Die Bedeutung des Typ I Interferon Signalwegs im Hund unter besonderer Berücksichtigung der kaninen Staupevirusinfektion

Die Bedeutung des Typ I Interferon Signalwegs im Hund unter besonderer Berücksichtigung

der kaninen Staupevirusinfektion

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von

Daniela Klotz

Hannover

Hannover 2019

Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie;

detaillierte bibliografische Daten sind im Internet abrufbar über http://dnb.ddb.de

© 2019 by Verlag:

Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen Printed in Germany

ISBN 978-3-86345-506-4 1. Auflage 2019

Verlag:

DVG Service GmbH Friedrichstraße 17 35392 Gießen Tel.: 0641/24466 info@dvg.de www.dvg.de

Die Bedeutung des Typ I Interferon Signalwegs im Hund unter besonderer Berücksichtigung

der kaninen Staupevirusinfektion

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae-

(Dr. med. vet.)

vorgelegt von Daniela Klotz

Hannover

Hannover 2019

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D.

1.Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D.

2.Gutachter: Prof. Dr. Andrea Tipold

Tag der mündlichen Prüfung: 16.10.2019

Für die Menschen, die an mich geglaubt haben

Teile der vorgelegten Doktorarbeit wurden in internationalen Fachzeitschriften veröffentlicht:

1. Daniela Klotz, Wolfgang Baumgärtner, Ingo Gerhauser; Type I interferons in the pathogenesis and treatment of canine diseases; Veterinary Immunology and Immunopathology (2017), Volume 191:80-93.

2. Daniela Klotz, Ingo Gerhauser; Interferon stimulated genes - mediators of the innate immune response during canine distemper virus infection; International Journal of Molecular Science (2019), Volume 20(7):1620.

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ... 1

2 Literaturübersicht ... 3

2.1 Das Staupevirus ... 3

2.2 Die Staupevirus-Erkrankung des Hundes ... 4

2.3 Interferone ... 6

2.3.1 IFN-I Signalkaskade ... 7

2.4 Interferon induzierte Signalwege ... 10

2.4.1 Interferon regulierende Faktoren (IRF3/IRF7) ... 10

2.4.2 „Signal transducer and activator of transcription” (STAT1/STAT2) ... 12

2.4.3 Interferon stimuliertes Gen 15 (ISG15) ... 15

2.4.4 Proteinkinase R (PKR) ... 19

2.4.5 2`5`-Oligoadenylatsynthetase (OAS) ... 20

2.4.6 „Myxovirus resistance protein“ (MX) ... 22

2.5 Interferon beim Hund ... 23

3 PUBLIKATION 1: Type I interferons in the pathogenesis and treatment of canine diseases ... 25

4 PUBLIKATION 2: Interferon stimulated genes - mediators of the innate immune response during canine distemper virus infection ... 27

5 Diskussion ... 29

5.1 Übersicht über das IFN-System des Hundes ... 29

5.2 IFN-I als (potentielles) Therapeutikum im Hund... 29

5.3 IFN-I und ISGs im Verlauf der Staupevirusinfektion ... 31

5.3.1 IRF3 und IRF7 im Verlauf der Staupevirusinfektion ... 32

5.3.2 STAT1 und STAT2 im Verlauf der Staupevirusinfektion ... 33

5.3.3 ISG15 im Verlauf der Staupevirusinfektion ... 34

5.3.4 PKR im Verlauf der Staupevirusinfektion ... 35

5.3.5 OAS im Verlauf der Staupevirusinfektion... 36

5.3.6 MX im Verlauf der Staupevirusinfektion ... 36

5.4 Warum CDV-Antigen vor allem in Astrozyten und kaum in Oligodendrozyten zu finden ist und andere Diskussion zum Zusammenhang zwischen den untersuchten ISGs und der Demyelinisierung... 37

5.5 Auf der Suche nach dem Unbekannten: Wie spezifisch sind die etablierten ISG-Marker für die Detektion einer viralen Infektion? ... 39

6 Zusammenfassung ... 43

7 Summary ... 47

8 Literaturverzeichnis ... 51

9 Anhang ... 71

9.1 Übersicht über die für die Untersuchung verwendeten Hunde ... 71

9.2 Übersicht über die lichtmikroskopische Einteilung der Staupeläsionen ... 72

10 Danksagung ... 73

1 Einleitung

Die demyelinisierende Staupeenzephalitis wird durch eine Infektion mit dem kaninen Staupevirus verursacht (BEINEKE et al. 2009). Bei der Demyelinisierung handelt es sich um einen biphasischen Prozess, wobei die erste Phase primär durch die Virusinfektion ausgelöst wird und die zweite Phase einen immunpathologisch- dominierten Prozess darstellt (SUMMERS u. APPEL 1994). Die demyelinisierende Staupeenzephalitis stellt aufgrund der auftretenden, neuropathologischen Veränderungen ein anerkanntes Modell für die Multiple Sklerose (MS) dar. Ein Bestandteil der Standardtherapie der MS besteht in der Verabreichung von Typ I Interferonen (IFN-I). IFN-I kann zu einer Verzögerung des progressiven Verlaufs von MS führen, indem es den immunpathologischen Prozess moduliert, aber die Gabe von IFN-I führt nicht zur Heilung der MS. In der Tiermedizin wird IFN-I aufgrund der hohen Kosten und da der therapeutische Erfolg derzeit nicht im Rahmen größerer Studien untersucht bzw. nachgewiesen wurde nur selten eingesetzt (KLOTZ et al. 2017). Das einzige IFN-I Präparat, das in der Tiermedizin in Europa derzeit zugelassen ist, ist das feline IFN-ω mit dem Arzneimittelnamen Virbagen® Omega. Dieses Präparat ist auch für die Therapie einer Parvovirusinfektion beim Hund zugelassen und mildert, bei frühzeitiger Applikation, die klinische Symptomatik und senkt die Mortalität. Weitere wissenschaftlich belegte Erfolge einer IFN-I-Therapie sind derzeit bei Hunden nicht beschrieben.Der erste Teil dieser Arbeit gibt eine Übersicht über die Bedeutung von IFN-I beim Hund mit Augenmerk auf die Pathogenese und Behandlungsmöglichkeiten von viralen, autoimmunen und idiopathischen Erkrankungen.

IFN besitzt wichtige Funktionen in der angeborenen und erworbenen Immunantwort und kann in verschiedene Signalkaskaden eingreifen. Die erste Abwehr gegen virale Infektionen stellt die Aktivierung des Januskinase – „Signal transducer and activator of transcription“ (JAK-STAT) - Signalwegs durch IFN-I dar, was zur Regulation von mehreren Hundert verschiedenen Interferon–stimulierten-Genen (ISG) führt. Einige ISGs besitzen vielfältige Funktionen, während anderen vor allem eine Bedeutung bei der Virusabwehr zu kommt.

Ziel des zweiten Teils der Arbeit war es die Expression von ausgewählten ISGs im Verlauf der kaninen Staupeenzephalitis zu charakterisieren und dadurch einen Beitrag zum Verständnis der Rolle der angeborenen Immunantwort im Verlauf einer

demyelinisierenden und viralen Erkrankung zu erhalten. Dazu wurden verschiedene Interferon abhängige Gene wie die Interferon regulierenden Faktoren (IRF) 3 und 7, STAT1 und STAT2, die Proteinkinase R (PKR), das „Myxovirus resistance protein“

(MX), ISG15 und die 2`5`-Oligoadenylatsynthetase (OAS) in unterschiedlichen Stufen der Interferon-Signalkaskade in Paraffin eingebettetem Kleinhirngewebe immunhistologisch untersucht. Die zelluläre Proteinexpression von STAT1, STAT2, PKR und MX im Kleinhirn wurde mittels Doppelmarkierung in der Immunfluoreszenz dargestellt. Auch wurden bereits vorhandene Microarray-Daten zur Genexpression verschiedener Schlüsselproteine des IFN-I Signalweges ausgewertet. Die Ergebnisse der an Staupe erkrankten Hunde wurden mit Kontrollwerten verglichen.

2 Literaturübersicht

2.1 Das Staupevirus

Das kanine Staupevirus (CDV) ist ein behülltes, einzelsträngiges, nicht segmentiertes, negativ-orientiertes RNS-Virus (LAMB u. KOLAKOFSKY 2001). Es gehört, wie auch das Masernvirus des Menschen, das Staupevirus der Seehunde, das „Peste-des-petits-ruminants virus“ der kleinen Wiederkäuer, das Rinderpest Virus und die Morbilliviren der Wale und Delphine zum Genus Morbillivirus aus der Familie der Paramyxoviridae (LAMB u. KOLAKOFSKY 2001; BEINEKE et al. 2009).

Das natürliche Wirtsspektrum von CDV umfasst hauptsächlich Familien der Ordnung Carnivora (DEEM et al. 2000; BEINEKE et al. 2009; LEMPP et al. 2014).

