unterordnung: Pinnipedia Überfamilie: Phocoidea

Familie: Phocidae

Unterfamilie: Phocinae Gattung: Phoca

Arten: Phoca caspica (Kaspischer Seehund) Phoca fasciata (Bandrobbe)

Phoca groenlandica (Sattelrobbe) Phoca hispida (Eismeer-Ringelrobbe) Phoca largha (Largha Robbe) Phoca sibirica (Baikal-Ringelrobbe) Phoca vitulina (gemeiner Seehund)

2.1.2 Biologie

Die Körperform der Robben ist durch eine spindelförmige Gestalt an das Leben im Wasser angepasst und ermöglicht dadurch eine optimale Fortbewegung in diesem Medium. Die Kopfform ist kugelig mit abgeflachter Schnauze und durch ein Fehlen der Ohrmuschel gekennzeichnet. Seehunde haben vier Gliedmaßen, die deutliche Anpassungen an das Schwimmen aufweisen. Dies hat zur Namensgebung beigetragen, denn der Name Pinnipedia leitet sich von Pinna, die Flosse ab. Die Vordergliedmaßen sind kurz und die Hinterextremitäten ausschließlich nach hinten gerichtet und nur beschränkt beweglich. Die Bauchseite ist heller gefärbt als der Rücken bei einer stark variierenden Färbung von hell- bis dunkel-grau, bis gelblich- sandbraun mit kleinen schwarzen Flecken, die nicht deutlich abzugrenzen sind (PERRIN et al., 2009).

Die Größenangaben schwanken für männliche Tiere zwischen 150 und 190 cm, bei einem Gewicht zwischen 55 und 170 kg, und für weibliche Tiere zwischen 120 bis 170 cm Länge und einem Gewicht von 45 bis 130 kg. Die weiblichen Tiere sind somit etwas kleiner und leichter als die Männchen. Jungtiere sind bei der Geburt zwischen 70 und 90 cm lang und wiegen 9 bis 11 kg (DE JONG et al., 1997). Weibliche Seehunde werden mit durchschnittlich 3,92 Jahren geschlechtsreif und mit 4,46 Jahren zum ersten Mal trächtig (HÄRKÖNEN und HEIDE-JØRGENSEN, 1990).

Im Wattenmeer halten sich Seehunde in erster Linie zum Ruhen auf und nutzen hier ruhig gelegene Sandbänke als Liegeplätze (DE JONG et al., 1997). Zur Nahrungssuche wandern sie aus dem Wattenmeer hinaus in die tiefen Gewässer der Nordsee, wo sie vorzugsweise benthische Beutetiere jagen. Seehunde sind in Bezug auf ihre Ruhe- und Jagdplätze sehr ortstreu (BEHRENDS, 1985; ADELUNG et al., 2004). In den Sommermonaten halten sie sich häufiger an Land auf als während des restlichen Jahres und bringen nach einer Tragzeit von 10,5 bis 11 Monaten zwischen Mai und Juli ihre Jungen zur Welt. Das Geburtenhoch liegt in der zweiten Junihälfte.

Die Jungen werden 3 bis 6 Wochen bis zu einem Gewicht von ungefähr 24 kg gesäugt (HÄRKÖNEN und HEIDE-JØRGENSEN, 1990). Direkt im Anschluss an die

Entwöhnung findet im August die Paarung statt, die im Gegensatz zu vielen anderen Robbenarten, bei Seehunden im Wasser vollzogen wird (HEERS, 1999).

Seehunde sind Einzelgänger. Während sie sich im Meer aufhalten, vermeiden sie weitestgehend Kontakt zu Artgenossen. Auf ihren Ruheplätzen bilden sie allerdings lockere Gruppenverbände. Eine Gruppenhierarchie lässt sich allerdings nicht erkennen und eine räumliche Trennung nach Alter oder Geschlecht ist nicht zu beobachten. Lediglich während der Säugezeit sondern sich die Muttertiere mit ihren Jungen ab (BIGG, 1990).

Abbildung 2: Seehunde und Kegelrobben am Strand von Helgoland (Düne), Foto: H. Seibel.

2.2 Entwicklung der Seehundpopulation im Wattenmeer unter besonderer Berücksichtigung von Morbillivirusinfektionen

Die Populationsentwicklung der Seehunde weist Schwankungen auf. Ihr Weltbestand betrug 1989 300 000 bis 400 000 Tiere (BONNER, 1989). Seit 1951 wird die Seehundpopulation im Wattenmeer regelmäßig gezählt. Da der Bestand sich über die Staaten Dänemark, Deutschland und die Niederlande erstreckt, bedarf es der Koordination einzelner nationaler Monitoringprogramme, die vom Common Wadden Sea Secretariat (CWSS) durchgeführt wird (Abbildung 3).

Abbildung 3: Anzahl gezählter Seehunde im Wattenmeer, seit 1975;

NL = Niederlande (gelb); DK = Dänemark (grün);

Nds./ HH = Niedersachsen und Hamburg (beige);

SH = Schleswig-Holstein (blau; modifiziert nach BRASSEUR et al., 2008).

Seit den ersten Zählungen nahmen die Bestände an Seehunden im europäischen Wattenmeer, unter anderem bedingt durch die Jagd, stetig ab und erreichten Anfang der 70er Jahre ein Minimum mit ca. 3 500 Tieren (ABT, 2001), woraufhin die Einführung des Jagdverbotes für diese Tierart folgte. In den folgenden Jahren stagnierte ihre Anzahl. Erst seit 1979 nahm der Seehundbestand wieder kontinuierlich zu und erreichte Anfang 1988 mit ca. 4 500 Tieren in Schleswig-Holstein und knapp 10 000 gezählten Tieren im gesamten Wattenmeer sein vorläufiges Maximum. 1988 reduzierte eine Seehundstaupevirusepidemie innerhalb eines Jahres die Population der Seehunde im Wattenmeer um ca. 40 %. In Nord- und Ostsee zusammen starben mehr als 18 000 Seehunde (DIETZ et al., 1989, CWSS, 1991). Nach einer deutlichen Erholung der Population bis zum Jahr 2001 (TRILATERAL SEAL EXPERT GROUP, 2001) kam es durch eine erneute Seehundstaupevirusepidemie 2002 zu Verlusten von insgesamt ca. 21 000 Tieren, davon 3 206 in Schleswig-Holstein (REINEKING und COMMON WADDEN SEA SECRETARIAT, 2002; MÜLLER et al., 2004). Bei beiden Epidemien waren insbesondere juvenile Seehunde betroffen. Bei den mit den Seehunden auf den Sandbänken vergesellschafteten Kegelrobben fanden sich sehr viel geringere Todesraten (HÄRKÖNEN et al., 2006). Im Juni 2007 traten auf der dänischen Insel Anholt und in angrenzenden Gebieten der Ostsee erneut vermehrte Todesfälle unter juvenilen Seehunden auf, die sich im August bis nach Tanum in Schweden ausgebreitet hatten. Nachdem makroskopisch zunächst von einer erneuten PDV-Epidemie ausgegangen wurde, konnte letztlich kein definitiver Virusnachweis erbracht werden. Die Tiere starben an Lungenentzündungen, deren Ätiologie ungeklärt blieb (HÄRKÖNEN et al., 2008). Die Todesfälle beschränkten sich in diesem Fall auf die Ostsee, das Kattegatt und das Skagerrak (Statusreport vom CWSS, Nr.1-8, 2007) und gingen damit nicht in die Zählungen für das Wattenmeer ein. Dort hat sich seit der letzten Epidemie 2002 die Seehundpopulation erholt und es konnten im November 2008 in Schleswig-Holstein wieder 5 844 und insgesamt im Wattenmeer (Niederlande, Niedersachsen, Schleswig-Holstein und Dänemark) 20 250 Seehunde gezählt werden (BRASSEUR et al., 2008).

