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Untersuchungen zum oxidativen Stress beim Hund unter besonderer Berücksichtigung der Lebererkrankungen

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Tierärztliche Hochschule Hannover

Untersuchungen zum oxidativen Stress beim Hund unter besonderer Berücksichtigung der Lebererkrankungen

INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet)

vorgelegt von Alp Altunay Safranbolu/Türkei

Hannover 2009

(2)

Wissenschaftliche Betreuung:

Prof. Dr. Reinhard MISCHKE, Klinik für Kleintiere

Prof. Dr. Dr. h.c. Hans-Peter SALLMANN, Institut für Physiologische Chemie

1. Gutachter: Prof. Dr. Reinhard MISCHKE

Prof. Dr. Dr. h.c. Hans-Peter SALLMANN

2. Gutachter: Prof. Dr. Bernd SCHRÖDER

Tag der mündlichen Prüfung: 06.11.2009

(3)

Gewidmet

Ahmet und Semra ALTUNAY

(4)

(5)

INHALTSVERZEICHNIS Seite

Abkürzungen

1 Einleitung 1

2 Literaturübersicht 3

2.1 Reaktive Sauerstoff-Spezies 3

2.1.1 Physiologische Funktion und Produktion der reaktiven Sauerstoff-Spezies 4

2.1.2 Produktion und pathologische Funktion der reaktiven Sauerstoff-Spezies 4

2.2 Antioxidantien 7

2.3 Pathophysiologie des oxidativen Stresses 10

2.3.1 Oxidativer Stress und Lipidstruktur, Lipidperoxidation 11

2.3.1.1 Oxidationsprodukte von Lipiden und Lipoproteinen 12

2.3.2 Oxidativer Stress und Proteinstruktur 14

2.3.3 Oxidativer Stress und Nukleinsäuren 16

2.3.4 Oxidativer Stress und Leber 17

2.4 Oxidativer Stress bei sonstigen Organerkrankungen und Stoffwechselzuständen 22

2.4.1 Oxidativer Stress und Narkose 28

2.5 Ausgewählte analytische Methoden zur Untersuchung

des oxidativen Stresses und der Lipidperoxidation 30

2.5.1 Nachweis und Quantifizierung von Lipidperoxidationsprodukten,

Malondialdehydmessung 31

2.5.2 Komet-Test 33

2.5.3 Antioxidative Kapazität 34

3 Material und Methoden 36

3.1 Versuchsplan 36

3.2 Tiere 37

3.3 Probengewinnung 45

3.3.1 Blutentnahme und Plasmagewinnung 45

3.3.2 Leberorganentnahmen und Weiterverarbeitung 45

3.4 Malondialdehydmessungen 46

3.4.1 Thiobarbitursäure-Reaktive Substanzen, Fluorophotometrische Messung 46

3.4.2 Malondialdehydmessung mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie 49

(6)

3.5 Komet-Test 51

3.6 Antioxidative Kapazität 55

3.7 Nicht-veresterte Fettsäuren 57

3.8 Klinisch-chemische Messungen 58

3.9 Hämatologische Untersuchungen 59

3.10 Statistische Auswertung 59

4 Ergebnisse 61

4.1 Methodische Vorversuche 61

4.1.1 Einfluss der Elektrophoresedauer auf das Ergebnis des Komet-Tests 61

4.1.2 Zusammensetzung der Zellfraktion und Einfluss auf das Ergebnis

des Komet-Tests 62

4.1.3 Einfluss der Lagerung auf Eis auf das Ergebnis des Komet-Tests 63

4.2 Einfluss der Narkose 63

4.3 Vergleich verschiedener Erkrankungsgruppen 67

4.4 Vergleich verschiedener Lebererkrankungen 69

4.5 Beziehung zwischen verschiedenen Messgrößen bei Lebererkrankungen 71

4.6 Beziehung zwischen verschiedenen Messgrößen im Plasma bei der

Gesamtzahl der Hunde 73

5 Diskussion 76

5.1 Methodische Vorversuche 76

5.2 Einfluss der Narkose 79

5.3 Parameter des oxidativen Stresses bei Erkrankungsgruppen 82

6 Zusammenfassung 91

7 Summary 93

8 Literaturverzeichnis 95

9 Tabellarischer Anhang 140

10 Danksagung

(7)