CDV ist aus sechs Strukturproteinen aufgebaut: dem Nukleokapsidprotein (N), dem Phosphoprotein (P), dem L-Protein, dem Matrixprotein (M), dem Hämagglutinin- Protein (H) und dem Fusionsprotein (F) (HALL et al. 1980; ÖRVELL 1980; DIALLO 1990; LAMB u. KOLAKOFSKY 2001; BEINEKE et al. 2009; MAIER u. LIEBERT 2009; KUMAR et al. 2016). Eine schematische Darstellung des Staupevirus findet sich in Abbildung 1. Die das Virus umgebende Lipidhülle enthält die beiden Oberflächenglykoproteine F und H, die den Eintritt und Austritt von Viren aus der Wirtszelle vermitteln, indem das H-Protein an einen Rezeptor bindet, während das F-Protein die Verschmelzung von Virushülle und Wirtsmembran vermittelt (BEINEKE et al. 2009; MAIER u. LIEBERT 2009). Das virale M-Protein verbindet die Oberflächenglykoproteine (F- und H-Protein) und das Nukleokapsidprotein (N) während der viralen Reifung (BEINEKE et al. 2009). Die N-, P- und L-Proteine befinden sich innerhalb der Virushülle im Zentrum und initiieren die Virusreplikation in der Wirtszelle (LAMB u. KOLAKOFSKY 2001; BEINEKE et al. 2009). Das virale L-Protein nimmt hierfür die Funktion einer RNS-abhängigen Polymerase ein (MAIER u. LIEBERT 2009). Im Leseraster des P-Proteins sind darüber hinaus zwei nicht-strukturelle Proteine (V- und C-Protein) kodiert (LAMB u. KOLAKOFSKY 2001; MAIER u. LIEBERT 2009). Insbesondere dem V-Protein der Staupeviren kommt als IFN-Antagonist eine große Bedeutung bei der Umgehung der Abwehrreaktion des Wirts durch eine herunterregulierte IFN Antwort zu (ANDREJEVA et al. 2004; VON MESSLING et al. 2006; BEINEKE et al. 2009;

CHILDS et al. 2009; SVITEK et al. 2014).

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Staupevirus (CDV): CDV ist aus sechs Strukturproteinen aufgebaut: dem Nukleokapsidprotein (N), dem Phosphoprotein (P), dem L-Protein, dem Matrixprotein (M), dem Hämagglutinin- Protein (H) und dem Fusionsprotein (F). Modifiziert nach KUMAR et al. (2016).

2.2 Die Staupevirus-Erkrankung des Hundes

Das kanine Staupevirus kann terrestrische und aquatische Karnivoren oropharyngeal infizieren (BEINEKE et al. 2009). Die Inkubationszeit variiert zwischen 1 und 4 Wochen. Die Manifestation der Staupe reicht von praktisch keinen klinischen Anzeichen bis zu einer schweren Krankheit mit einer Mortalität von ungefähr 50% (APPEL 1970; KRAKOWKA et al. 1980; SCHWAB et al. 2007;

BEINEKE et al. 2009). Zwischen dem 7. und 14. Tag nach der Infektion kann eine starke humorale und zelluläre Immunantwort ausgelöst werden und die Tiere genesen, indem sie das Virus eliminieren; ein hoher Antikörpertiter zu diesem Zeitpunkt fördert die Ausscheidung und die Persistenz des Virus (BEINEKE et al.

2009). Das Fehlen einer wirksamen humoralen Immunantwort hingegen führt zu einem akuten, oft tödlichen klinischen Verlauf (BEINEKE et al. 2009). Die Verlaufsform ist abhängig von der Immunitätslage des infizierten Wirtes, vom Staupevirusstamm und dem Alter des Tieres (CAMPBELL 1957; KRAKOWKA u.

KOESTNER 1976; SUMMERS et al. 1984; PEARCE-KELLING et al. 1990; RAW et al. 1992; BEINEKE et al. 2009; LEMPP et al. 2014). Klinisch kann sich die kanine Staupe als katarrhalische Form, die den Respirationstrakt und/oder den Gastrointestinaltrakt betrifft, als akute systemische Form oder als nervöse Form manifestieren. Des Weiteren kann es zu ungewöhnlichen Manifestationen kommen, die als sogenannte „Hard Pad Disease“ Erkrankung der Ballen und des Nasenspiegels, als Staupeexanthem oder als Staupegebiss auftreten können (BAUMGÄRTNER 1993; MORITZ et al. 2003; BEINEKE et al. 2009; LEMPP et al.

2014). Infolge der Immunsuppression kommt es häufig zu sekundären, bakteriellen Infektionen, die den klinischen Verlauf erschweren können (BEINEKE et al. 2009;

LEMPP et al. 2014).

Die nervöse Form der Staupe kann sowohl die graue als auch die weiße Substanz betreffen (BEINEKE et al. 2009; LEMPP et al. 2014). Die selteneren Polioenzephalitiden werden in „old dog encephalitis“, postvakzinale Staupeenzephalitis und Einschlusskörperchen-Polioenzephalitis eingeteilt (NESSELER et al. 1997). Die nervöse Form manifestiert sich beim Hund in der Regel als Leukoenzephalitis mit vorwiegender Beteiligung des Kleinhirns (BAUMGÄRTNER 1993). Die klinische, zentralnervöse Symptomatik ist vielfältig und progressiv (BEINEKE et al. 2009; GREENE 2011). Hunde mit einer zentralnervösen Symptomatik sterben normalerweise (BEINEKE et al. 2009). Die Läsionen der Staupeenzephalitis lassen sich histologisch in akute (Vakuolisierung der weißen Substanz; geringgradige Astrogliose und Gemistozytose), subakute (Vakuolisierung und Demyelinisierung; ohne Entzündung oder mit geringgradigen, perivaskulären, lymphohistiozytären Infiltraten) und chronische (Demyelinisierung;

mittel- bis hochgradige perivaskuläre oder diffuse, lymphohistiozytäre Entzündungszellinfiltrationen) Herdveränderungen einteilen (MCCULLOUGH et al.

1974a; MCCULLOUGH et al. 1974b; RAINE 1976; SUMMERS et al. 1979;

HIGGINS et al. 1982; VANDEVELDE et al. 1982; SUMMERS u. APPEL 1987). Im Gehirn betroffener Hunde ist das gleichzeitige Auftreten von Herden in unterschiedlichen Stadien bei einem Individuum ein häufiger Befund (BAUMGÄRTNER et al. 1989; ALLDINGER et al. 1993a; ALLDINGER et al. 1993b;

WÜNSCHMANN et al. 1999). Die demyelinisierende Staupeenzephalitis stellt einen biphasischen Prozess dar. Die erste Phase ist auf eine direkte, virusvermittelte Wirkung zurückzuführen, während die zweite Phase einen immunpathologischen

Prozess darstellt, der zur progressiven Entmarkung führt (BAUMGÄRTNER et al.

1989; SUMMERS u. APPEL 1994; ALLDINGER et al. 1996; BAUMGÄRTNER u.

ALLDINGER 2005).

Aufgrund der Ähnlichkeiten der histopathologischen Befunde bei der demyelinisierenden Staupeenzephalitis mit denen bei der Multiplen Sklerose (MS) gilt die Staupe als eines der wenigen, spontan auftretenden Tiermodelle zur Untersuchung der Demyelinisierung (SUMMERS u. APPEL 1994; BAUMGÄRTNER u. ALLDINGER 2005; VANDEVELDE u. ZURBRIGGEN 2005).

2.3 Interferone

Zytokine sind Botenstoffe und werden anhand ihrer spezifischen Rezeptoren in verschiedene Gruppen eingeteilt (PARKIN u. COHEN 2001). In die Gruppe der Klasse I Zytokine gehören vor allem Wachstumsfaktoren die an die Hämatopoetin- Rezeptorfamilie binden können (MIYAJIMA et al. 1992). Interferone hingegen gehören durch ihre spezifische Bindung an Interferonrezeptoren in die Gruppe der Klasse II Zytokine und stellen einen wesentlichen Teil der angeborenen Immunantwort dar (KRAUSE u. PESTKA 2005; STETSON u. MEDZHITOV 2006).

Unterteilt werden Interferone, anhand ihrer spezifischen Rezeptorbindung, in drei Klassen: IFN-I, IFN-II und IFN-III (KRAUSE u. PESTKA 2005). Zu den IFN-I zählen IFN α, IFN β, IFN , IFN , IFN , sowie das bisher nur bei Nagetieren beschriebene IFN , das nur bei Katzen beschriebene IFN  (KONTSEK et al. 2003; KRAUSE u.

PESTKA 2005) und IFN  und IFN , die bei Schweinen und Wiederkäuern in der frühen Trächtigkeit von Trophoblasten gebildet werden (ROBERTS et al. 1992;

LEFEVRE u. BOULAY 1993; ROBERTS 1993). Den verschiedenen IFN-I ist gemeinsam, dass sie eine wichtige Rolle in der frühen Phase der Immunreaktion spielen (MALMGAARD 2004). Demgegenüber wird IFN-II, zu dem nur das IFN  zählt, vor allem in der späteren Phase der Immunreaktion von B-Zellen, zytotoxischen T-Zellen und T-Helferzellen produziert; IFN  ist nicht nur an der viralen Abwehr beteiligt, sondern stellt auch einen wichtigsten Botenstoff zur Aktivierung von Makrophagen dar (BOEHM et al. 1997).

IFN-III, zu denen mehrere Typen des IFN-λ zählen, wurden erst 2003 den Interferonen zugeordnet und seitdem in diversen Spezies beschrieben (KOTENKO et al. 2003; SHEPPARD et al. 2003; DIAZ-SAN SEGUNDO et al. 2011; FAN et al.

2014). Die Signalkaskade von IFN-III ist der von IFN-I sehr ähnlich – mit einer Aktivierung durch IRF3 und IRF7, sowie anschließender ISG Transkription über STAT-Proteine – sodass IFN-III ebenfalls an der antiviralen Immunantwort beteiligt ist (DONNELLY u. KOTENKO 2010; YANG et al. 2010). Unterscheiden tun sie sich von IFN-I durch ihre spezifische Bindung an einen anderen Rezeptor – ein Dimer aus IFN-λR1 und IL-10R2 Proteinen – und durch ihre relativ lokal begrenzte Produktion in Epithelzellen von Lunge, Darm und Nieren (DONNELLY u. KOTENKO 2010).

Die Schlüsselrolle von Interferonen bei der Abwehr von Infektionen ist seit langem bekannt; ihre antivirale Wirkung gegen Vaccinia- und Influenzaviren wurde bereits in den 1950er Jahren beschrieben (NAGANO u. KOJIMA 1954; ISAACS u.