2.3 Morbillivirusinfektionen bei marinen Säugern

Zahlreiche marine Säuger sind in den vergangenen Jahren durch Morbillivirusepidemien gestorben. Davon betroffen waren Delphinpopulationen im Mittelmeer, im Golf von Mexiko und an der Ostküste der USA, sowie Robben in der Baikalsee, im Kaspischen Meer und der Nordsee (HEIDE-JØRGENSEN et al., 1992;

OSTERHAUS et al., 1995; KENNEDY, 1998; KENNEDY et al., 2000;

BAUMGÄRTNER et al., 2003; MÜLLER et al., 2004).

2.3.1 Das Staupevirus

Besser als das Seehundstaupevirus ist das sehr ähnliche Hundestaupevirus erforscht. Sein natürliches Wirtsspektrum umfasst die Familien der Canidae, der Hyaenidae, der Mustelidae, der Procyonidae, der Ailuridae, der Viveriidae, der Felidae, der Pinnipedia und der Cetacea. Auch Halsbandpekaries (Tayassu tajacu) und Japanmakaken (Macaca fuscata) sind für CDV empfänglich (YOSHIKAWA et al., 1989; VISSER et al., 1993a; VISSER et al., 1993b; APPEL, 2003; BEINEKE et al., 2009a; BEINEKE et al., 2009b).

Staupeviren sind einzelsträngige, behüllte RNA-Viren mit negativer Polarität, deren Genom für sechs Strukturproteinen und mehreren Nichtstrukturproteinen kodiert. Zu diesen Strukturproteinen gehören die Kapsidproteine, bestehend aus dem Nukleo- Protein (N-Protein) und dem Polymerasekomplex, einschließlich des Phospho- und large-Proteins (P- und L-Protein), sowie die Hüllproteine, bestehend aus dem Matrix- (M-Protein), dem Fusions- (F-Protein) und dem Hämagglutinin-Protein (H-Protein;

Abbildung 4; VANDEVELDE und ZURBRIGGEN, 2005). Die Viruspartikel haben eine sphärische, teils filamentöse Gestalt und eine Größe von 100 bis 700 nm. Auf der Virusoberfläche befinden sich Projektionen aus Glykoproteinen von 8 nm Länge. Das Nukleokapsid hat eine helikale Symmetrie mit einem Durchmesser von 12 bis 17 nm und einer Länge von maximal 1 µm. Die molekulare Masse beträgt über 500 kDa.

Das kanine Staupevirus ist im Bereich von pH 4,5 bis 9,0 stabil, wobei sein pH- Optimum zwischen pH 7,2 bis 8,0 liegt (HORZINEK, 1985; APPEL, 1987; FIELDS, 2007).

Abbildung 4: Strukturproteine des Staupevirions; N = Nukleo-Protein;

P = Phospho-Protein; M = Matrix-Protein; F = Fusions-Protein;

H = Hämagglutinin-Protein; L = large-Protein (ALLDINGER, 1994).

Das kanine und das phocine Staupevirus gehören zum Genus Morbillivirus der Subfamilie Paramyxovirinae der Familie Paramyxoviridae. Die Familie der Paramyxoviridae gehört ebenso wie die Familien Bornaviridae, Filoviridae und Rhabdoviridae zur Ordnung der Mononegavirales. Die Familie Paramyxoviridae besteht aus den beiden Subfamilien Paramyxovirinae (mit den Genera Avulavirus, Henipavirus, Morbillivirus, Respirovirus und Rubulavirus) und Pneumovirinae (mit den Genera Pneumovirus und Metapneumovirus; ALEXANDER, 2000; WANG et al., 2000; BOSSART et al., 2002; NJENGA et al., 2003; EASTON et al., 2004).

Zusätzlich existieren noch mehrere, bislang nicht näher klassifizierte Viren in der Subfamilie Paramyxovirinae, wozu das atlantische- und das pazifische Lachs Paramyxovirus, das Salmo salar Paramyxovirus, das Beilong Virus, das J-Virus, das Mossman virus, das Murayama virus, das Paramyxovirus GonoGER85, das reptilien

paramyxovirus, das Salem Virus, , das Schlangen ATCC-VR-1408 und -1409 Paramyxovirus, das Tupaia Paramyxovirus, das Fer-de-Lance-Virus, das Menangle Virus, das Nariva Virus und das Tioman Virus zählen (TIKASINGH et al., 1966;

KUSAGAWA et al., 1993; LYON et al., 1997; TIDONA et al., 1999; TAO et al., 2000;

KINDERMANN et al., 2001; CHUA et al., 2002; KIRKLAND et al., 2002; KURATH et al., 2004; JACK et al., 2005; FRANKE et al., 2006; LI et al., 2006; FALK et al., 2008;

TONG et al., 2008; NAYAK et al., 2008).

Dem Genus Morbillivirus werden das Hundestaupevirus (canine distemper virus, CDV), das humanpathogene Masernvirus (measles virus, MV), das Rinderpestvirus (RPV) und das Virus der Pest der kleinen Wiederkäuer (peste des petits ruminants, PPRV) zugeordnet. Für marine Säuger sind das cetacean morbillivirus (CMV), das Delphin Morbillivirus (DMV), das Seehundstaupevirus (phocine distemper virus, PDV), das Pilotwalmorbillivirus (pilot whale morbillivirus) und das Staupevirus der Schweinswale (porpoise morbillivirus, PMV) beschrieben (FIELDS, 2007; ICTVdB, 2008). Beim Seehundstaupevirus wurde zwischen PDV-1 und –2 unterschieden. Bei PDV-1 handelt es sich um das Virus, welches 1988 und 2002 in der Nord- und Ostsee die Epidemien verursacht hat (DIETZ et al., 1989; JENSEN et al., 2002;

MÜLLER et al., 2004). Selbiges konnte auch in westatlantischen Seehunden (VISSER et al., 1993a; JAUNIAUX et al., 2001), in Sattelrobben (Phoca groenlandica) und Klappmützen (Cystophora cristata) im westlichen Atlantik nachgewiesen werden (DUIGNAN et al., 1993; LIPSCOMB et al., 2001). Bei dem aus Baikalrobben (Phoca sibirica) isolierten PDV-2 handelt es sich eigentlich um CDV (MAMAEV et al., 1995). CDV und PDV sind genetisch eng miteinander verwandt (

Abbildung 5; BARRET, 1999; WOHLSEIN et al., 2007). Das PDV von 2002 stimmt mit CDV auf Aminosäureebene zu 74 % überein, und zum humanen Masernvirus und dem Rinderpestvirus besteht immer noch eine 36 %ige Übereinstimmung. Dies ergaben molekularbiologische Untersuchungen des Hämagglutinin-Gens und der daraus abgeleiteten Aminosäuresequenz, welche die Struktur und Funktion dieses Oberflächenproteins determiniert (JENSEN et al., 2002; MÜLLER et al., 2004).

Abbildung 5: Phylogenesebaum zum Vergleich verschiedener Morbilliviren mit dem Schwerpunkt auf PDV unter Verwendung der abgeleiteten Aminosäuresequenzen des H-Proteins. Dem bootstrapping wurden jeweils 1000 Replikate zu Grunde gelegt und die Auswertung erfolgte mit Treeview (Version 1.6.6). Das alignement wurde mit Clustal X (Version 1.8.3) durchgeführt (modifiziert nach MÜLLER et al., 2008).