Abkürzungsverzeichnis

ALT Alanin Aminotransferase

AOK Antioxidative Kapazität

AP Alkalische Phosphatase

ca. circa

°C Grad Celsius

d.h. das heißt

DNA Desoxyribonukleinsäure

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

et al. und andere

Fa. Firma

g Gramm

g Gravitationskonstante

GLDH Glutamatdehydrogenase

h Stunde

HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie

kg Kilogramm

l Liter

LPO Lipidperoxidation

MDA Malondialdehyd

mg Milligramm

ml Mililiter

Min Minute

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

mmol Millimol

NEFA nicht-veresterte Fettsäuren

nmol Nanomol

pH Wasserstoffionenkonzentration

RSS reaktive Sauerstoff-Spezies

sec Sekunde

SOD superoxid dismutase

TBA Thiobarbitursäure

TBARS Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen

u.a. und andere

(8)

(9)

1 1 EINLEITUNG

Alle vielzelligen lebenden Systeme nutzen den atmosphärischen, molekularen Sauerstoff (O2) als Oxidans, also als Elektronenakzeptor; vor allem im Rahmen der biologischen Oxidation in den Mitochondrien der Zellen zur Gewinnung ausreichender Wachstums-, Differenzierungs- und Lebensenergie (auch Wärmeenergie), die überwiegend in Form energiereicher Phosphate (Adenosintriphosphat, Guanosintriphosphat u.a.) gespeichert wird. Diese lebenswichtige Reaktion läuft unter physiologischen Bedingungen, sorgfältig kontrolliert in mehreren Zwischenstufen, in den Mitochondrien ab. Etwa 3% des dabei zugrunde liegenden Elektronentransfers kann zur Bildung von Sauerstoffradikalen, die wegen ihrer Reaktivität als

„reaktive Sauerstoff-Spezies“ (RSS) bezeichnet werden, und anderen reaktiven Sauerstoffprodukten führen (BOVERIS und CADENAS, 1975; HALLIWELL und GUTTERIDGE, 1984). Ein Teil der freigesetzten Radikale (ca. 2–4%) gelangt ins Zytosol und wird dort von antioxidativen Schutzsystemen abgefangen. Die Entstehungsweisen der gebildeten RSS sind vielfältig und finden sowohl unter physiologischen als auch pathologischen Bedingungen statt (HALLIWELL und GUTTERIDGE, 1984; FRENKEL, 1992).

Es existiert unter normalen physiologischen Bedingungen ein Gleichgewicht zwischen den RSS und den antioxidativen Schutzsystemen, wobei die Lage des Gleichgewichtes in verschiedenen Gewebesystemen unterschiedlich ausgerichtet sein kann. Wenn dieses Gleichgewicht entweder durch gesteigerte peroxidative Prozesse oder durch ungenügenden antioxidativen Schutz auf die Seite der reaktiven Spezies gestört wird, bezeichnet man diesen Zustand als ″oxidativen Stress″ (SEIS, 1986; 1991; 1997).

Dem oxidativen Stress wird eine Kofaktorrolle bei der Pathogenese vieler Erkrankungen beigemessen, weil die RSS durch Schädigung der funktionellen Proteine (AMES et al., 1993;

BOURDON et al., 1999), der Nukleinsäuren (LIU et al., 1996; ARIMOTO-KOBAYASHI et al., 2002) sowie der insbesondere membranständigen Lipidausstattung (LIU et al., 1996;

ABOUTWERAT et al., 2003) essentielle Schädigungen der Zellen verursachen können.

Großes Interesse hat beim Menschen unter anderem in experimentellen und klinischen humanmedizinischen Arbeiten die eventuelle ursächlichen oder begleitenden Bedeutung des oxidativen Stresses bei Erkrankungen der Leber als Hauptstoffwechselorgan hervorgerufen

(10)

2

(JAESCHKE et al., 2002; SENTÜRK, 2004; MALHI und GORES, 2008), wo u.a. ein Zusammenhang zwischen Lipidperoxidation (LPO) in Blutplasma und Leber und der Schwere der histopathologischen Leberbefunde festgestellt wurde.