LINDENMANN 1957). Wie wichtig eine funktionierende Interferon-Signalkaskade für einen Organismus ist, zeigt sich bei Menschen mit angeborenen Defekten im Interferon-Signaltransduktionsweg, dabei sterben häufig Kinder aufgrund einer mangelnden Abwehr bereits in Folge von geringgradigen Infektionen (DUPUIS et al. 2003; LIU et al. 2011; BOISSON-DUPUIS et al. 2012; CASANOVA et al. 2012;

BOISSON et al. 2015; TOUBIANA et al. 2016; MOGENSEN 2018).

2.3.1 IFN-I Signalkaskade

Die Liste der neu identifizierten IFN-I-Induktionswege wächst schnell und wird weiterwachsen (HONDA et al. 2006), weshalb in dieser Arbeit hauptsächlich der klassische IFN-I-Induktionsweg beschrieben wird: Die Infektion einer Zelle wird mittels spezifischer Rezeptoren („Pattern recognition receptors“, PRRs) erkannt (MEDZHITOV u. JANEWAY 1997). Das infektionserregertypische Strukturelement („Pathogen associated molecular pattern“, PAMP) ist bei Viren häufig die doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNS), die innerhalb des viralen Vermehrungszyklus exprimiert wird und von den PRRs als „fremd“ erkannt wird (MEDZHITOV u. JANEWAY 2000). Zu den PRRs zählen unter anderem die endosomal lokalisierten „Toll-like“ Rezeptoren (TLR), die zur Familie der „Retinoic acid-inducible gene I-like“ Rezeptoren (RLR) gehörenden RIG-1 („Retinoic acid- inducible gene“) und MDA-5 („Melanoma differentiation-associated gene 5“), sowie die Proteinkinase R (PKR) (THOMPSON u. LOCARNINI 2007; MUNIR u. BERG 2013). PRRs für die Erkennung von viralen Pathogenen sind in der Regel

intrazellulär lokalisiert (THOMPSON u. LOCARNINI 2007). Erkennt ein PRR in die Zelle eingedrungene Pathogene werden verschiedene Signalkaskaden in Gang gesetzt. Die Rezeptoren dimerisieren und rekrutieren verschiedene Adapterproteine wie TRIF („Toll/interleukin-1 receptor-domain-containing adapter inducing IFN-β“) und TRAF 3 („TNF α receptor associated factor-3“) (AKIRA u. TAKEDA 2004).

Diese Adapterproteine aktivieren über verschiedene „Signal Transducer“ - unter anderem „IκB kinase“ (IKK) und „TANK-binding kinase“ (TBK) - Transkriptionsfaktoren wie NFB („Nuclear Factor `kappa-light-chain-enhancer` of activated B-cells“) und IRF (Interferon regulierender Faktor) 3 und IRF7 (CARTY et al. 2014). Diese Transkriptionsfaktoren regulieren die Expression von IFN, anderen Zytokinen und Chemokinen, beeinflussen die Zellreifung und das Überleben von Zellen (AKIRA u. TAKEDA 2004; RÖLL 2013), in dem sie im Zellkern an Promotoren binden, was zur Synthese von IFN-I führt (CARTY et al. 2014).

IFN-I kann autokrin oder parakrin nach Bindung an den IFN-I-Rezeptor, der aus den Untereinheiten IFNAR1 und IFNAR2 besteht, verschiedene Signalwege aktivieren, die die Virusreplikation an unterschiedlichen Stellen hemmen (UZE et al. 2007; BOO u. YANG 2010). Durch diese Bindung werden die Rezeptor-assoziierten Janus- (JAK) 1 und Tyrosinkinasen (TYK) 2 aktiviert (PESTKA 1997; STARK u. DARNELL 2012). TYK2 bewirkt die Bindung und Aktivierung von STAT (“Signal transducer and activator of transcription”) 2, das wiederum STAT1 bindet und damit ein Heterodimer bildet (PESTKA 1997). Dieser Komplex transloziert zusammen mit IRF9 in den Zellkern und bildet den „Interferon-stimulated gene factor 3“ (ISGF 3) (STARK u.

DARNELL 2012; NAN et al. 2017). Im Zellkern schaltet ISGF 3 die Expression von Genen an, die ein „Interferon stimulated response element“ (ISRE) in ihrem Promoter haben (NAN et al. 2017). Dies führt zur Transkription von IFN stimulierten Genen (ISG) wie zum Beispiel dem „Myxovirus resistance protein“ (MX), 2`5`- Oligoadenylatsynthetase (OAS), Proteinkinase R (PKR) und ISG15 (BOO u. YANG 2010; NAN et al. 2017).

Abbildung 2: IFN-I Signalweg: Links: Die Infektion von Zellen durch Viren wird von spezifischen Rezeptoren erkannt, die sich im Zytoplasma oder an der Endosomenmembran befinden. Diese Rezeptoren, einschließlich TLR3, TLR7, MDA5 und PKR erkennen virusspezifisch ssRNS oder dsRNS und aktivieren über verschiedene Signalwege die Transkriptionsfaktoren IRF1, IRF3, IRF5, IRF7 und NFκB. Die Transkriptionsfaktoren translozieren in den Zellkern und induzieren die Transkription von IFN-I. Rechts: IFN-I bindet autokrin oder parakrin an den membranständigen IFN-I-Rezeptor und aktiviert den JAK- STAT-Signalweg, was zur Bildung von STAT1 / STAT2-Heterodimeren im Zytoplasma führt. Diese Heterodimere bilden mit IRF9 den ISGF3-Komplex. Im Zellkern induziert ISGF3 die Transkription von Interferon-stimulierten Genen (ISGs) einschließlich ISG15, PKR, OAS und MX.

IRF = Interferon regulierender Faktor; IFN-I = Typ I Interferon; IFNAR = Typ I- Interferon Rezeptor; ISG15 = Interferon stimuliertes Gen 15; ISGF = „Interferon stimulated gene factor”; JAK1 = Januskinase 1; MDA5 = „Melanoma differentiation-associated gene” 5; NFB = „Nuclear Factor ´kappa-light-chain- enhancer`of activated B-cells”; TLR = „Toll-like” Rezeptor; MX = „Myxovirus resistance protein”; OAS = 2`5`-Oligoadenylatsynthetase; PKR = Proteinkinase R; STAT = „Signal transducer and activator of transcription”;

TYK2 = Tyrosinkinase 2.

2.4 Interferon induzierte Signalwege

IFN-I aktiviert in virusinfizierten und umliegenden, nichtinfizierten Zellen die JAK- STAT- Signalkaskade, was eine Bildung von ISGs zur Folge hat (UZE et al. 2007;

BOO u. YANG 2010). ISGs kodieren zahlreiche antivirale Proteine, die durch eine Blockierung der Translation und Transkription von Viren, eine Inhibition der Virusfreisetzung, eine Induktion von Apoptose oder eine Modifikation von Virusproteinen agieren (SADLER u. WILLIAMS 2008). Bis heute wurden über 500 Interferon stimulierte Gene (ISGs) mit unterschiedlicher Expression als Reaktion auf IFN identifiziert und diese Zahl wächst durch die Verwendung moderner, molekularer Methoden wie Mikroarrays, RNS-Sequenzierungen und die Möglichkeit zur schnellen Datengenerierung und -auswertung stetig, wohingegen für die Mehrzahl der identifizierten ISGs bisher kaum detailliertes Wissen über ihre Bedeutung und Funktion bekannt ist (DE VEER et al. 2001; GREEN et al. 2018).

Für die Resistenz gegenüber viralen Infektionen sind der MX-GTPase, der OAS- vermittelte Ribonuklease (RNase) L, der PKR und der ISG15 Ubiquitin-ähnliche Signalweg am besten untersucht: diese Signalwege können die virale Transkription, Translation und Freisetzung blockieren, sowie virale RNS und Nukleokapside binden und abbauen (SADLER u. WILLIAMS 2008). Zu den in dieser Arbeit untersuchten ISGs (PKR, ISG15, MX, OAS) und den Transkriptionsfaktoren (IRF3/IRF7, STAT1/STAT2) finden sich folgend einzelne Abschnitte.

2.4.1 Interferon regulierende Faktoren (IRF3/IRF7)

IRF3 und IRF7 haben wichtige Funktionen bei der IFN-I Produktion und damit bei der Bekämpfung von Virusinfektionen (HONDA et al. 2006; HALLER et al. 2007).

Die Aktivierung von IRF3 und IRF7 führt zur Induktion von IFN-I-Genen und proinflammatorischen Zytokinen (HONDA et al. 2006). IRF3 und IRF7 sind strukturell eng verwandt, sodass sie evolutionär wahrscheinlich von einem gemeinsamen Vorfahren abstammen (IKUSHIMA et al. 2013). In Säugetieren gibt es 9 funktionell aktive IRFs, wobei IRF3 und IRF7 soweit bekannt, beide in allen Spezies eine IFN-I Antwort und damit eine Virusbekämpfung auslösen, während anderen IRFs, wie IRF1, IRF5 oder IRF8 bei der Induktion der IFN-I Gentranskription nur eine untergeordnete Bedeutung zukommt (MIYAMOTO et al.

1988; HONDA et al. 2006; LI et al. 2011; LAZEAR et al. 2013; BLASZCZYK et al.

2016). Die Erkennung von Pathogenen durch verschiedene PRRs führt zur Aktivierung von IRFs (HALLER et al. 2007; IKUSHIMA et al. 2013), wobei IRF3 und IRF7 die größte Rolle bei einer durch Viren verursachten IFN-I Expression zukommt (LIN et al. 1998; SATO et al. 1998b; YONEYAMA et al. 1998).

IRF3 wird in den meisten Geweben und Zelltypen konstitutiv exprimiert und befindet sich auch in nicht-infizierten Zellen in latenter Form im Zytosol (IKUSHIMA et al.

2013; YSEBRANT DE LENDONCK et al. 2014). Nach der Aktivierung kann IRF3 Homo- und Heterodimere bilden und in den Nukleus translokalisieren (IKUSHIMA et al. 2013). Die IRF3-Dimere interagieren mit anderen Transkriptionsfaktoren zur Transkriptionsaktivierung von IFN-I und anderen Zielgenen (YONEYAMA et al.