PDV = phocine distemper virus, Seehundstaupevirus mit PDV/ mink4a = PDV Isolat 4a vom Nerz (Neovison vison; NCBI-gen bank accession Nummer AF 479275); PDV/ DK4a = PDV Isolat aus Dänemark; PDV/ DK88 = PDV Isolate aus Dänemark von 1988; PDV/ seal = PDV vom Seehund (Phoca vitulina; NCBI-gen bank accession Nummer AJ 224707);

PDV/ DK88-1a = PDV aus einer infizierten Vero Zelllininie aus Dänemark (NCBI-gen bank accession Nummer AF 479277); PDV/ Ulster88 = PDV Stamm aus Ulster von 1988 (CURRAN et al., 1992); PDV/ NL88 = PDV aus den Niederlanden von 1988 (NCBI-gen bank accession Nummer AJ224707); PDV2002 = PDV Isolat von 2002; Onderstepoort = canine distemper virus, Hundestaupevirus-Stamm (CURRAN et al., 1991); MVi/ Tokyo.Jpn/ 99- Y = humanes Masernvirus aus Japan (ZHOU et al., 2003); RP-K = Rinderpestvirus Stamm (AIANOT et al., 1998).

Für mehrere Morbilliviren, darunter auch das Masern- und Hundestaupevirus, wurde nachgewiesen, dass der Zelloberflächenrezeptor CD150 (SLAM, signaling lymphocyte activation molecule) als zellulärer Rezeptor für den Viruseintritt in die Zelle fungiert. Die Bindung des Virus an CD150 erfolgt durch das H-Protein (TATSUO et al., 2000; TATSUO et al., 2001; TATSUO und YANAGI, 2002). Bisher bekannt sind das humane, bovine, canine und murine CD150, sowie CD150 des Krallenaffens und Frettchens (TATSUO et al., 2001; KRUSE et al., 2001). Auch in Lymphozyten vom Seehund konnte CD150-spezifische mRNA nachgewiesen werden (SEIBEL et al., 2006). Beim Menschen ist CD150 auf der Oberfläche von T-und B-Lymphozyten, natürlichen Killerzellen und dendritischen Zellen lokalisiert und an der Regulation von Interferon-gamma (IFN-γ) (WANG et al., 2001;

SIDORENKO und CLARK, 2003) und der Herunterregulierung von Interleukin-12 (IL- 12) beteiligt (FUGIER-VIVIER et al., 1997). Seine Expression wird durch IL-1, sowie nach B-oder T- Zellstimulation hochreguliert (KRUSE et al., 2001).

Ein weiterer Masernviren genutzter Rezeptor ist CD46, das sogenannte complement regulatory protein (NANICHE et al., 1993; BUCHHOLZ et al., 1997; MANCHESTER et al., 2000; SUTER et al., 2005). Dieses Glykoprotein wird von beinahe allen menschlichen Zellen, mit Ausnahme von Erythrozyten und einigen Zellen im Zentralnervensystem (ZNS), gebildet (LISZEWSKI et al., 1991; JOHNSTONE et al., 1993; OGATA et al., 1997). CD46 bindet die Komplementproteine C3b und C4b und schützt dadurch die körpereigenen Zellen vor dem unspezifischen Abwehrsystem und der damit einhergehenden Lyse (LISZEWSKI et al., 1991; JOHNSTONE et al., 1993; LOVELAND et al., 1993). Bei einer Masernvirusinfektion wird CD46 nach Kontakt mit Viruspartikeln oder mit infizierten Zellen herunterreguliert und die komplementvermittelte Lyse wird ermöglicht (NANICHE et al., 1993; SCHNORR et al., 1995; KRANTIC et al., 1995; FIRSCHING et al., 1999). Durch Bindung von Masernviren an CD46 kommt es wie bei CD150 zur Suppression von IL-12 (KARP et al., 1996).

2.3.2 Pathogenese und Morbillivirusinfektion bei Pinnipedia

Das Hundestaupevirus verursacht bei Hunden je nach Immunitätslage eine abortive, subklinische oder schwere systemische, häufig letale Infektion (KRAKOWKA et al., 1985; BAUMGÄRTNER et al., 2003). Es breitet sich über Makrophagen, Lymphozyten und Thrombozyten im Körper aus und infiziert im weiteren Verlauf auch Epithel- und Bindegewebszellen (KRAKOWKA et al., 1978; APPEL, 1987;

ALLDINGER, 1994; BAUMGÄRTNER et al., 2003; BEINEKE et al., 2009a). Bei infizierten Tieren wurden verschiedene Manifestationen festgestellt, die sich den drei Verlaufsformen der systemischen, nervösen oder katarrhalischen Staupe zuordnen lassen. Bei letzterer stehen intestinale und respiratorische Symptome im Vordergrund des klinischen Bildes und prägen auch das morphologische Befundspektrum (APPEL, 1987; MIAO et al., 2003; BAUMGÄRTNER et al., 2003;

KOUTINAS et al., 2004).

Seehunde können sich sowohl mit dem Seehund-, als auch mit dem Hundestaupevirus infizieren. Die Inkubationszeit eines aus der Zellkultur stammenden PDV-Isolates (PDV 2558/ Han 88) beträgt bei Seehunden zwischen 5 und 12 Tagen (HARDER et al., 1990). Ein signifikanter Anstieg der neutralisierenden Serum-Antikörpertiter wird ab dem 16. Tag post infectionem gefunden. Mit PDV infizierte Seehunde zeigen Veränderungen in allen lymphatischen Organen (KENNEDY, 1998; JENSEN et al., 2002). Durch diese besondere Affinität zu lymphatischen Geweben, die sich bei Seehunden in einer ausgeprägten Lymphozytolyse mit lymphozytärer Depletion in Lymphknoten, Milz, Thymus, Mandeln und Schleimhaut-assoziierten lymphatischen Geweben äußert (WÜNSCHMANN et al., 2000; MÜLLER et al., 2004), kommt es zu einer Immunschwächung. Diese begünstigt die Ausbreitung von bakteriellen Sekundärinfektionen. Klinisch zeigt sich die PDV-Infektion beim Seehund mit Fieber, Husten, Dyspnoe, Aborten, sowie serösem bis mukupurulentem, okulo-nasalem Ausfluss. Histopathologisch werden vorwiegend respiratorische Veränderungen in Form einer interstitiellen Pneumonie, oftmals durch bakterielle Sekundärinfektionen in Form einer eitrigen Bronchopneumonie kompliziert, mit einem alveolären und

interstitiellen Emphysem, sowie nicht-eitrige Enzephalitiden mit Degeneration und Nekrose der Neuronen gefunden. Es finden sich eosinophile, zytoplasmatische und intranukleäre Einschlusskörperchen in verschiedenen Zellen von Gehirn, Lunge, Leber, Nieren, Pankreas und Darm. Als Sekundärerreger wurde häufig Bordetella bronchiseptica isoliert (BERGMAN et al., 1990; KENNEDY, 1998; KENNEDY, 1999;

BAUMGÄRTNER et al., 2003; LAWSON und JEPSON, 2004; PHILIPPA et al., 2009). Die Pathogenese einer CDV-Infektion des Seehundes verläuft analog zu der oben beschriebenen PDV-Infektion (SVANSSON et al., 1993).

2.4 Immunsystem und Zytokine bei marinen Säugern

2.4.1 Das Immunsystem im Allgemeinen

Grundsätzlich unterscheidet sich das Immunsystem des Seehundes in seinem Aufbau nicht von dem der an Land lebenden Säugetiere. Es werden das unspezifische, angeborene Immunsystem und das spezifische, erworbene Immunsystem unterschieden. Das erworbene Immunsystem setzt sich aus der humoralen und der zellulären Abwehr zusammen. Die humorale Abwehr ist durch die Antikörperproduktion durch B-Zellen gekennzeichnet, während die zelluläre Abwehr durch zytotoxische- und Suppressor T-Zellen, sowie T-Helfer Zellen (Th) vermittelt wird. Ist am Anfang einer Infektion das unspezifische Immunsystem aktiv, so kommt es im weiteren Verlauf zur Aktivierung des spezifischen Immunsystems.