Über die Beteiligung und Bedeutung der RSS bei Lebererkrankungen des Hundes liegen bislang nur wenige, sehr selektive Daten vor, die sich vorwiegend mit der antioxidativen Abwehr befassen. Bei Hunden der Rasse Dobermann mit Kupfer-induzierter Hepatopathie wurde im Vergleich zu Hepatopathien mit normaler Kufperkonzentration und normalen Kontrollen die reaktiven und RSS-induzierenden Eigenschaften des Kupfers untersucht (SPEE et al., 2005). Bei Hepatopathien zeigte sich eine verminderte Konzentration von antioxidativen Abwehrsubstanzen. Die Genexpression der Kupfer-Bindeproteine (mRibonukleinsäure) und Bindeproteine des Kupfers (Metallthionein u.a.) waren bei der Kupfer-induzierten Hepatopathie vermindert und Kupfer- und RSS-Konzentration korrelierten. CENTER et al. (2002) fanden bei spontan leberkranken Hunden und Katzen mit verschiedenen pathologischen Diagnosen, signifikant niedrigere Glutathion-Konzentrationen des Lebergewebes. Zudem wurden experimentelle Untersuchungen an kultivierten caninen Gallengangsepithelien zur Rolle des Leberwachstumsfaktors beim Schutz vor H2O2- induziertem oxidativem Stress durchgeführt (ARENDS et al., 2008).

Daher soll der Schwerpunkt in der vorliegenden Arbeit auf Untersuchungen zur Intensität der peroxidativen Prozesse (Konzentration von Malondialdehyd [MDA], Thiobarbitursäure- reaktiven-Substanzen [TBARS], Plasma-Lipid-Substanzen, und Komet-Test zur Erfassung der DNA-Schädigung) und des antioxidativen Schutzes bei leberkranken Hunden gelegt werden, wobei Leber- und Plasmaproben untersucht werden. Vergleichsuntersuchungen sollen aus dem Blut von gesunden Hunden und Hunden mit einer orthopädischen Erkrankung (Kreuzbandriss) und Weichteilerkrankungen erfolgen.

Die eigene Studie verfolgt dabei folgende Zielsetzungen:

- Erfassung der Rolle des oxidativen Stresses und der LPO bei Lebererkrankungen des Hundes

- Überprüfung, inwieweit sich im Blutplasma als leichter zugänglichem Untersuchungsmaterial, die Verhältnisse in Lebergewebe widerspiegeln

- Durch parallele Messung von MDA, TBARS und Komet-Test soll weiterhin überprüft werden, ob LPO einen schädigenden Einfluss auf die Lymphozyten-DNA hat.

(11)

3 2 LITERATURÜBERSICHT

2.1 Reaktive Sauerstoff-Spezies

Der molekulare Sauerstoff „O2“ ist ein „Biradikal“. Dies ist die stabilste Form des Sauerstoffs, die als Grundzustand bezeichnet wird. Da die zwei äußeren Elektronen parallel ausgerichtet sind, d.h. sie besitzen einen parallelen Spin, sorgen sie aus Spinverbotsgründen für den relativ reaktionsträgen Zustand dieses molekularen Sauerstoffderivates. Die RSS entstehen, weil Sauerstoff als Oxidationsmittel fungiert und Elektronen von anderen Molekülen aufnimmt (HALLIWELL und GUTERIDGE, 1984; SEIS, 1985; MORTIMER, 1987). Dabei führt die Einelektronenaufnahme zum reaktiven Sauerstoffsuperoxid-Radikal (O2·-). Werden 2 Elektronen übertragen und die resultierende Verbindung mit 2 Protonen versehen, entsteht Wasserstoffperoxid (2O2-+2e +2H+ = H2O2 + O2). Bei der Reduktion des Sauerstoffs mit vier Elektronen und der Bindung zweier Protonen entsteht Wasser (O2 + 4e + 4H+ = 2H2O), was der physiologischen Wasserbildung im mitochondrialen Stoffwechsel entspricht. Die wichtigsten Radikale sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1: Reaktive Sauerstoff-Spezies (nach LÖFFLER und PETRIDES, 2000)