1998). IRF3 besitzt weitere Funktionen als die Induktion eines antiviralen Zustands (YSEBRANT DE LENDONCK et al. 2014). Weitere Funktionen von IRF3 sind zum Beispiel eine Aktivität bei Autoimmunerkrankungen oder Allergien (OGANESYAN et al. 2008; MARICHAL et al. 2010; YSEBRANT DE LENDONCK et al. 2014).

Darüber hinaus wird von IRF3 berichtet, dass es unabhängig von der Transkriptionsaktivität als Signalplattform fungieren kann (CHATTOPADHYAY et al.

2010; DI PAOLO et al. 2013; IKUSHIMA et al. 2013; YSEBRANT DE LENDONCK et al. 2013; YSEBRANT DE LENDONCK et al. 2014).

Im Gegensatz zu IRF3 wird IRF7 in den meisten ruhenden Zellen nur in geringen Mengen konstitutiv exprimiert (MARIE et al. 1998; SATO et al. 1998a; HONDA u.

TANIGUCHI 2006). Ähnlich wie IRF3 befindet sich auch IRF7 im Zytosol und wird bei einer Virusinfektion phosphoryliert und damit aktiviert (HONDA et al. 2006). IRF7 kann ein Homodimer bilden oder mit IRF3 ein Heterodimer (HONDA et al. 2006).

Jedes dieser verschiedenen Dimere bewirkt eine unterschiedliche Expression von IFN-I (HONDA et al. 2006). Während IRF3 vor allem eine Aktivierung des IFN-β- Gens bewirkt, kann IRF7 sowohl das IFN α- als auch das IFN β-Gen wirksam aktivieren (MARIE et al. 1998; SATO et al. 1998a).

Aufgrund eines Ubiquitin-abhängigen Abbaus von IRF7 im Zytosol von nicht- infizierten Zellen besitzt IRF7 eine kurze Halbwertzeit von nur 30 – 60 Minuten und muss kontinuierlich produziert werden (SATO et al. 2000; TANIGUCHI et al. 2001;

YU et al. 2005; IKUSHIMA et al. 2013). Dieser Mechanismus des kontinuierlichen Abbaus von IRF7 bewirkt, dass die IFN-I Geninduktion einen vorübergehenden Prozess darstellt, um eine potentiell schädliche Überexpression von IFN-I im Wirt zu verhindern (HONDA et al. 2006). Eine stärkere Aktivierung von IRF7 erfolgt über

die Bindung des Transkriptionsfaktors ISGF3, also im Anschluss an eine IFN-I Expression; dadurch wird eine positive Rückkopplungsregulation von IRF7 wirksam, um eine vollständige Immunantwort durch IFN-I in den späteren Phasen einer Abwehrreaktion zu erreichen (MARIE et al. 1998; SATO et al. 1998a; HONDA et al.

2006; HONDA u. TANIGUCHI 2006; HALLER et al. 2007; CHEN u. ROYER 2010;

IKUSHIMA et al. 2013; YSEBRANT DE LENDONCK et al. 2014).

Experimentelle Studien scheinen die Hypothese zu befürworten, dass IRF3 in erster Linie für die Einleitung der IFN β-Induktion verantwortlich ist, während IRF7, das durch IFN β induziert wird, in der späteren Phase für die IFN α-Induktion ins Spiel kommt („Zwei-Stufen-Modell“) (HONDA et al. 2006). IRF7 kommt sowohl in der frühen als auch späteren Phase der IFN-I-Geninduktion eine große Bedeutung in der viralen Abwehr zu, da der Beitrag von IRF3 in Abwesenheit von IRF7 nur gering ist; das heißt das Homodimer von IRF7 und Heterodimeren aus IRF3 und IRF7 kommt bei der Induktion von IFN-I zur Virusbekämpfung die größte Bedeutung zu, während das IRF3 Homodimer wahrscheinlich an der Induktion anderer Zytokine beteiligt ist (HONDA et al. 2005; HONDA et al. 2006). Zum Beispiel spielt IRF3 eine wesentliche Rolle bei der Abwehr gegen intrazelluläre Bakterien wie Listeria monocytogenes, da durch eine Akkumulation von dsDNS im Zytosol die IRF3- abhängige Typ I-IFN-Antwort aktiviert wird (HONDA et al. 2006; STETSON u.

MEDZHITOV 2006). Zellkulturen mit plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDCs) aus Milzgewebe, das von IRF7^-/- Mäusen stammt, weisen nach Infektion mit DNS- und RNS-Viren einen Defekt der IFN-I-Geninduktion auf, während die Induktion bei IRF3 ^-/- pDCs normal ist (HONDA et al. 2005; HONDA et al. 2006; IKUSHIMA et al.

2013).

2.4.2 „Signal transducer and activator of transcription”

(STAT1/STAT2)

Der JAK-STAT Signalweg wird nach der Bindung von IFN an IFN-Rezeptoren in Gang gesetzt und führt unter Beteiligung von STAT1 und/oder STAT2 zu einer Aktivierung von ISGs (PLATANIAS 2005; NAN et al. 2017; NAN et al. 2018). IFN γ kann über die an den IFN γ - Rezeptor gebundenen Tyrosinkinasen JAK1 und JAK2, STAT1 phosphorylieren, wodurch es zur STAT1-Homodimerbildung kommt (GONGORA u. MECHTI 1999; PLATANIAS 2005). STAT1-Homodimere induzieren

die Transkription von proinflammatorischen Zytokinen (O'SHEA et al. 2013; KANG et al. 2019).

IFN-I und IFN-III hingegen führen, vermittelt über die Tyrosinkinasen TYK2 und JAK1, zur Phosphorylierung von STAT1 und STAT2, wodurch es zur Bildung von STAT1/STAT2–Heterodimeren kommt (GONGORA u. MECHTI 1999; PLATANIAS 2005; BLASZCZYK et al. 2016). STAT1/STAT2–Heterodimere formen durch eine Bindung an IRF9 den ISGF3-Komplex (MAJOROS et al. 2017; MOGENSEN 2018).

Die Hauptfunktion von ISGF3 besteht in der Vermittlung einer schnellen und robusten IFN-I - Antwort durch Regulierung der Transkription antiviraler ISGs (HARADA et al. 1996; BLASZCZYK et al. 2016; WANG et al. 2017). Dies erfordert eine schnelle Bildung von ISGF3 aus den konstitutiv exprimierten Komponenten STAT1, STAT2 und IRF9, die alle auch in nicht-stimulierten Zellen in latenter / unphosphorylierter Form vorliegen (LEVY et al. 1989; BLASZCZYK et al. 2016).

Daher ist die Aktivierung von ISGF3 ein frühes Ereignis in der IFN-I-Signalkaskade, das bereits innerhalb von 2 Minuten nach der Exposition von Zellen mit IFNα nachweisbar war (LEVY et al. 1989; BLASZCZYK et al. 2016).

STAT1 knockout Mäuse, die experimentell mit verschiedenen Pathogenen infiziert wurden, zeigten eine hohe Anfälligkeit gegenüber den meisten Viren, mit Ausnahme des Dengue-Virus und des Masernvirus (BOISSON-DUPUIS et al. 2012;

MAJOROS et al. 2017). Diese Mäuse sind auch sehr anfällig für Infektionen mit intrazellulären Bakterien wie Listeria monocytogenes und Mycobacterium tuberculosis sowie Parasiten wie Toxoplasma gondii und Leishmania major (BOISSON-DUPUIS et al. 2012). Menschen die mit einem Defekt im STAT1-Gen geboren werden, zeigen eine Beeinträchtigung der IFN-Antwort, sind anfälliger für Autoimmunerkrankungen und mukokutane Candida-Infektionen; Infektionen mit Mykobakterien oder Viren verlaufen häufig letal in diesen Patienten (LIU et al. 2011;

BOISSON-DUPUIS et al. 2012; CASANOVA et al. 2012; BOISSON et al. 2015;

TOUBIANA et al. 2016; MOGENSEN 2018). Trotz der großen Bedeutung von STAT1 bei Mäusen und Menschen wurde in STAT1 knockout Mäusen eine STAT1 unabhängige IFN-Antwort gegen das Dengue-Virus und das Masernvirus nachgewiesen (GIL et al. 2001; SHRESTA et al. 2005; GEORGE et al. 2008;

MAJOROS et al. 2017). Auch andere Studien zeigten, dass STAT2 – auch unabhängig von STAT1 – für die IFN-I-induzierte Expression von zahlreichen ISGs erforderlich ist (HAHM et al. 2005; SARKIS et al. 2006; GEORGE et al. 2008; LOU

et al. 2009). Beim STAT1-unabhängigen IFN-I-Signalweg kann ein Komplex aus STAT2 und IRF9 die Rolle von ISGF3 potenziell ersetzen und bietet so eine

„Backup“-Funktion gegen virale Infektionen, welche jedoch verzögert einsetzt (ABDUL-SATER et al. 2015; BLASZCZYK et al. 2015; BLASZCZYK et al. 2016).

Die Aktivierung von STAT2 soll ausschließlich IFN-I und IFN-III induziert sein, weshalb STAT2 eine große Bedeutung bei der Reaktion auf Viren zukommt (PAULSON et al. 1999; BLASZCZYK et al. 2016). Außerdem konnte gezeigt werden, dass z.B. in einer humanen Fibroblastenzellkultur (2fTGH) STAT2 in Abwesenheit von STAT1 als Antwort auf IFN α phosphoryliert wird, während in Zellen, in denen STAT2 fehlt, keine Phosphorylierung von STAT1 festgestellt werden konnte. In diesen Zellen erfolgte jedoch wieder eine STAT1 Phosphorylierung, wenn den Zellen STAT2 zugeführt wurde (IMPROTA et al. 1994).