Antigenpräsentierende Zellen fragmentieren und präsentieren das Antigen immunkompetenten Zellen, zu denen T- (im Thymus geprägte) und B- (im Knochenmark, bone marrow, geprägte) Lymphozyten gehören. Je nach Art des Antigens bilden sich unterschiedliche Th-Subpopulationen aus, die eine humorale oder zelluläre Immunantwort induzieren. Sie bilden sich aus Th0-Vorläuferzellen und werden im Thymus zu Th1-, Th2- und Th3-Subpopulationen differenziert. Th1- und Th2-Zellen hemmen sich gegenseitig, während beide ihrerseits von Th3-Zellen gehemmt werden, die damit eine Regulatorfunktion im Immunsystem übernehmen.

Die Th-Subpopulationen können anhand ihrer Zytokinexpression unterschieden werden (TIZARD, 2008; MURPHY et al., 2008).

Die Stärke dieses Systems liegt in seiner Vielfalt von verschiedenen Reaktionsmöglichkeiten, die wiederum von zahlreichen Faktoren, darunter die Natur und Konzentration des eindringenden Agens, die auf die Zellen einflussnehmenden Faktoren in ihrer unmittelbaren Umgebung, sowie die Funktionalität der reagierenden Wirtszellen beeinflusst werden (KIDD, 2003).

Bisher gibt es nur wenige Studien, die das Immunsystem von jungen Pinnipedia untersucht haben. Die Entwicklung einer guten Immunantwort ist für das Überleben essentiell. Zum Zeitpunkt der Geburt ist ihr Immunsystem noch nicht vollständig entwickelt. Dies zeigt sich durch erniedrigte Immunglobulin-Konzentration im Blut. Als vorübergehender Schutz dienen die maternalen Antikörper, die das Jungtier über das Kolostrum aufnimmt (ROSS et al., 1993; ROSS et al., 1994; KING et al., 1998). Ein unterentwickeltes Immunsystem äußert sich bei Kegelrobben (Halichoerus grypus) durch eine reduzierte Phagozytoseaktivität von Makrophagen und eine reduzierte Transformation von Lymphozyten (LALANCETTE et al., 2003). Bei juvenilen Seehunden sind eine starke Mitogen-induzierte Lymphozytenproliferation und effiziente T-Lymphozyten-Funktionen nachweisbar (ROSS et al., 1993; ROSS et al., 1994; KAKUSCHKE et al., 2005). Neugeborene Seehunde zeigen eine relative Immunkompetenz, möglicherweise als evolutionäre Anpassung an die kurze Säuge- und Pflegezeit durch die Muttertiere (ROSS et al., 1994).

2.4.2 Zytokine

Jede Immunzelle kann eine Vielzahl an Botenstoffen abgeben, die zu anderen Zellen (Immun- und nicht-Immunzellen) gelangen und diese stimulieren oder hemmen können. Zytokine spielen hierbei eine wichtige Rolle. Ihre Produktion durch Th1- und Th2-Zellen variiert stark und kann leicht durch experimentelle Variablen beeinflusst werden (AGGARWAL, 1998; BALKWILL, 2000). Zytokine sind einfache Polypeptide oder Glykoproteine mit einer geringen molekularen Masse, die der Kommunikation der Zellen des Immunsystems (autokrin, parakrin und endokrin) dienen, sowie initiierend und regulierend auf den Verlauf einer Immunantwort wirken. Darüber

hinaus sind Zytokine an der Pathogenese verschiedener Erkrankungen sowie der Fieberinduktion beteiltigt (GRÖNE et al., 1998; FRISK et al., 1999). Der biologische Effekt eines Zytokins ist vielseitig (Pleiotropie). Es werden Interleukine (IL), Interferone (,  und ; IFN), Tumor-Nekrose-Faktoren ( und ; TNF), Kolonie- stimulierende-Faktoren (beispielsweise Growth Factor, TGF) und Chemokine unterschieden. Eine weitere Einteilung in pro-inflammatorische (IL-1, IL-6, IL-8, IL- 12, TNF, IFN) und anti-inflammatorische Zytokine (TGF, IL-4, IL-10) ist möglich (NAVIKAS und LINK, 1996). IL-2, IFN, IL-12 und TNF werden von Th1-Zellen produziert, während Th2-Zellen IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13, und Th3-Zellen TGFβ bilden (MURPHY et al., 2008).

Eine Auflistung der bisher bekannten Nukleotidsequenzen verschiedener pro- und anti-inflammatorischer Zytokine des Seehundes findet sich in der Gendatenbank des National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov). Vergleiche mit bekannten Zytokin-mRNA- und Aminosäuresequenzen anderer Säugetiere zeigen, dass die Zytokine innerhalb der verschiedenen Pinnipediaspezies eine monophyletische Gruppe bilden. Die Zytokine der Robben besitzen weitgehende Strukturgleichheiten mit den Zytokinen anderer Karnivoren, wie z.B. dem Hund (KING et al., 1996; SHODA et al., 1998; ST-LAURENT et al., 1999). Konservierte Regionen finden sich vorwiegend in den biologisch aktiven Abschnitten der Moleküle wie beispielsweise den rezeptorbindenden Regionen (KING et al., 1996).

Eine Übersicht ausgewählter biologischer Eigenschaften der untersuchten Zytokine findet sich in Tabelle 1 (Seite 19).

2.4.2.1 Interleukin 6 (IL-6)

IL-6 ist ein pleiotropes Zytokin mit einer molekularen Masse von 21 bis 28 kDa (MAY et al., 1988). Es wird im Körper sowohl von lymphoiden als auch nicht lymphoiden Zellen, darunter aktivierte T- und B-Zellen, sowie von Monozyten gebildet (ANDUS et al., 1987; HIRANO und KISHIMOTO, 1992). Es ist ein klassisches pro- inflammatorisches Zytokin und Hauptstimulator der Akuten-Phase-Reaktion (TIZARD, 2008; KISHIMOTO, 2003). Seine Zielzellen sind T- und B-Lymphozyten,

myeloide Progenitorzellen, Fibroblasten und Hepatozyten (GAULDIE et al., 1987;

WONG et al., 1988; RODMAN et al., 1992), in denen IL-6 eine große Wirkung auf Zellwachstum und Aktivierung hat. Durch Anregung der IL-2 und IL-2R-Produktion in den Zielzellen hat es Einfluss auf die T-Zell Differenzierung. In B-Zellen ist IL-6 an der finalen Maturation in Plasmazellen beteiligt (TIZARD, 2008; MURPHY et al., 2008). Es nimmt Anteil an der Polysaccharid-spezifischen Antikörperproduktion in humanen B-Zellen (AMBROSINO et al., 1990), wo es eine essentielle Rolle bei der IL-4 abhängigen IgE-Synthese spielt (VERCELLI et al., 1989). IgE bindet an Mastzellen und Basophile. Diese sensibilisierten Abwehrzellen lösen daraufhin die Freisetzung von vasoaktiven Aminen (vorwiegend Histaminen) aus. Dies führt zur Atopie gekennzeichnet durch Urtikaria (lokale Reaktion) und Anaphylaxie (systemische Reaktion). Daneben kommt es durch eine hohe IL-6 und TNFα- Expression zu Fieber und der Produktion von Akute-Phase-Proteinen (TIZARD, 2008; MURPHY et al., 2008). Im Rahmen von Gewebsschädigungen (hier durch eine Virusinfektion) kommt es zu dieser unspezifischen Immunreaktion. Endothelzellen, Fibroblasen und Entzündungszellen beginnen im geschädigten Gewebe mit der Freisetzung von Mediatoren (IL-6, TNFα, TGFβ, IFNγ, epidermal growth factor oder leucocyte inducing factor), die über die Blutbahn die Leber erreichen und dort in Anwesenheit von Cortisol die Ausschüttung verschiedener Akute-Phase-Proteine stimulieren. Es werden 30 verschiedene Akute-Phase-Proteine unterschieden. Ihre Konzentration nimmt innerhalb von 6 bis 48 Stunden nach dem entsprechenden Ereignis auf das zwei- bis eintausendfache zu.