Spezies Name Bemerkung

O2¯

· Superoxid-Radikal Bei Autooxidationsreaktion gebildet HO2· Perhydroxyl Protonierte Form von O2

H2O2 Wasserstoffperoxid Häufig enzymatisch gebildet

HO· Hydroxyl-Radikal Entstehung durch Metallkatalysierung RO· R-Oxyl-Radikal Organisches Radikal bei Lipidperoxidation ROO· R-Dioxyl-Radikal Organisches Radikal bei Lipidperoxidation ROOH· R-Hydroperoxyd Protonierte Form von Dioxylradikalen

(12)

4

2.1.1 Physiologische Funktion und Produktion der reaktiven Sauerstoff-Spezies

Reaktive Sauerstoff-Spezies spielen eine Rolle bei der Erfüllung von essentiellen biologischen-physiologischen Aufgaben und Reaktionen des Organismus. So wird Superoxid bei Entzündungsreaktionen der unspezifischen Abwehr, wie dem „respiratory burst“, in phagozytierenden Zellen wie Monozyten, Makrophagen und polymorphkernigen Leukozyten, zur Bekämpfung von Bakterien, Pilzen oder Parasiten benutzt (BABIOR, 2000). In das extrazelluläre Milieu abgegebene Superoxidanionen gelten darüber hinaus als ein Teil von chemotaktischen Faktoren für andere Entzündungszellen (COLLINS et al., 1995). Des Weiteren sind RSS bekannt als Ereignis der Signaltransduktion bei verschiedenen Regulationsmechanismen, wie Wachstumsfaktoren und Zytokinen, z.B. Epidermal-Growth- Faktor-Receptor, Transformig-Growth-Faktor-β, Tumornekrose-Faktor-α, Interleukin-8 oder als sekundäres Messenger System über die Aktivierung von Nuklearfaktor-Kappa-B (REMACLE et al., 1995; BAE et al., 1997; MARTIN et al., 1997; O´KELLY et al., 2000;

JAESCHKE et al., 2002).

2.1.2 Produktion und pathologische Funktion der reaktiven Sauerstoff-Spezies

Unter physiologischen Bedingungen werden aber vor allem in der Atmungskettenfunktion kleine Mengen an toxisch wirkenden freien Sauerstoffradikalen gebildet (BECKMAN und AMES, 1998; HALLIWELL, 2000; SINGH et al., 2004). Diese geringen Quantitäten toxischer Substanzen entstehen, sozusagen als Abfallprodukte der intermediären Stoffwechselprozesse. Sie sind hochreaktiv und besitzen meist nur eine kurze Halbwertszeit.

In der Tabelle 2 sind die RSS-bildenden Vorgänge zusammengefasst. Weil die Superoxidradikale und vor allem auch Wasserstoffperoxid andere kompetente reine und kombinierte Sauerstoffverbindungen (z.B. O3, OH, oder NO) im Zellstoffwechsel bilden können und diese Verbindungsklasse zu den stärksten Oxidantien zählen, ist die Verfügbarkeit von Sauerstoff für aerob lebende Spezies einerseits essentielle Voraussetzung.

Andererseits besteht die toxische Bedrohung durch oben genannte radikalischen Varianten des Sauerstoffs (HALLIWELL und GUTTERIDGE, 2000). Man bezeichnet diesen Zusammenhang deshalb auch als „Sauerstoff-Paradoxon“ (ELSAYED, 2001).

(13)

5

Im Detail generieren viele Enzymsysteme des Organismus bei physiologischen Vorgängen RSS (FRENKEL, 1992). Einige davon sind in die mikrosomalen und mitochondrialen Elektronentransportketten integriert. Daneben existieren enzymatische Umsetzungen in Peroxysomen oder im Zytosol, wie z.B. das Xanthin-/Xanthinoxidase-System (McCORD, 1985; SANDERS et al., 1997), die Prostaglandin-Synthese oder das Zytochrom P450-System im endoplasmatischen Retikulum, welches aus Sauerstoff konzentrationsabhängig Superoxidanionen produziert (GOEPTAR et al., 1995).