In humanen Leberzellen war die ISG Expression drastisch reduziert, wenn STAT2 oder IRF9 ausgeknockt wurden, während bei einem STAT1 Knockout keine veränderte Expression von ISGs festgestellt werden konnte (SARKIS et al. 2006).

Bereits 2005 zeigte sich auch in vivo in Mäusen eine Existenz und funktionelle Rolle des STAT2/IRF9-Komplexes - unabhängig von ISGF3, da Viren wie das Masernvirus und das lymphozytäre Choriomeningitisvirus dem Immunsystem durch einen STAT2-abhängigen, aber STAT1-unabhängigen Mechanismus ausweichen können (HAHM et al. 2005). Auch andere experimentelle Virusinfektionen in Mäusen deuten auf eine wichtige Rolle von STAT2 bei der viralen Abwehr hin, während die antivirale Funktion von STAT1 auch durch andere Mechanismen, wie z.B. eine IRF9/STAT2-Komplexbildung oder eine STAT1-unabhängige IRF7- Genexpression ersetzt werden kann (OUSMAN et al. 2005; ZIMMERER et al. 2007;

PERRY et al. 2011; BOWICK et al. 2012; ABDUL-SATER et al. 2015; BLASZCZYK et al. 2016). Der STAT2/IRF9 – Komplex weist jedoch eine geringe DNS- Bindungsaffinität auf, was die verzögerte Immunantwort im Vergleich zu einem funktionierenden ISGF3 erklärt (BLUYSSEN u. LEVY 1997). Für viele Viren stellt die Hemmung der STAT-vermittelten Signalkaskade einen wichtigen Mechanismus dar, um einer Immunantwort des Wirtes zu entkommen. Hierfür kann nicht nur die STAT-Phosphorylierung gehemmt werden, sondern auch die STAT-Dimerisierung gestört werden oder der Abbau von STAT-Proteinen durch das Virus zu einer fehlenden oder herabgesetzten Wirtsantwort führen (GARCIN et al. 2002;

YOKOSAWA et al. 2002; FENSTERL u. SEN 2009; XU et al. 2014; BLASZCZYK et

al. 2016). In einigen Studien zeigte sich, dass Viren häufig gezielt eine Hemmung der STAT1 Funktion bewirken, sodass der STAT1-unabhängige IFN-I Signalweg über STAT2 vermutlich einen „Backup“-Mechanismus darstellt, dessen Wirkung zwar langsamer und später in der Virusabwehr einsetzt, aber dennoch effektiv sein kann (ABDUL-SATER et al. 2015; BLASZCZYK et al. 2016).

Interessanterweise scheinen Menschen mit einem STAT2-Gendefekt häufig nicht klinisch auffällig zu werden, weder durch eine Infektion mit Mykobakterien noch durch virale Infektionen, obwohl sich in vitro eine defekte IFN-Antwort zeigt (HAMBLETON et al. 2013; MOENS et al. 2017; MOGENSEN 2018). Erst im Jahre 2013 wurde ein Fallbericht über ein 5-jähriges Mädchen veröffentlicht, das nach einer Mumps-Masern-Röteln-Impfung eine, durch einen Gendefekt im STAT2 Gen verursachte, systemische Maserninfektion zeigte. Der kleine Bruder des Mädchens starb an einer fieberhaften Erkrankung, vermutlich einer Virusinfektion unbekannter Ätiologie, wohingegen andere erwachsene Familienmitglieder mit demselben Gendefekt klinisch komplett gesund waren (HAMBLETON et al. 2013). Deshalb beschreibt MOGENSEN (2018) in einem kürzlich erschienenen Review, dass eine partielle Austauschbarkeit zwischen der Funktion von STAT1 und STAT2 vorhanden sein könnte, mit den Ausnahmen, dass STAT2 in Abwesenheit von STAT1 nur teilweise eine Immunität gegenüber Mykobakterien bewirkt und STAT1 einen STAT2-Mangel im Falle einer Maserninfektion nicht kompensieren kann (MOGENSEN 2018).

SVITEK et al. (2014) haben gezeigt, dass Frettchen, die mit Staupeviren infiziert wurden, welche nicht mit dem STAT2 des Wirtes agieren konnten, nur eine milde, selbstlimitierende Erkrankung aufwiesen, die klinisch vergleichbar mit experimentellen V-Protein knockout CDV Infektionen war. Die Blockierung des STAT1-Signalweges hingegen, führte zu einer Leukopenie und die Tiere starben innerhalb von 14 Tagen, was dem Infektionsverlauf mit einem virulenten CDV- Stamm vergleichbar ist; diese Ergebnisse zeigen, dass die Virulenz des Staupevirus von der STAT2 Interaktion im Wirt abhängig ist (SVITEK et al. 2014).

2.4.3 Interferon stimuliertes Gen 15 (ISG15)

ISG15 ist in den meisten Studien eines der 10 am stärksten aufregulierten ISGs nach IFN Stimulation (DER et al. 1998; DOS SANTOS u. MANSUR 2017). Es

handelt sich um ein Ubiquitin-ähnliches 15 kDa großes Protein, dass durch eine Spaltung mittels einer Protease aus einen inaktiven 17k Da Protein (synonym ISG17 oder „Precursor“ ISG15/ preISG15) hervorgeht (ALBERT et al. 2018; PERNG u.

LENSCHOW 2018). Die Vielfältigkeit der Funktionen von ISG15 kann im Wesentlichen zu zwei Hauptfunktionen zusammengefasst werden: Zum einen gibt es die Ubiquitin-ähnliche Funktion, bei der ISG15 an über 150 zelluläre Proteine bindet, die die Immunantwort regulieren können, einschließlich Mitgliedern der IFN-I-, NFB- und JNK-Signalwege (DOS SANTOS u. MANSUR 2017;

VILLARROYA-BELTRI et al. 2017). Dieser Prozess kann die jeweiligen Signalkaskaden aktivieren oder hemmen und wird als ISGylation bezeichnet (HERMANN u. BOGUNOVIC 2017). Dabei kann ISG15 die Virusfreisetzung auf der Ebene der Virus-Knospung inhibieren (OKUMURA et al. 2006; PINCETIC et al.

2010). Ebenso kann ISG15 die Translation von viraler mRNS inhibieren, wohingegen die Translation von zellulärer mRNS unbeeinflusst bleibt (OKUMURA et al. 2007). Zum anderen gibt es eine freie Form des ISG15, die aus der Zelle sezerniert werden kann oder in der Zelle mittels Zytokin-Produktion und Aktivierung von Immunzellen wirkt (RECHT et al. 1991; D'CUNHA et al. 1996; DOS SANTOS u. MANSUR 2017). Eine vereinfachte Zusammenfassung der vielfältigen Funktionen findet sich in Abbildung 3.

Menschen, die mit inaktivierenden ISG15-Mutationen geboren wurden sind anfällig für mykobakterielle und autoinflammatorische Erkrankungen, nicht jedoch für virale Infektionen (SPEER et al. 2016; HERMANN u. BOGUNOVIC 2017). Diese Beobachtung unterstreicht die Komplexität der ISG15-vermittelten Wirkungen (SPEER et al. 2016; HERMANN u. BOGUNOVIC 2017). Die Empfindlichkeit von ISG15-defizienten Patienten gegenüber Mykobakterien hängt wahrscheinlich mit den Zytokin-ähnlichen Funktionen von sezerniertem ISG15 zusammen, das in Verbindung mit IL12 die Produktion von IFN  durch T-Zellen oder NK-Zellen induziert und somit die antimykobakterielle Aktivität von Makrophagen erhöht (RECHT et al. 1991; BOGUNOVIC et al. 2012; DOS SANTOS u. MANSUR 2017;

HERMANN u. BOGUNOVIC 2017). Nur wenige Studien untersuchten die Funktionen von ISG15 bei Hunden (FAN et al. 2014; DOS SANTOS u. MANSUR 2017; VILLARROYA-BELTRI et al. 2017; ZHANG et al. 2017). Die Ergebnisse dieser Studien deuten jedoch alle auf eine antivirale Aktivität von ISG15 in Hundezellen hin, die durch die direkte Bindung von ISG15 an Virusproteine

vermittelt wird und so die Virusreplikation beeinträchtigen könnte (FAN et al. 2014;

DOS SANTOS u. MANSUR 2017; VILLARROYA-BELTRI et al. 2017; ZHANG et al.

2017).

Abbildung 3: 1 Die Bindung von Typ I IFN (IFN-I) an einen Typ I IFN Rezeptor setzt die JAK-STAT-Signalkaskade in Gang. Neben der Expression zahlreicher anderer ISGs kommt es auch zur Synthese des ISG15 Vorläuferproteins (preISG15). 2 Das ISG15 Vorläuferprotein wird mittels einer frei im Zytoplasma vorliegenden Protease gespalten. ISG15 kann dann über drei verschiedene Wege innerhalb der angeborenen Immunantwort agieren. 3 Die Konjugation von ISG15 an zahlreiche, häufig de novo synthetisierte, intrazelluläre Proteine nennt man ISGylation. Die ISGylation ist eine dreistufige enzymatische Kaskade ähnlich der Ubiquitinisierung, wobei hier noch nicht alle Komponenten der Kaskade bekannt sind. Durch die ISGylation von viralen und Wirtsproteinen kann es zu vielfältigen Funktionen in der Immunantwort kommen, in deren Folge Signalkaskaden aktiviert oder gehemmt werden können. Aufgrund der spezifischen Bindung an Zielproteine können auch nur Stufen der viralen Proteinsynthese, der Virusinfektion, -replikation, oder –freisetzung beeinflusst werden, sodass die Wirtsproteine zwar moduliert werden, aber nicht unbedingt eine Virusabwehr, die mit einem Zelltod einhergeht, folgen muss.