Des Weiteren nimmt IL-6 zusammen mit IL-1 als Co-Faktor in der IgM-Synthese und zusammen mit IL-5 in der IgA-Synthese eine wichtige Rolle ein (MURPHY et al., 2008). Seine Produktion wird in humanen B-Zellen durch IL-4 induziert (SMELAND et al., 1989). IL-6 seinerseits ist ein potenter Induktor für die Produktion von IL-4 in T- Zellen (RINCON et al., 1997) und kann die spontane IL-4 bedingte Proliferation von humanen B-Zellen hemmen (PANDRAU et al., 1992).

Tabelle 1: Ausgewählte biologische Eingenschaften der in dieser Arbeit untersuchten Zytokine und ihr Einfluss auf verschiedene Zellenpopulationen (TIZARD, 2008; THOMSON und LOTZE, 2003;

MURPHY et al., 2008).

Einfluss auf Zytk. B-Zellen T-Zellen Makrophagen

und Monozyten

Myeloische Zellen

Andere Zellen und Gewebe

IL-6

 ↑ Differen- zierung

 Beteiligt an finaler Maturation in Plasmazellen

 Beteiligt an Polysaccharid- spezifischer Ak-Produktion

 ↓ IL-4

 ↑ T- Zelldifferen- zierung

 ↑ TNFα- Sekretion

 ↑ IL-4- Produktion 

↑ Th2

 ↑ IL-10 Sekretion

 Beteiligt an durch Makrophagen vermittelter Protektion gegen Bakterien

 ↑ IL-6 in Makrophagen

 ↓ TNF α

 ↑ Wachstum myeloider Progenitor- zellen

 ↑ Akute Phase Reaktion 

↑ Hapto- globin, Fibrinogen (Bsp.)

 ↑ CRP

IL-12

 ↑ Ig-Sekretion aber ↓ IgE- Produktion durch ↓ IL-4

 ↑ IL-10 (paradoxer Effekt)  B-Zell abhängiger Th1  Th2 Wechsel

 ↑ Sekretion von IL-2 und IFNγ  Co- stimulator von Th1- Zellen

 ↑ T-Zell Proliferation

 ↑ IL-10

 ↑ Th1

 ↑ lytisches Potenial von Tc-Zellen

 ↑ Proliferation von NK

 ↑ zusammen mit z.B. GM-CSF und IL-4 die Proliferation von Knochenmark- Vorläuferzellen

 ↑ DC

 ↑ hemato- poetische Vorläufer- zellen

TNFα

 ↑ Bildung von Superoxiden

 ↑ Tc-Zellen

 Zytotoxizität

 ↑ der Apoptose maturer T-Zellen

 ↑ TGFβ und IFNγ

 ↓ Differen- zierung und Proliferation

 ↑ NK- Funktionen  NO-Produktion

 ↑ MHC I auf Gefäßendothel- zellen

 ↓ Proliferation von

Gefäßendothel- zellen

 Aus- schüttung von Stress- Hormonen

 Fieber

IL-4

 ↑ von MHC II Antigenen und Co-

stimulierenden Molekülen

 Induziert Ig Isotyp Wechsel bei IgG1 und IgE- Produktion durch ↑ der Th2-Zellen

 ↑ Wachstum von normalen und Tc- Zellen

 Fördert Th2- und Th1- Zelldifferen- zierung und Wachstum

 ↑ Wachstum, hemmt aber IL- 2 induziertes Wachstum und Zytotoxizität

 ↓ Aktivierung von Makrophagen

 ↑ zusammen mit GM-CSF die Differenzierung von

Knochenmark- Vorläuferzellen in DC

 ↑ MHC II Expression und gewährleistet Fähigkeit der Ag-Präsentation

 Induziert Freisetzung von Histamin durch Mastzellen

Tabelle 1: (Fortsetzung)

Einfluss auf Zytk. B-Zellen T-Zellen Makrophagen und

Monozyten

Myeloische Zellen

Andere Zellen und Gewebe

IL-4

 Induziert Aggregation und Mikrovilli Formation

 ↑ Ig- Produktion und CD23 Expression

 ↑ Wachstum und Differen- zierung

 ↑ IL-6- Produktion

 Fördert zusammen mit TGFβ Differen- zierung von naiven T- Zellen in Th1-Zellen

 ↑ Wachstum und Überleben

 ↑ Th2

 ↓ IFNγ- Produktion

↑ IL-4 in Makrophagen 

↓ TNF α und Serin Esterase

 Steuert Th1- Antwort durch Induzierung der Apoptose von lymphoiden und maturen myeloiden DC

 ↑ IL-12- Produktion

 ↑ VCAM-1 Expression auf Endothelien

 ↑ Rekru- tierung von Gedächtnis- T-Zellen, eosinophilen Granulozyt.

und DC

 ↓ Hapto- globin in Hepatozyten

IL-10

 T-Zell unabhängige B-Zellantwort, Isotyp Wechsel, Wachstum und Differen- zierung

 ↑ MHC II

 ↓ IFNγ- und TNFα- Synthese durch Th1- Zellen  Anergie

 ↓ Th1-Zellen

 ↑ Th2-Zellen

 ↑ Maturation und Proliferation von Tc-Zellen

 ↓ Zytokin- synthese (z.B.

IL-6, IL-12, TNFα), Rezeptor- expression (CD80, CD86, MHC II), APC- Funktionen  ↓ NK

 ↓ reaktive O2 und N2-Intermediate

 ↓ Chemokinexp.

Der Monozyten

 ↓ bakterizide Antwort von Makrophagen auf IFNγ

 ↓ Expression des ICAM-1 Rezeptors auf Gefäßendo- thelzellen

 ↓ Zytokin- synthese, Rezeptor- expression (CD80, CD86, MHC I und II) und APC- Funktionen in DC

 ↑ IL-10 in Makrophagen

 ↓ TNF α

 ↑

Proliferation von Mastzellen

 ↓ Chemokin und Zytokin Sekretion durch neutrophile Granulo- zyten

TGFβ

 ↓ Wachstum

 ↑ IgA- Synthese

 ↓ IgG- und IgM-Synthese

 ↑ Apoptose

 ↓ Wachstum/

Proliferation

 ↑ Überleben

 ↓ IL-12

 ↓ Aktivierung

 ↓ respiratory burst in Monozyten

 ↑ Zytokin- Produktion in neutrophile Granulo- zyten

 ↑ und ↓ Zell- wachstum



Zytk. = Zytokin; IL = Interleukin; NK = natürliche Killerzellen; ↑ = induziert/ verstärkt; MHC II = Haupthistokompatibilitäts-Komplex der Klasse II; Ig = Immunglobulin; CD = cluster of differentiation;

Th = T-Helfer-Zellen; TGFβ = Transforming Growth Factor – beta; GM-CSF = granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; DC = Dendritische Zellen; Ag = Antigen; VCAM-1 = vascular cell adhesion molecule 1; ↓ = inhibiert/ schwächt ab; IFNγ = Interferon-gamma; Tc = zytotoxische T-Zellen;

APC = Antigenpräsentierende Zellen; ICAM-1 = intercellular adhesion molecule 1; NO = Stickoxide;

AK = Antikörper; CRP = C-reaktives Protein.