Tabelle 2: Prozesse, bei denen reaktive Sauerstoff-Spezies entstehen (nach FRENKEL ,1992)

A - Zelluläre Atmung

• Mitochondrialer Elektronentransport

• Hexosemonophosphatshunt

B - Biosynthese und Abbau im normalen intermediären Metabolismus

• Arachidonsäuremetabolismus

• ß-Oxidation von Fettsäuren

• Oxidation von Aminosäuren

• Biosynthese von Ascorbinsäure

• Eisenmetabolismus

• Oxidation von Polyaminen

• Biosynthese von Steroiden

• Oxidation von Purinen

C - Biotransformation von Fremdstoffen

• Mikrosomaler Elektronentransport (Zytochrom P450)

• Andere Oxidasen

• Peroxidative Oxidation (Myeloperoxidasen, Prostaglandin-Synthetase) D - Aktivierung von phagozytotischen Zellen durch natürliche Stimuli

• Periphere Leukozyten

• Makrophagen aus Geweben

• Kupfferzellen (Leber)

• Clarazellen (Lunge)

Zelluläre Detoxifikationssysteme, vor allem das hepatische Detoxifikationssystem und die Arachidonsäurekaskade, welche die Enzyme Cyclooxygenase und Lipooxygenase enthalten, sind von entscheidender Bedeutung bei der Entstehung von RSS. Auch im Anschluss an die Phagozytose von Leukozyten, insbesondere der neutrophilen Granulozyten und

(14)

6

Makrophagen, werden Radikale gebildet (McCORD, 1993; BABIOR, 2000). Eine weitere bedeutende Quelle ist der Stoffwechsel vieler Xenobiotika im Mechanismus der Entgiftung.

Ein Beispiel ist das Chemotherapeutikum Bleomycin (TRUSH et al., 1982; MAHMUTOGLU et al., 1987). Aber auch eine Reihe physikalischer Einflüsse, wie die verschiedenen Strahlungsarten oder mechanischen Reize, können Radikale bilden. So entstehen bei der hämolytischen Wasserspaltung, der Radiolyse, aus einem Wassermolekül ein Wasserstoffradikal (H•) und ein Hydroxylradikal (OH•), die als Auslöser für die akute Strahlenkrankheit verantwortlich gemacht werden (MORCILLO et al., 2000).

Reaktive Sauerstoff-Spezies sind aus mehreren Gründen zellpathogen. Wegen ihrer hohen Reaktivität können sie praktisch mit allen molekularen Strukturen der Zellen reagieren, was, je nach Lebensdauer des Radikals von Bildungsort und Reaktionspartner abhängig, über den Nekroseweg oder den Apoptoseweg zu strukturellen und funktionellen Störungen bis zum

„Zelltod“ führen kann (WISEMAN und HALLIWELL, 1996). Die bedeutenden Schädigungen stellen LPO-induzierte Membranschädigungen und anschließende RSS- induzierte DNA-Schäden dar, die in den Zellen Apoptose induzieren (DAVIES, 1999), und die in der Folge zu mutagenen und kanzerogenen Ereignissen führen können (MARNETT, 2000). Apoptose ist ein wichtiger Mechanismus, um den Organismus vor potentiellen Gefahren wie gentoxisch geschädigten oder viral infizierten Zellen zu schützen (SHUB, 1994). Die Bedeutung des Zelltodes für den Organismus als Gesamtheit wird besonders deutlich, wenn dieser Prozess fehlreguliert ist. Dabei lassen sich Krankheiten durch eine gesteigerte Apoptose-Induktion (z.B. Morbus Alzheimer und Morbus Parkinson;

THOMPSON, 1995; OFFEN et al., 2000) von solchen unterscheiden, die auf einem Apoptose-Mangel beruhen z.B. viele Tumorerkrankungen und Autoimmundefekte (ROSEN und CASCIOLA-ROSEN, 1999).