Über die Funktionen von intrazellulären, nicht konjugierten ISG15 ist nur sehr wenig bekannt. Zum einen kann nicht konjugiertes intrazelluläres ISG15 mittels Interaktion mit der Ubiquitin spezifischen Peptidase 18 (USP18), welche JAK1 vom IFNAR-Rezeptor-Komplex verdrängen kann und an STAT2 bindet, die JAK-STAT-Signalkaskade als negativ-Feedback-Mechanismus hemmen. Zum anderen kommt intrazellulärem, unkonjugierten ISG15 eine Bedeutung bei der autophagischen Proteindegradation, besonders von ISGylierten Proteinen, zu.

4 Darüber hinaus kann unkonjugiertes ISG15 über Mikropartikel, Exosomen, neutrophile Granula oder sekretorische Lysosomen sezerniert werden oder mittels Apoptose in den Extrazellularraum gelangen. Unkonjugiertes, extrazelluläres ISG15 kann die Funktion vieler Zelltypen beeinflussen und so u.a. die Sekretion von IFN  induzieren und in Makrophagen die Sekretion von pro-inflammatorischen Zytokinen stimulieren. Modifiziert nach DOS SANTOS u.

MANSUR (2017).

2.4.4 Proteinkinase R (PKR)

PKR ist an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt (GIL u. ESTEBAN 2000;

MUNIR u. BERG 2013; WATANABE et al. 2018). Ursprünglich wurde PKR als antiviral-wirkendes Protein der angeborenen Immunantwort beschrieben. PKR ist einerseits ein ISG, da die Synthese durch IFN induziert werden kann und anderseits ein PRR, da PKR dsRNS erkennt (MEURS et al. 1990; SEN u. RANSOHOFF 1993;

CLEMENS u. ELIA 1997; HONDA u. TANIGUCHI 2006; MUNIR u. BERG 2013;

WATANABE et al. 2018). Im Laufe der Zeit wurden immer vielfältigere Funktionen von PKR beschrieben u.a. in der Steuerung des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung, bei der Regulation entzündlicher Immunantworten und bei der Aufrechterhaltung der metabolischen Homöostase (PETRYSHYN et al. 1984;

CHONG et al. 1992; GIL u. ESTEBAN 2000; WATANABE et al. 2018). Außerdem induziert PKR die Apoptose und sorgt so für die Eradikation von geschädigten Zellen aus Geweben (LEE u. ESTEBAN 1994; DER et al. 1997; BALACHANDRAN et al. 2000), infolge dessen PKR auch lange eine antitumorale Rolle zugeschrieben wurde (JAGUS et al. 1999; MUNIR u. BERG 2013). Die antitumorale Rolle von PKR ist aber umstritten und scheint von der Tumorart, dem Stadium der Tumorentwicklung und der Tumormikroumgebung abzuhängen (WATANABE et al.

2018). Bei einer tumorösen Entartung der Leber beispielsweise ist PKR überexprimiert und die Funktionen von PKR führen zur Tumorprogression (WATANABE et al. 2018).

Auch die Erforschung von antiviral-wirkenden PKR zeigte immer vielfältigere Funktionen (MUNIR u. BERG 2013). Einige Autoren stellten die Rolle von PKR als IFN-Transkript-Stabilisierungsfaktor als große Bedeutung für eine optimale antivirale IFN-Reaktion des Wirts heraus (SCHULZ et al. 2010; MUNIR u. BERG 2013). Als Rezeptor kann PKR zusätzlich zu IFN und dsRNS durch eine Vielzahl von Stimuli aktiviert werden, u.a. durch Zytokine wie Tumornekrosefaktor α (TNFα), Interleukin 1 (IL-1), Lipopolysaccharid (LPS), „toll-interleukin 1 receptor domain containing adaptor protein) (TIRAP), TLR4, „Heatshock protein“ (HSP90), durch ISGylation und einige zelluläre Stressfaktoren wie Arsenit und Wasserstoffperoxid (YEUNG et al. 1996; ITO et al. 1999; GOH et al. 2000; DONZE et al. 2001; HORNG et al. 2001; RUVOLO et al. 2001; MUNIR u. BERG 2013). Eine Aktivierung von PKR führt zur Phosphorylierung verschiedener Substrate, wovon das am besten charakterisierte der eukaryotische Translationsinitiationsfaktor 2 (eIF-2) ist (GIL u.

ESTEBAN 2000). Diese Phosphorylierung von eIF-2 führt zu einer Hemmung oder Herabregulation der viralen und zellulären Proteinsynthese (CLEMENS u. ELIA 1997; PFALLER et al. 2011; OKUMURA et al. 2013; MARCHAL et al. 2014). Welche antivirale Rolle von PKR in der Immunantwort im Vordergrund steht, scheint abhängig vom jeweiligen Virus zu sein (SCHULZ et al. 2010; MUNIR u. BERG 2013). Einige Viren sind in der Lage einer Wirtsreaktion durch eine Blockierung der Aktivierung von PKR zu entkommen (MATHEWS u. SHENK 1991; GALE u. KATZE 1998).

In der Zelle ist PKR vor allem mit Ribosomen assoziiert (ZHU et al. 1997). Ältere Studien beschrieben PKR als zytoplasmatisch lokalisiertes Enzym (DUBOIS u.

HOVANESSIAN 1990; SCHWEMMLE et al. 1992). JEFFREY et al. (1995) beschrieben darüber hinaus eine Proteinexpression humanen PKRs im Kern von Lymphom- und Fibroblasten-Zelllinien, wobei insbesondere eine Färbung des Nukleolus auffiel; nach IFN-Behandlung der Zellen stieg nur der PKR Proteingehalt im Zytoplasma signifikant an, während er im Zellkern nahezu konstant blieb (JEFFREY et al. 1995). In neueren Studien wird eine PKR-Proteinexpression überwiegend in intraläsionalen Gitterzellen und in geringerem Ausmaß in perivaskulären Immunzellen, Oligodendrozyten und Neuronen beschrieben, während Astrozyten von TMEV-infizierten Mäusen kein PKR exprimieren (LI et al.

2015). Ein weiteres Mausmodell beschreibt aktivierte PKR Proteine in Oligodendrozyten, Neuronen, intraläsionalen T-Zellen und Makrophagen bei experimenteller allergischer Enzephalomyelitis (CHAKRABARTY et al. 2004).

2.4.5 2`5`-Oligoadenylatsynthetase (OAS)

Die Viruserkennung durch OAS-Proteine erfolgt durch Detektion dsRNS (ISAACS u. LINDENMANN 1957; SILVERMAN 1994). Aktivierte OAS-Proteine induzieren die Bildung von 2'-5'-Oligoadenylaten aus ATP-Molekülen, welche wiederum die konstitutiv exprimierte Endoribonuklease RNaseL aktivieren können (GALABRU et al. 1985). Dieses OAS/RNaseL-System kann zelluläre und virale RNS abbauen und dadurch die virale Proteinsynthese hemmen (GALABRU et al. 1985; FLENNIKEN et al. 1988; SILVERMAN 1994). Die Produktion von RNS-Spaltprodukten durch die RNaseL initiiert erneut die IFN-I-Produktion, wodurch ein positiver

Rückkopplungsmechanismus bei der antiviralen Abwehr geschaffen wird (SILVERMAN 1994; IORDANOV et al. 2000). Die RNaseL kann auch die Apoptose in Fibroblasten induzieren (DRAPPIER u. MICHIELS 2015). Ebenso ist eine Freisetzung von OAS-Proteinen aus virusinfizierten Zellen in den extrazellulären Raum möglich, wo OAS RNaseL-unabhängig, parakrin und antiviral wirkt, um benachbarte Zellen vor einer Infektion zu schützen (MALATHI et al. 2007;

KRISTIANSEN et al. 2010).

Ähnlich wie PKR werden OAS-Proteine in vielen Geweben (Milz, Lunge, Leber, Thymus, Dünndarm, Gehirn) konstitutiv exprimiert (BALACHANDRAN et al. 2000;

CHAKRABARTY et al. 2004; HOVANESSIAN 2007). Im Hundegenom gibt es drei OAS-Gene (OAS1, OAS2, OAS3) und ähnlich wie bei Mäusen zwei OAS-ähnliche (OASL) Gene, während das humane OASL2-Gen ein Pseudogen darstellt (PERELYGIN et al. 2006). Im Mäusegenom existieren darüber hinaus elf OAS1- Subtypen (OAS1a-k), die bei anderen Säugetierarten jedoch nicht beschrieben wurden (PERELYGIN et al. 2006). Unterschiedliche Rollen oder Funktionsmechanismen der verschiedenen OAS-Proteine und –Gene sind noch weitestgehend unerforscht und unbekannt.

Interessanterweise ist die OAS-Aktivität im Hundeserum 10- bis 100-fach höher als bei Katze, Kaninchen und Meerschweinchen, was auf eine wichtige Rolle der OAS- Proteine im humoralen Immunsystem des Hundes hindeutet (IWATA et al. 2004).

In der Studie war die OAS-Serumaktivität bei weiblichen Beagle-Hunden dahingegen nach Infektionen mit Viren oder Bakterien nur 10-fach erhöht (IWATA et al. 2004). Es schien eine negative Korrelation zwischen der OAS-Serumaktivität und dem Alter und/oder einer Impfung zu geben und es konnte nicht mit Sicherheit ausgeschlossen werden, dass die in dieser Studie verwendeten Hunde dauerhaft mit Viren infiziert waren, ohne klinische Anzeichen zu zeigen (IWATA et al. 2004).

Unter den zoopathogenen Viren soll die Familie der Picornaviridae die höchste Korrelation zwischen der Aktivierung des OAS/RNaseL-Systems und der anschließenden Inhibition der viralen Replikation haben (RYSIECKI et al. 1989;

CLEMENS u. ELIA 1997; DER et al. 1997).