2.4.2.2 Interleukin 12 (IL-12)

IL-12 ist ein heterodimeres Glykoprotein mit der molekularen Masse von 70 kDa (p70), das sich aus einer 35 kDa (p35) und einer 40 kDa (p40) Untereinheit zusammensetzt (KOBAYASHI et al., 1989; TRINCHIERI, 1997). Es wird von antigenpräsentierenden Zellen, darunter Monozyten und B-Zellen, gebildet und gehört zu den pro-inflammatorischen Zytokinen (TRINCHIERI et al., 1992). Es stimuliert die Proliferation ruhender und aktivierter T-Zellen und fördert die Bildung von Th1- aus Th0-Zellen (TRINCHIERI, 1993; O´GARRA und ARAI, 2000). IL-12 induziert die Produktion von IFN durch T-Zellen, aktiviert natürliche Killerzellen und inhibiert die IL-4-Produktion (CHEHIMI und TRINCHIERI, 1994). Es scheint zusätzlich für die Bekämpfung viraler Infektionen besonders wichtig zu sein (DALOD et al., 2002). Morbilliviren nutzen IL-12, um sich dem Immunsystem zu entziehen (FUGIER-VIVIER et al., 1997; KARP et al., 1996). Sie binden an CD46, als zellulären Rezeptor und induzieren auf diese Weise eine Herunterregulierung von IL-12.

Dadurch und durch den Wegfall des regulierenden Einflusses auf IL-4 kommt es zum Absinken der Anzahl an Th1-Zellen und zur Verschiebung der Immunantwort in Richtung Th2-Antwort (CHEHIMI und TRINCHIERI, 1994; SCHMITT et al., 1994;

HENDRZAK und BRUNDA, 1995; MARSHALL et al., 1995; SCHARTON-KERSTEN et al., 1995; HEUFLER et al., 1996; TRINCHIERI, 1997). Dies hat eine generalisierte Immunsuppression zur Folge (GANS et al., 1999).

Außerdem fördert IL-12 die Produktion von IL-10 durch B- und T-Zellen (ASSENMACHER et al., 1998; SKOK et al., 1999). Die Bedeutung dieses paradoxen Mechanismus ist noch nicht geklärt. Es könnte sich um einen negativen Feedbackmechanismus handeln, mit dem die Wahrscheinlichkeit des Auftretens von IL-12-vermitteltem Schaden während einer chronischen Entzündung verringert wird (LEONARD et al., 1997).

2.4.2.3 Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNFα)

TNF ist ein pleiotropes Zytokin mit der molekularen Masse von 26 kDa. Es wird als Typ II-Transmembran-Vorläuferpolypeptid synthetisiert, das sich auf der Zellplasmamembran mit dem N-Terminus im Zytoplasma und dem C-Terminus im extrazellulären Raum darstellt. Das biologisch aktive, sezernierte TNFα hat die molekulare Masse von 17 kDa (KRIEGLER et al., 1988). Es wird von zahlreichen Immunzellen, darunter B- und T-Lymphozyten, Makrophagen, natürlichen Killerzellen, sowie neutrophilen, basophilen und eosinophilen Granulozyten gebildet und gehört zu den pro-inflammatorischen Zytokinen (CARSWELL et al., 1975;

KOBAYASHI et al., 1987; SUNG et al., 1988; STEFFEN et al., 1989; GORDON und GALLI, 1990). TNFα hemmt die Proliferation von aktivierten T- und B-Zellen (SUGARMAN et al., 1985) und induziert die Expression von MHC I und II (POBER et al., 1987; PUJOL-BORRELL et al., 1987). Durch Bakterien und deren Produkte (z.B.

Lipopolysaccharide), Viren, Mykoplasmen, Immunkomplexe, Zytokine (wie IL-1, IL- 2, IFN), Tumorzellen und Komplement (C5a) kommt es zur Induktion von TNF

(AGGARWAL et al., 1985; OLD, 1985; SCHNEIDER-SCHAULIES et al., 1993). Es hat des Weiteren einen zytotoxischen Effekt, der über den Kontakt von Zelle zu Zelle vermittelt werden kann (KRIEGLER et al., 1988) und spielt damit eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Abwehr von Bakterien (FLYNN et al., 1995) und intrazellulären viralen Pathogenen (BEUTLER und CERAMI, 1986; PAUL und RUDDLE, 1988). TNF hemmt die Virusausbreitung durch Aktivierung von Makrophagen und zytotoxischen T-Zellen (VASSALLI, 1992; GRÖNE et al., 2002).

Durch Hundestaupe- und Masernvirusinfektionen kommt es in vitro zu einer vermehrten Expression der pro-inflammatorischen Zytokine IL-1 und IL-6, die TNFα hemmen (SCHNEIDER-SCHAULIES et al., 1993; BENCSIK et al., 1996; MARKUS et al., 2002). Außerdem wird TNFα in Makrophagen durch Prostaglandin E2, TGFβ, IL-4, IL-6, IL-10 und zahlreiche virale Stoffwechselprodukte gehemmt (WANG et al., 2003).

2.4.2.4 Interleukin 4 (IL-4)

IL-4 ist ein Glykoprotein mit einer molekularen Masse von etwa 15 kDa. Es wird von aktivierten T-Lymphozyten, vorrangig Th2-Zellen, natürlichen Killerzellen, Mastzellen, sowie eosinophilen und basophilen Granulozyten produziert (YOSHIMOTO und PAUL, 1994; MOQBEL et al., 1995; VELAZQUEZ et al., 2000). Bei IL-4 handelt es sich um ein anti-inflammatorisches Zytokin, das Einfluss auf eine große Anzahl von Zellen, darunter Dendritische Zellen (DC) und T-Lymphozyten nimmt, die in der adaptiven Immunantwort eine wichtige Rolle spielen (OKADA und KUWASHIMA, 2002). Es stimuliert das Wachstum und die Differenzierung von B-Zellen sowie die Entwicklung von ruhenden zytotoxischen T-Zellen. IL-4 induziert die Entwicklung von Th0- in Th2-Zellen (PARRONCHI et al., 1992) und kann im Beisein von TGFβ in vitro auch positiv auf die Differenzierung von Th0- in Th1-Zellen Einfluss nehmen (LINGNAU et al., 1998). In murinen B-Zellen erhöht IL-4 die Anzahl an MHC II-Antigenen auf der Zelloberfläche und von Co-stimulierenden Molekülen (NOELLE et al., 1984). Es induziert die Aggregation von murinen Lymphozyten, indem es Einfluss auf die Formation von Mikrovilli nimmt (ELENSTRÖM und SEVERINSON, 1989) und fördert die Expression des IgE-Rezeptors CD23 auf B-Zellen (DEFRANCE et al., 1987). In aktivierten T-Zellen hemmt IL-4 die Produktion von IFNγ (PELEMAN et al., 1989) und begünstigt damit die Generation der Th2-Zellen mit ihrer Produktion von IL-4, IL-5, IL-6 und IL-10. Dies führt in der Folge zu einem Immunglobulin Isotyp class-switching in der IgG1- und IgE-Produktion.

Auch auf myeloide Zellen nimmt IL-4 Einfluss. Es fördert zusammen mit dem granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) die in vitro Differenzierung von Blutmonozyten in DCs und durch die Regulierung der MHC II-Expression die Möglichkeit der Antigenpräsentation (ROMANI et al., 1994;

SALLUSTO und LANZAVECCHIA, 1994). In natürlichen Killerzellen hemmt IL-4 die Produktion von TNFα und der Serin-Esterase (BLAY et al., 1990). Es führt zu einer Hochregulation in der Expression des vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) auf Endothelzellen und fördert damit die Rekrutierung von VLA-4+ Zellen (Gedächtnis-T-Zellen, eosinophile Granulozyten und DCs; THORNHILL et al., 1991;

SCHLEIMER et al., 1992). Die endogene Produktion von IL-4 bei Viruserkrankungen

spielt eine wichtige Rolle bei den Antigen-spezifischen zytotoxischen Zellen. T-Zell- Klone, die mit IL-4 kultiviert wurden, exprimierten eine Lipase, die möglicherweise ihrerseits einen zytolytischen Prozess begünstigt (GRUSBY et al., 1990).