Unter den Begriff reaktive Spezies gehören auch freie Metallionen, die sich in ganz geringen Konzentrationen im Körper befinden. Sie werden im Plasma mit Transportproteinen verbunden und sicher transportiert (ARUOMA und HALLIWELL, 1987; STOHS und BAGCHI, 1995). So schützt sich der Organismus sozusagen selbst vor den wenigen aber wichtigen Metallionen (Fe, Cu, u.a.), die am Metabolismus außerhalb und in der Zelle teilnehmen. Wenn diese Konzentration freier Metallionen im Plasma erhöht ist, können sich freie Metallionen als Radikal halten und mit ihren ungepaarten Elektronen von

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7

Makromolekülen, wie DNA, Lipiden und Proteinen, weitere Radikale bilden oder RSS- Bildung initiieren und/oder unterstützen (HALLIWELL und GUTTERIDGE, 1984). Dieser Mechanismus spielt bei der Pathogenese der Krankheiten eine Rolle, die mit einer Erhöhung freier Metallionen verbunden sein können oder verbunden sind, wie z.B. die idiopathische Hämochromatose oder Metallionen-induzierte chemische Karzinogenese (GROOTVELD et al., 1989; KAWANISHI et al., 2002).

2.2 Antioxidantien

Der Organismus wird unter physiologischen Bedingungen durch ein vielseitiges antioxidatives Schutzsystem geschützt (HALLIWELL und CHIRICO, 1993). Die Entwicklung dieser Schutzsysteme stellten während der Evolution in der sauerstoffreichen Atmosphären einen Selektionsvorteil dar (STOHRER et al., 2002). Gegen die RSS verfügt der Organismus über verschiedene Antioxidantien als Grundlage seiner Homöostase. Die wichtigsten Antioxidantien sind in der Tabelle 3 zusammengefasst. Es gibt enzymatische und nicht enzymatische, lipid- und wasserlösliche, intra- und extrazellulär vorkommende Antioxidantien (OHLENSCHLÄGER, 1995; WOODFORD und WHITEHEAD, 1998).

Antioxidantien schützen die Zellen, indem sie ein Elektron an das Radikal abgeben und es dadurch neutralisieren. So schützen sie Lipide, Proteine und DNA (MARCILLAT et al., 1988) vor Oxidation. Ein Teil des antioxidativen Abwehrsystems sind enzymatische antioxidative Abwehrsubstanzen, wie z.B. Superoxid-Dismutase (SOD), Katalase und Glutathion-Peroxidase u.a. (OHLENSCHLÄGER, 1995; WOODFORD und WHITEHEAD, 1998). Zu den nicht enzymatischen Antioxidantien gehören bestimmte Proteine (z.B.

Albumin, Transferrin, Lactoferrin u.a.) sowie die Plasma-Parameter Bilirubin und Harnsäure (WAYNER et al., 1985; FRENKEL, 1992; LÖFFLER und PETRIDES, 2000; NEMEC et al., 2000; SZCZUBIAL et al., 2004; McMICHAEL, 2007). Die angeführten Substanzen sind aber passive, präventive Antioxidantien, die im Gegensatz zu anderen Antioxidantien (z.B.

enzymatische, wie Katalase, Glutathion-Peroxidase oder Vitamine, wie Vitamin E und Vitamin C) nicht in der Lage sind, gegen bereits gebildete Radikale vorzugehen. Ihre Aufgabe besteht im Binden von z.B. freien Metallionen, so dass diese nicht mehr als Katalysatoren für Radikalbildungen aus z.B. H2O2 zur Verfügung stehen (HALLIWELL et al., 1992;

(16)

8

OHLENSCHLÄGER, 1995; WOODFORD und WHITEHEAD, 1998). McMICHAEL (2007) schätzt in diesem Zusammenhang die Bedeutung der verschiedenen Antioxidantien an der gesamten antioxidativen Kapazität des Plasmas wie folgt: Albumin 43%, Harnsäure 33%, Vitamin C 9%, Vitamin E 3%, Bilirubin 2%, und andere 10%.