2.4.6 „Myxovirus resistance protein“ (MX)

Die antivirale Wirkung der MX-Proteine wurde bereits 1962 entdeckt, als die Mauslinie A2G eine Resistenz gegenüber eines an die Maus adaptierten Influenzavirus aufwies (LINDENMANN 1962). Verantwortlich dafür war das im Zellkern lokalisierte MX1-Protein der Maus, das die Replikation von Influenzaviren im Kern verhindert (KRUG et al. 1985; BRONI et al. 1990). Vom humanen MxA weiß man, dass es im Zytoplasma lokalisiert ist und die Zelle vor einer ganzen Reihe von Viren unter anderem den Paramyxoviridae wie dem Masernvirus schützen kann (PAVLOVIC et al. 1995). Beim Hund wird von einer zytoplasmatischen Expression von zwei MX-Proteinen („canine Mx1“ und „canine Mx2“) ausgegangen (NAKAMURA et al. 2005). Im Extrazellularraum ist bisher keine Lokalisation oder Funktion von MX-Proteinen beschrieben. Interessanterweise ist das kanine Mx1- Gen enger mit dem humanen MxA verwandt, als mit dem Mx1 aus der Maus (HALLER et al. 2015). Darüber hinaus gibt es teils enorme Speziesunterschiede, so haben Vögel nur ein funktionell aktives MX-Gen und Fische bis zu 7 (LI et al. 2009;

VERHELST et al. 2013; HALLER et al. 2015).

MX-Proteine können den Einbau von Nukleoprotein-Komplexen in die virale Polymerase verhindern, wodurch die Transkription oder Replikation vieler Viren, insbesondere von negativ-orientierten RNS-Viren, unterdrückt werden kann (VERHELST et al. 2013). Darüber hinaus kann MX eine GTPase aktivieren, wodurch virale Proteine abgebaut werden können (HALLER et al. 2015). Die Expression von MX-Proteinen wird als nicht-konstitutiv, sondern als streng nach IFN-I-Stimulation beschrieben (HALLER et al. 2007; ZAV'YALOV et al. 2018).

PORTER et al. (2006) fanden eine starke MX-Expression in Astrozyten, Makrophagen / Mikroglia und Neuronen in Hirngewebe von CDV-infizierten Hunden.

Es wurde auch beschrieben, dass in Kontrollgewebe ausschließlich Endothelzellen und Neuronen MX exprimieren, diese Färbung wurde jedoch teilweise als unspezifisch interpretiert (PORTER et al. 2006). Die klassische Funktion von MX ist die antivirale Wirkung (STARK et al. 1998; HALLER u. KOCHS 2002; NAKAMURA et al. 2005; ZAV'YALOV et al. 2018). MX wird als potentieller Biomarker, mittels dessen Hilfe man zwischen infektiösen Ätiologien differenzieren kann, beschrieben (ZAV'YALOV et al. 2018). In der Studie von PORTER et al. (2006) ist jedoch auch eine Expression von MX Protein in einigen parasitären, mykotischen und idiopathischen Erkrankungen des Hundes, wie z.B. der Neosporidiose, der

Aspergillose, der Enzephalitozoonose, der granulomatösen Meningoenzephalitis und der nekrotisierenden Enzephalitis aufgefallen (PORTER et al. 2006). In bakteriellen Infektionen scheint Mx keine wesentliche Bedeutung zuzukommen (PORTER et al. 2006; ZAV'YALOV et al. 2018). ZAV'YALOV et al. (2018) fasst in einem aktuellen Review die Möglichkeiten zur ätiologischen Differenzierung mithilfe von MX-Proteinen in der Diagnostik zusammen und kommt zu dem Schluss, dass ein Vergleich von MX- und C-reactive protein (CRP)- und / oder Procalcitonin- Werten im Blut zur Unterscheidung von viralen und bakteriellen Erkrankungen schnell, einfach und kostengünstig möglich ist. Diese Zusammenfassung basiert jedoch hauptsächlich auf Studien zu Lungenerkrankungen bei Kindern, es wurden kaum mögliche Beeinflussungen dieser Parameter diskutiert, jedoch wird ein großes Potential für eine mögliche Reduktion der Antibiotika-Gaben in Human-und Tiermedizin durch die Nutzung dieser Proteine als Biomarker diskutiert (ZAV'YALOV et al. 2018).

2.5 Interferon beim Hund

IFN-I und IFN-II sind aufgrund ihrer antiviralen, antitumoralen und immunmodulatorischen Wirkung bei verschiedenen Krankheiten in der Human- und Veterinärmedizin von großen Interesse (FOSTER 2004; BILLIAU 2007). Seit der Entdeckung von IFN wurden parallel zahlreiche Studien zur Erforschung der Rolle von exogenem und endogenem IFN durchgeführt; häufig gingen klinische Studien der Laborarbeit voraus, da sich durch die Wirkung von IFN bei einigen Krankheiten kaum Alternativen boten, als die direkte Anwendung im Menschen (BILLIAU 2007).

Die ersten Berichte, dass kanine Zellkulturen in der Lage sind, IFN zu produzieren, wurden in den 1960er Jahren publiziert (SELLERS u. FITZPATRICK 1963;

AURELIAN u. ROIZMAN 1964). In den 1970er Jahre fanden dann erste Studien zur endogenen IFN-Produktion und zur Reaktion auf exogen zugeführtes IFN im Hund statt (BIBRACK 1975; TSAI u. APPEL 1979). Im Genom des Hundes wurden bislang 10 funktionelle IFN α-Gene und 2 verkürzte Pseudogene, die zusammen mit IFN ε, IFN κ und IFN β auf Chromosom 11 geclustert sind, beschrieben (YANG et al. 2013).

Auch im Hund fanden bereits in den 1980er Jahren vermehrt Studien zur IFN-I Pharmakokinetik und Wirkung statt, während über die Rolle von endogenen IFN-I

und ISGs nur wenig berichtet wurde (GIBSON et al. 1985; BRIDGMAN et al. 1988;

KRAKOWKA et al. 1988). Für die Verabreichung von rekombinantem IFN-α wurde ein pharmakokinetisches Profil im Hund erstellt, wobei alternative Substanzrouten mit der intravenösen (i.v.) Infusionsgabe verglichen wurden; die IFN α- Serumkonzentration lag nach intramuskulärer und subkutaner Injektion bei 42 % verglichen mit der i.v. Infusion, wohingegen die Serumkonzentration nach oraler Verabreichung unterhalb der Nachweisgrenze lag; für die Eliminationshalbwertszeit von IFN α wurde ein Wert zwischen 4,5 und 9,5 Stunden ermittelt (GIBSON et al.

1985). Darüber hinaus wurden Ansätze für eine lokal begrenzte IFN Wirkung entwickelt; eine Applikation von rekombinanten humanen IFN-β in die Harnblase zur Behandlung von Blasenkrebs zeigte keine systemische Bioverfügbarkeit in gesunden Vorstudien-Tieren (HARA 1989) und auch eine Inhalation von IFN scheint vor allem eine pulmonale Wirkung zu erzielen (MALLET et al. 1997), wohingegen eine intranasale Verabreichung von humanem IFN β zur Resorption mit einer langsam abfallenden Plasmakonzentration im Hund führt (IGAWA et al. 1990).

3 PUBLIKATION 1: Type I interferons in the pathogenesis and treatment of canine diseases

Daniela Klotz, Wolfgang Baumgärtner, Ingo Gerhauser

Abstract

Type I interferons (IFNs) such as IFN-α, IFN-β, IFN-ε, IFN-κ, and IFN-ω represent cytokines, which are deeply involved in the regulation and activation of innate and adaptive immune responses. They possess strong antiviral, antiproliferative, and immunomodulatory activities allowing their use in the therapy of different viral diseases, neoplasms, and immune-mediated disorders, respectively. Initially, treatment strategies were based on nonspecific inducers of type I IFNs, which were soon replaced by different recombinant proteins. Drugs with type I IFNs as active agents are currently used in the treatment of hepatitis B and C virus infection, lymphoma, myeloid leukemia, renal carcinoma, malignant melanoma, and multiple sclerosis in humans. In addition, recombinant feline IFN-ω has been approved for the treatment of canine parvovirus, feline leukemia virus, and feline immunodeficiency virus infections. However, the role of type I IFNs in the pathogenesis of canine diseases remains largely undetermined so far, even though some share pathogenic mechanisms and clinical features with their human counterparts. This review summarizes the present knowledge of type I IFNs and down-stream targets such as Mx and 2`,5`-oligoadenylate synthetase proteins in the pathogenesis of infectious and immune-mediated canine diseases. Moreover, studies investigating the potential use of type I IFNs in the treatment of canine lymphomas, melanomas, sarcomas, and carcinomas, canine distemper virus, parvovirus, and papillomavirus infections as well as immune-mediated keratoconjunctivitis sicca and atopic dermatitis are presented. A separate chapter is dedicated to the therapeutic potential of IFN-λ, a type III IFN, in canine diseases.

However, further future studies are still needed to unravel the exact functions of the different subtypes of type I IFNs and their target genes in healthy and diseased dogs and the full potential action of type I IFNs as treatment strategy.

Vet. Immunol Immunopathol 2017, 191:80-93 www.sciencedirect.com

DOI: https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2017.08.006

4 PUBLIKATION 2: Interferon stimulated genes - mediators of the innate immune response during canine distemper virus infection

Daniela Klotz, Ingo Gerhauser

Abstract

The demyelinating canine distemper virus (CDV)-leukoencephalitis represents a translational animal model for multiple sclerosis. The present study investigated the expression of type I interferon (IFN-I) pathway members in CDV-induced cerebellar lesions to gain an insight into their role in lesion development. Gene expression of 110 manually selected genes in acute, subacute and chronic lesions was analyzed using pre-existing microarray data. Interferon regulatory factor (IRF) 3, IRF7, signal transducer and activator of transcription (STAT) 1, STAT2, MX protein, protein kinase R (PKR), 2'-5'-oligoadenylate synthetase (OAS) 1 and interferon-stimulated gene (ISG) 15 expression were also evaluated using immunohistochemistry. Cellular origin of STAT1, STAT2, MX and PKR was determined using immunofluorescence. CDV infection caused an increased expression of the antiviral effector proteins MX, PKR, OAS1 and ISG15, which probably contributed to a restricted viral replication, particularly in neurons and oligodendrocytes. This increase might be partly mediated by IRF-dependent pathways due to the lack of changes in IFN-I levels and absence of STAT2 in astrocytes. Nevertheless, activated microglia/macrophages showed a strong expression of STAT1, STAT2 and MX proteins in later stages of the disease, indicating a strong activation of the IFN-I signaling cascade, which might be involved in the aggravation of bystander demyelination.