2.4.2.5 Interleukin 10 (IL-10)

IL-10 ist ein Schlüsselregulator der Immunantwort. Seine molekulare Masse schwankt von Spezies zu Spezies zwischen 17 und 21 kDa, da bei diesem Polypeptid eine heterogene Glykosylierung am N-Terminus vorliegt (MOORE et al., 1993). Es wird von aktivierten T-Zellen, B-Zellen, Monozyten, Mastzellen, Keratinozyten und eosinophilen Granulozyten gebildet (MOORE et al., 1993;

NAKAJIMA et al., 1996). IL-10 hemmt multiple Immunantworten, indem es auf verschiedene Zellen wirkt und gehört zu den anti-inflammatorischen Zytokinen. Es hemmt die Produktion von pro-inflammatorischen Zytokinen wie TNFα und IL-1 und stimuliert Th2-Zellen (FIONENTIONO et al., 1989; WAAL MALEFYT et al., 1993).

Des Weiteren hemmt IL-10 in Monozyten und Makrophagen die Synthese von IL-1α1, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-12, TNFα, GM-CSF und reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffintermediaten. In DCs hemmt es die Stimulation der IFNγ-Produktion und die Antigen-Präsentation zu Th1-, nicht aber zu Th2-Zellen, indem es die Produktion von IL-1 Rezeptor Antagonisten in neutrophilen Granulozyten fördert (MOORE et al., 1993). Es hemmt die Expression von Chemokinen durch Monozyten (BERKMAN et al., 1995) und die bakterizide Antwort von Makrophagen auf IFNγ (MURRAY et al., 1997). Seinerseits wird IL-10 in Monozyten durch IL-4 gehemmt (WAAL MALEFYT et al., 1993) und zusätzlich besteht eine Autoregulation (DE WAAL MALEFYT et al., 1991).

IL-6 und IL-12 dagegen induzieren die IL-10-Produktion in humanen T-Zellen (DAFTARIAN et al., 1996). Beim Auftreten schwerer Infektionen und dem Vorliegen von Stressfaktoren werden Zytokine, Hormone und Arachidonsäurederivate ausgeschüttet, die die IL-10-Synthese in Monozyten, Makrophagen und T-Zellen fördern (LE MOINE et al., 1996; MARCHANT et al., 1994a). Diese erhöhte IL-10- Produktion ist beim Menschen mit Septikämien assoziiert (MARCHANT et al., 1994b). Die Bildung von IL-10 wird von vielen Pathogenen, die direkt Monozyten

(Bakterienwandbestandteile, Parasiten, Pilze, HIV), B-Zellen (Epstein Barr Virus) oder T-Zellen (humanes T-Zell Leukemie Virus Typ 1) aktivieren, induziert (SIELING et al., 1993; BURDIN et al., 1993; BORGHI et al., 1995; VECCHIARELLI et al., 1996;

MORI et al., 1996; BRIGINO et al., 1997). Auch bei dem Persistieren einer Masernvirusinfektion wird IL-10 gebildet (OVSYANNIKOVA et al., 2006).

2.4.2.6 Transforming Growth Factor beta (TGFβ)

TGFβ gehört zur Familie der Polypeptid-Faktoren (MASSAGUE, 1990) und liegt in seiner biologisch aktiven Isoform als Dimer mit einer molekularen Masse von 25 kDa vor (HOWE, 2003). TGFβ ist ein charakteristischer Marker für Th2-Zellen und wird daneben noch von einer großen Anzahl unterschiedlicher Zellen produziert (ELENKOV und CHROUSOS, 1999; HOWE, 2003; KIDD, 2003). Es induziert die Zytokinproduktion in Monozyten und stimuliert die IgA-Sekretion durch B-Zellen, während es die IgG- und IgM-Sektion hemmt. Des Weiteren hemmt TGFβ das Wachstum von Lymphozyten und schwächt den respiratory burst von Monozyten ab (HOWE, 2003). Im Blut von Hunden mit einer natürlichen CDV-Infektion und bei einer zerebralen Demyelinisierung wurde eine vermehrte Bildung von TGFβ beobachtet.

Allerdings ist TGFβ eher bei einer chronischen CDV-Infektion von Bedeutung (GRÖNE et al., 1998), während es in der frühen Phase einer Staupevirusinfektion keinen Einfluss zu nehmen scheint (BEINEKE et al., 2008).

2.4.3 Das Immunsystem beeinflussende Faktoren

Es gibt viele verschiedene Faktoren, die das Immunsystem von Seehunden beeinflussen können. Neben anthropogenen Faktoren wie Umweltgiften, organischen und anorganischen Schadstoffen oder Medikamentenrückständen, sind es insbesondere Krankheitserreger. Dabei haben Staupeviren durch vergangene Epidemien (vgl. 2.2) besondere Bedeutung erlangt.

Das phocine Morbillivirus wurde 1988 während der Seehundstaupe-Epidemie erstmals aus Seehunden und Kegelrobben isoliert und beschrieben (OSTERHAUS und VEDDER, 1988). Bis dahin wurde davon ausgegangen, dass vorwiegend Landraubtiere für eine Morbillivirusinfektion empfänglich sind. Mittlerweile wurden bei zahlreichen Meeressäugern Morbilliviren festgestellt (vgl. 2.3). Durch den lytischen Effekt von CDV auf Lymphozyten und Makrophagen kommt es zu Beginn der Infektion zur Virus-assoziierten Immunsuppression (KRAKOWKA et al., 1978). Sie kann nach erfolgreicher Rekonvaleszenz noch Monate lang im Lymphozyten- Transformation-Test nachgewiesen werden (KRAKOWKA et al., 1978; KRAKOWKA et al., 1985). Verantwortlich für die langandauernde Immunsuppression soll die Aktivierung einer mononukleären Suppressorzellen-Population sein (KRAKOWKA, 1982). Es wird diskutiert, dass in Analogie zur Masernvirusinfektion des Menschen bei der Staupevirusinfektion die zelluläre Immunantwort wichtiger ist als die humorale (GERBER und MARRON, 1976; KRAKOWKA et al., 1978; BLIXENKRONE-MÖLLER et al., 1993). Masernvirusinfektionen induzieren eine Th2-Antwort und es ist anzunehmen, dass diese Zytokinimbalanzen eine entscheidende Rolle in der Ausbildung der Immunsuppression spielen (GRIFFIN, 1995; KARP et al., 1996;

MOSS et al., 2002; MOSS et al., 2004). In der frühen Phase einer Infektion finden sich vermehrt pro-inflammatorische Zytokine der Th1-Zellen, wie IL-1, IL-6, IL-12, TNF (DINARELLO, 2000; KIECOLT-GLASER et al., 2003). Dies gilt sowohl bei Masernvirusinfektionen, als auch für die frühe Krankheitsphase von durch CDV verursachten Läsionen im ZNS (MARKUS et al., 2002). Bei Ausbreitung der Infektion und Persistenzen sind hauptsächlich anti-inflammatorische Th2-Zytokine mit einer spontanen Sekretion von IL-4, IL-10 und TGFβ nachweisbar (GRIFFIN und WARD, 1993; FRISK et al., 1999; MOSS et al., 2002; KERDILES et al., 2006; BEINEKE et

al., 2009a). Durch ein Persistieren der Staupevirusinfektion werden vornehmlich Th2-Zellfunktionen gestört, so dass die humorale Immunantwort durch ein class- switching von IgM zu IgG unterbleibt (WINTERS et al., 1993). Durch die Verminderung der IL-12-Produktion bei infizierten Monozyten und Makrophagen induzieren Morbilliviren eine herabgesetzte Zell-vermittelte Immunität. Bei der Masernvirusinfektion wird die reduzierte IL-12-Produktion durch eine direkte Bindung des Masernvirus an die CD46-Antigene verursacht (KARP, 1999).