Tabelle 3: Antioxidantien (FRENKEL, 1992)

1. Antioxidative Enzyme

• Superoxid-Dismutase

• Katalase

• Glutathion-Peroxidase

• Glutathion-Reduktase

• Glutathion-S-Transferase 2. Antioxidative Proteine

• Ceruloplasmin

• Transferrin

• Lactoferrin

• Albumin

• Haptoglobin

3. Antioxidative Substanzen mit niedrigerem molekularem Gewicht

• Glutathion, NAD(P)H

• Ascorbinsäure

• Harnsäure

• α-Tocopherol

• β-Karotin

4. DNA-Reparatur-Enzyme A. Glycosylase-Aktivitäten auf:

• 5-Hydroxymethyl-Cytosin

• 5-Hydroxymethyl-Uracil

Thyminglykol und Derivate (5-Hydroxyl-5-Methylhydantoin, N´-Formyl-N-Pyruvyl- Harnstoff, Harnstoff)

B. Endonukleasen

C. Poly-ADP-Ribose-Transferase

5. Oxidierte Proteinasen

• Macrooxyproteinasen

(17)

9

Bei der Neutralisierung von Radikalen können Antioxidantien jedoch auch selbst zum organischen Radikal werden und oxidative Schäden verursachen. Dieser Zusammenhang, d.h.

die möglichen prooxidativen Eigenschaften der antioxidativen Abwehrsubstanzen, wird von HALLIWELL (2000) als „antioxidatives Paradoxon“ bezeichnet (Tabelle 4). Prooxidative Effekte von nicht enzymatischen Antioxidantien, wie die Vitamine A, C, E, erwähnen auch MURATA und KAWANISHI (2000).

Tabelle 4: Verschiedene paradoxe Wirkungen von oxidativen bzw. antioxidativen Substanzen (HALLIWELL, 2000)

• Antioxidantien können die Zellproliferation hemmen durch Verhinderung von vorübergehenden Oxidationen, die die Proteinphosphorylierung und Transkriptionsfaktoren stimulieren.

• Durch Abfangen von von überschüssigen reaktiven Spezies schützen sie vor oxidativen Schäden und blockieren die Freisetzung von Metallionen, die diese Schädigung katalysieren.

• Außerdem können Antioxidantien die Adaption auf oxidative Schäden durch verminderte Transkriptionsfaktoraktivierung verhindern und die oxidative Schädigung beschleunigen, indem sie Metallionen reduzieren, die dadurch zu besseren Promotoren einer Schädigung werden.

• Schließlich hemmen sie die durch freie Radikale induzierte Apoptose, was entweder die Zelle rettet oder zu ihrer Entartung führt. Anstelle von Apoptose kann auch Nekrose erfolgen und der Schaden wird über freigesetzte Zellinhalte an die Umgebung der Zelle weitergegeben.

Für die Homöostase des Organismus muss eine sehr feine Balance zwischen den ständig in geringeren Mengen und im Krankheitsfall intensiver produzierten RSS und den gespeicherten und zirkulierenden antioxidativen Substanzen bestehen (WOODFORD und WHITEHEAD, 1998). Die Kontrolle und somit die Messung der antioxidativen Kapazität (AOK) ist von großer medizinischer Bedeutung. Liegt eine erniedrigte AOK vor, so kann diese einerseits auf der primären Reduktion der Antioxidantien und andererseits auf einer sekundär bedingten Reduktion, d.h. durch eine größere Beanspruchung des antioxidativen Systems als Konsequenz von oxidativem Stress, beruhen (WOODFORD und WHITEHEAD, 1998).

(18)

10 2.3 Pathophysiologie des oxidativen Stresses

Werden zu viele und/oder über einen zu langen Zeitraum RSS gebildet, versagen die Schutzmaßnahmen des antioxidativen Systems. Es entsteht eine Imbalance zwischen dem Auftreten von freien Radikalen und den antioxidativen, antiradikalischen Schutzmaßnahmen.

Diesen Zustand nennt man „oxidativen Stress“ (VIGUIE et al., 1993; HALLIWELL, 1997;

OHLENSCHLÄGER, 2000). Neben dem Begriff oxidativer Stress wurden für spezifische Forschungsgebiete auch Begriffe wie „diätetischer oxidativer Stress“ (BECK und LEVANDER, 1998; LEVANDER, 2000), „postprandialer oxidativer Stress“ (URSINI und SEVANIAN, 2002), „Trainings-induzierter oxidativer Stress“ oder „reduktiver Stress“

geprägt (SEIS, 2000). Der Begriff „nitrosativer Stress“ wurde von HAUSLADEN et al.