Int. J. Mol. Sci. 2019, 20:1620 www.mdpi.com

DOI: https://doi.org/10.3390/ijms20071620

5 Diskussion

5.1 Übersicht über das IFN-System des Hundes

Das IFN-System des Hundes ist mit dem von anderen Säugetieren vergleichbar.

Auch beim Hund können Interferone anhand ihrer spezifischen Bindung an unterschiedliche Rezeptoren in drei Untergruppen unterteilt werden – IFN-I, IFN-II und IFN-III (SMITH et al. 2005; YANG et al. 2013). Die Gruppe des IFN-II umfasst, wie bei allen anderen Tierarten nur das IFN γ, das beim Hund auf Chromosom 10 lokalisiert ist (DEVOS et al. 1992; ZUCKER et al. 1992). Für IFN-III sind bei Menschen vier Subtypen bekannt – IFN λ1, IFN λ2, IFN λ3 und IFN λ4, während beim Hund bisher nur das auf Chromosom 24 lokalisierte IFN λ1 beschrieben ist (FAN et al. 2014; ONABAJO et al. 2019; PROKUNINA-OLSSON 2019).

Bezüglich IFN-I existieren die größten tierartlichen Unterschiede. Der Hund weißt mit IFN α, IFN β, IFN ε und IFN ĸ, verglichen mit Menschen, Mäusen, Katzen, Schweinen und Wiederkäuern eine relativ geringe Subtypisierung der IFN-I Gruppe auf (ROBERTS et al. 1992; LEFEVRE u. BOULAY 1993; ROBERTS 1993;

KONTSEK et al. 2003; KRAUSE u. PESTKA 2005; YANG et al. 2013). YANG et al.

(2013) beschrieben 10 funktionelle IFN α Gene und zwei verkürzte Pseudogene, die zusammen mit den anderen Subtypen des IFN-I (IFN β, IFN ε und IFN ĸ) auf Chromosom 11 des Hundegenoms geclustert sind, wobei die genauen Sequenzen, die Lokalisationen und die Namen der verschiedenen IFN α-Subtypen nicht genannt wurden (YANG et al. 2013). Basierend auf veröffentlichen Sequenzen waren nur 5 verschiedene IFN α Subtypen im Hundegenom zu identifizieren. Diese Klassifizierung basiert bisher ausschließlich auf Sequenzhomologien und nicht auf funktionellen Eigenschaften der verschiedenen IFN α Subtypen.

5.2 IFN-I als (potentielles) Therapeutikum im Hund

Einige klinische Studien beschäftigen sich mit der Rolle von exogen zugeführtem IFN-I als potentiell therapeutisches Mittel gegen eine Vielzahl viraler und nicht viraler Erkrankungen. Die Schwäche dieser Untersuchungen besteht darin, dass die Studien häufig nur eine geringe Tieranzahl aufwiesen oder dass nur Einzelfälle untersucht wurden (GILGER et al. 1999; FOSTER 2004; STOKKING et al. 2004;

THOMPSON et al. 2004; CALLAN et al. 2005; TZANNES et al. 2008;

FINOCCHIARO et al. 2011; LITZLBAUER et al. 2014; TOWNSELL et al. 2015).

Insbesondere zu dem potenziellen Einsatz von IFN-I bei der Behandlung von Lymphomen, Melanomen, Sarkomen und Karzinomen des Hundes (TATEYAMA et al. 1995; KESSLER et al. 1996; CLIFFORD et al. 2000; TZANNES et al. 2008;

PENZO et al. 2009; FINOCCHIARO et al. 2011), Staupevirus-, Parvovirus- und Papillomavirus-Infektionen (ISHIWATA et al. 1998; MINAGAWA et al. 1999;

MARTIN et al. 2002; DE MARI et al. 2003; STOKKING et al. 2004; CALLAN et al.

2005; LUFF et al. 2013; CARVALHO et al. 2014; LUFF et al. 2014; TOWNSELL et al. 2015), sowie immunvermittelter Keratokonjunktivitis sicca und atopischer Dermatitis (GILGER et al. 1999; CARLOTTI et al. 2009; LITZLBAUER et al. 2014) gibt es Untersuchung zur Wirkung und Rolle von IFN-I. Im Folgenden wird auf die Wirkungen von IFN-I, die bereits durch, in Hunden durchgeführten Studien, belegt sind, sowie auf die Wirkung von endogenem und exogenem IFN-I bei Staupevirusinfektionen eingegangen.

Das einzige in Europa und in der Veterinärmedizin zugelassene IFN-Präparat ist das rekombinante, feline IFN ω (Virbagen® Omega, Virbac S.A., Frankreich) zur Behandlung von kaninen Parvovirus-, felinen Leukämievirus- und felinen Immundefizienzvirus-Infektionen (BALLIN et al. 2014). Das Präparat zeigt interessanterweise, trotz der früheren Beschreibung einer hohen Speziesspezifität, auch bei Hunden eine gute Wirksamkeit (IWATA et al. 1996). Hunde mit kaniner Parvovirusinfektion zeigten nach IFN ω Behandlung eine klinische Verbesserung und eine reduzierte Mortalität (MINAGAWA et al. 1999; MARTIN et al. 2002; DE MARI et al. 2003).

Die endogene IFN-Produktion wurde bereits während einer experimentell- induzierten, kaninen Staupevirusinfektion im Serum und Liquor cerebrospinalis (CSF) gemessen (TSAI et al. 1982). In dieser Studie wurde am 16. Tag nach der Infektion kein IFN im Serum mehr nachgewiesen, während IFN im CSF über einen längeren Zeitraum (bis Tag 21 nach der Infektion) nachgewiesen wurde. Die CDV- infizierten Hunde mit erhöhten IFN-CSF-Titern waren moribund, weshalb sie zu diesem Zeitpunkt euthanasiert wurden (TSAI et al. 1982). Aus diesen Beobachtungen folgte die Hypothese, dass der Nachweis von IFN-I im CSF von Hunden als Biomarker für eine CDV-Persistenz, sowie für eine Schätzung des Schweregrades von ZNS-Läsionen verwendet werden könnte (TSAI et al. 1982;

KIMOTO 1986). Eine in vitro Studie zur Wirkung von exogen zugeführten IFN zeigte,

dass in CDV-infizierten Vero-Zellen, durch die kombinierte Gabe von Ribavirin und IFN α ein antiviraler Effekt vorlag, der zur Inhibition der CDV Replikation führte (CARVALHO et al. 2014). Darüber hinaus gibt es eine Einzelfallbeschreibung, bei der IFN einem 9 Wochen alten Mischlingswelpen mit respiratorischer Symptomatik durch eine spontane Staupevirusinfektion als Therapieversuch appliziert wurde (TOWNSELL et al. 2015). Der Ausgang dieses Therapieversuchs bleibt jedoch offen (TOWNSELL et al. 2015). Eine abschließende Beurteilung des Potentials von IFN-I zur Behandlung von infektiösen, insbesondere viralen Infektionen ist aufgrund der derzeit nur sehr fragmentarisch vorhandenen Daten, die überwiegend aus Einzeltieruntersuchungen stammen, nicht möglich. Eine Ausnahme hiervon stellt die kanine Parvovirusinfektion dar, da der Behandlungserfolg als wissenschaftlich belegt gilt. Für eine Beurteilung sind experimentelle und systematische Untersuchung bei spontanen Erkrankungen mit einer größeren Tieranzahl und vor allem mit Einschluss von Kontrolltieren erforderlich.

Da IFN-I in so viele Signalkaskaden eingreifen kann und es niemals ein

„Wundermittel“ geben wird, dass gegen eine solche Vielzahl von Erkrankungen, in denen IFN-I laut Einzelfallberichten ein therapeutisches Potential haben soll, geben wird, ist es zudem äußerst fraglich ob IFN-I, das ziemlich in der Mitte der IFN- Signalkaskade steht, überhaupt der richtige Ansatzpunkt für solche groß angelegten Studien wäre. Oder ob es nicht sinnvoller ist, die Funktion der einzelnen ISGs weiter zu erforschen, auf der Suche nach etwas, was gezielt in den Mechanismus der Virusreplikation, Demyelinisierung, Tumorentstehung, Tumorprogression und/oder Immunmodulation eingreifen kann.

5.3 IFN-I und ISGs im Verlauf der Staupevirusinfektion

Im Rahmen dieser Arbeit wurden ausgewählte ISGs mittels Immunhistologie untersucht und die Ergebnisse mit bereits veröffentlichten Transkriptomdaten (Microarray-Analyse von Ulrich et al. 2014) in Verbindung gebracht. Mithilfe der Microarray-Analysen wurde bei keinem Stadium (akut, subakut, chronisch) der Staupevirusinfektion ein Unterschied in der IFN-I Expression in CDV-infizierten Kleinhirngewebe und Kontrolltieren festgestellt, was dafürspricht, dass CDV in der Lage ist, die direkte IFN-I Antwort zu modulieren oder zu hemmen. Mehrere Studien berichten davon, dass das V-Protein von Paramyxoviren an den MDA5 Rezeptor binden kann und dadurch die IFN-I Expression herunterreguliert wird, sodass die