Ein weiterer Erklärungsansatz ist der direkte Einfluss des Staupevirus auf T-Zellen.

Es wird davon ausgegangen, dass eine Zerstörung der T-Zellen für die Staupevirus- induzierte Immunsuppression verantwortlich ist, wobei vermutlich eine unterschiedliche Staupevirusempfänglichkeit in verschiedenen Lymphozyten- Subpopulationen besteht (MANGI et al., 1976; CERRUTI-SOLA et al., 1983; APPEL, 2003).

Ist ein Virus ständig in einer Population anwesend, wird eine Basisimmunität aufrechterhalten. Allerdings scheiden nur die akut erkrankten Individuen Morbilliviren aus. Für Masernviren ist eine Population von 300 000 Individuen notwendig, um eine Zirkulation des Virus aufrecht zu halten (FIELDS, 2007). Generell infiziert jedes Morbillivirus nur eine Spezies, in der es schwere Symptome auslöst. So führen Masernviren beispielsweise nur zu Erkrankungen bei Primaten. Affen sind hochgradig empfänglich für Masern, da ihre Populationsgrößen aber zu klein sind, kommt es zu keiner Zirkulation des Virus und eine Infektion entsteht in erster Linie nach Kontakt mit infizierten Menschen (BARRET, 1999). CDV kann viele verschiedene Carnivora infizieren und auf diese Weise auch bei kleinen Einzelpopulationen zirkulieren (YOSHIKAWA et al., 1989; VISSER et al., 1993a;

VISSER et al., 1993b; APPEL, 2003; BEINEKE et al., 2009a; BEINEKE et al., 2009b). Da überstandene akute Morbillivirusinfektionen zur Bildung von Antikörpern mit langanhaltender Immunität führen, ist das Virus für sein Überleben auf immer neue empfängliche Wirte angewiesen. Während der Mensch nach einer zweifachen Impfung mit einem attenuierten Lebendimpfstoff lebenslänglich gegen eine Masernvirusinfektion immun ist (FIELDS, 2007), lässt sich beim Seehund mit der Zeit ein deutlicher Abfall der Antikörpertiter beobachten. Seit der letzten Epidemie 2002

traten in der Nordsee keine akuten Erkrankungsfälle bei Seehunden mehr auf und im Monitoring zeigte sich bereits drei Jahre danach ein Rückgang der CDV-spezifischen Antikörpertiter (SIEBERT, 2003; MÜLLER et al., 2004). Eine erneute Infektion der immunnaiven Population mit dem Virus würde, bei gegebenem Kontakt der Tiere untereinander, auf ein Neues einen Seuchenzug möglich machen (SIEBERT, 2003;

HÄRKÖNEN et al., 2006).

Begünstigend wirken anthropogene Faktoren, die das Immunsystem schwächen.

Durch Schadstoffexposition wird vor allem die zelluläre Immunantwort negativ beeinflusst, was eine erhöhte Krankheitsanfälligkeit zur Folge haben kann.

Verschiedene Untersuchungen haben ergeben, dass Organochloride die Funktionen des Immunsystems beeinträchtigen (HALL et al., 1992a; HALL et al., 1992b; DE SWART et al., 1993; ROSS et al., 1996a; ROSS et al., 1996b; BEINEKE et al., 2001;

REIJNDERS und AGUILAR, 2002; BERGHALL et al., 2004). Möglicherweise hat eine verstärkte Belastung von Seehunden im Wattenmeer durch erhöhte Mengen an organischen Chlorverbindungen, insbesondere Polychlorierte Biphenyle (PCB) und Diphenyldiethylether (DDE) zu der Epidemie von 1988 beigetragen (REIJNDERS und AGUILAR, 2002). 15 Jahre später zeigen Fettprobenanalysen auf PCBs und DDEs von Robben aus einem stark kontaminierten Teil im Westen des niederländischen Wattenmeers, dass die Akkumulation in den Tieren im Vergleich zu 1988 von 65 % nur auf 50 % gesunken ist (REIJNDERS und AGUILAR, 2002;

REIJNDERS und SIMMONDS, 2003). Auch aktuell sind die gemessenen Schadstoffkonzentration noch immer so hoch, dass immunsuppressive Effekte nicht ausgeschlossen werden können (WEIJS et al., 2009). Schon geringe Schwermetallkonzentrationen bleiben nicht ohne Effekt und führen zu Hypersensibilisierungsreaktionen (KAKUSCHKE et al., 2005). Zinnorganische Verbindungen und bromierte Verbrennungsrückstände (wie Polybromdiphenylether, PBDEs) werden ebenfalls als Einflussfaktor auf das Immunsystem diskutiert und können aktuell im Blutserum von Seehunden nachgewiesen werden (BOON et al., 2002; LAW et al., 2003; HALL et al., 2003; WEIJS et al., 2009).

2.4.4 Lymphozytenstimulationstest

Der Lymphozytenstimulationstest ermöglicht die qualitative und quantitative Erfassung der zellulären Immunantwort nach unspezifischer oder Antigen- spezifischer Zellaktivierung (KRISTENSEN et al., 1982). Durch sogenannte Mitogene, in der Regel Pflanzenlektine oder Bakterienprodukte, werden die Lymphozyten zur Teilung angeregt. Die Mitogene binden sich an Glykoproteine auf der Oberfläche der Lymphozyten und regen die Ribonukleinsäure- und Proteinbiosynthese der Zellen an. Es kommt zur Mitose der Lymphozyten (MURPHY et al., 2008). Bei den Phytomitogenen stimuliert Concanavalin A (Con A), ein Lektin aus der Schwertbohne (Concanavalia ensiformis), selektiv T-Lymphozyten, während das pokeweed-Mitogen (PWM) aus der Kermesbeere (Phytolacca americana) in Abwesenheit von T-Lymphozyten zusätzlich B-Zellen aktiviert. Phytohämagglutinin (PHA) wird aus der roten Gartenbohne (Phaseolus vulgaris) gewonnen und stimuliert in erster Linie die Teilung von T-Zellen und in geringerem Maße die Teilung von B-Lymphozyten (MURPHY et al., 2008).

Beim Seehund stellt Con A, gefolgt von PWM, das stärkste Mitogen dar. Con A regt phocine T-Zellen und PWM phocine T- und B-Zellen zur Proliferation an (DE SWART et al., 1993; NIELSEN, 1995). Auch die Dosis-Wirkungsbeziehung und die Kinetik stimulierter Blutlymphozyten des Seehundes wurden bereits untersucht. Mittels eines ELISA-Testsystems wurde die Antikörperproduktion in vitro gemessen und die Bindung von B-Zellen an Protein A (spot-ELISA) untersucht. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass PWM beim Seehund sowohl T- als auch B-Zellen stimuliert, während Lipopolysaccharide (Bakterienzellwandbestandteile) ein reines B-Zellmitogen für den Seehund darstellen. Die Zellreaktion scheint altersabhängig zu sein, denn Con A zeigt gerade bei jungen (0,75 bis 1,5 Jahre alten) Seehunden eine gute Stimulationsfähigkeit. Die Zellreaktion ist hier sehr viel deutlicher ausgeprägt als nach einer Stimulation mit PWM (DE SWART et al., 1993; NIELSEN, 1995).

Zur Quantifizierung der Proliferationsintensität wird der kolorimetrische 5-Brom-2´-desoxy-Uridin (BrdU) Test angewandt. Das Testprinzip beruht auf dem Einbau des Pyrimidinanalogs BrdU an die Stelle des Thymidins in die DNA proliferierender Zellen während der S-Phase. Nach dem Binden eines