(1996) eingeführt.

Man unterscheidet endogene und exogene Faktoren, die diese Gleichgewichtsstörung verursachen. Endogen kann oxidativer Stress beispielsweise durch erhebliche körperliche Belastung entstehen, welche mit verstärkter Atmung und einer damit einhergehenden erhöhten Aufnahme von Sauerstoff verbunden ist. Es kommt zu einer gesteigerten Produktion von Radikalen (DAVIES et al., 1982; ALESSIO und GOLDFARB, 1988; VIGUIE et al., 1993). Während eines Entzündungsprozesses werden die Schutzzellen des Körpers durch Chemotaxis aktiviert, sofern RSS auch chemotaktisch wirken. Die aktivierten Zellen, wie z.B.

die Phagozyten, produzieren RSS (GUTTERIDGE, 1995; BABIOR, 2000). Auch kommt es im Rahmen des Alterungsprozesses zum gehäuften Auftreten von RSS im Körper, da mit steigendem Alter das antioxidative Abwehrsystem zunehmend geschwächt wird, wodurch die Bekämpfung der reaktiven Spezies ineffizient wird (BECKMAN und AMES, 1998;

HALLIWELL und GUTTERIDGE, 2000; KASAPOGLU und ÖZBEN, 2001). Über den oxidativen Status der Alterungsprozesse des Hundes liegen verschiedene Arbeiten vor (VAJDOVICH et al., 1997; WEDEKIND et al., 2002; HEATON et al., 2002b; WATERS et al., 2003). Exogene Faktoren spielen bei der Entstehung von oxidativem Stress immer eine wichtige Rolle. Darfür kann man zahlreiche Ursachen und Stoffe aufzählen, wie z.B. die steigende Umweltverschmutzung, die Abgase, Chemikalien, Toxine, Xenobiotica u.a. Es gibt auch andere Quellen, wie zahlreiche Medikamente, z.B. entstehen bei der Verstoffwechsel des Antibiotikums Ciprofloxacin in den Lebermikrosomen reaktive Spezies (GÜRBAY et al.,

(19)

11

2001). Auch das Immunsuppressivum Cyclosporin A oder Carprofen und Meloxicam führen zu einem erhöhten Anfall von RSS in Leberzellen (WOLF et al., 1997; NAKAGAWA et al., 2005). Nachweislich eine weitere wichtige Quelle, die öfter übersehen wird, ist der RSS- Inhalt in der Nahrung (KANAZAWA et al., 1985; OARADA et al., 1986; BECK und LEVANDER, 1998; LEVANDER, 2000).

2.3.1 Oxidativer Stress und Lipidstruktur, Lipidperoxidation

Lipidperoxidation ist ein allgemeiner Mechanismus, wobei im lebenden aeroben Organismus durch RSS Gewebe-Schäden verursacht werden (FRAGA und TAPPEL, 1988). Sie ist bei der Pathogenese verschiedener Krankheiten beteiligt (SIEMS et al., 1997). Die biologische LPO- Reaktionsfolge ist eine Kettenreaktion, deren wichtigste Reaktionsstufen in Tabelle 5 beschrieben werden. Dabei werden viele Reaktions-Zyklen bei nur einmaliger Energieeinspeisung am Anfang des Prozesses durchlaufen, d.h. es handelt sich um eine höchst wirkungvolle Produktion von radikaltragenden Lipidverbindungen. Im Einzelnen wird nach Entstehung eines Lipidkettenradikales aus einer Polyenfettsäure nach Einwirkung von OH Sauerstoff angelagert und es entsteht ein Lipoperoxiradikal (Initiation). Dieses kann seinerseits ein neues Kettenradikal verursachen, das mit der nächstliegenden Fettsäure reagiert und/oder selbst zum Lipidhydroperoxid mit hoher Reaktivität umgeformt werden (Peroxidationskaskade). Der Prozess kann durch Neutralisation zweier Kettenradikale oder durch Einwirkung eines Antioxidans gestoppt werden (Termination) (HALLIWELL und GUTTERIDGE, 1984; 1990). Die Kettenreaktion wird bevorzugt initiiert und läuft dann bevorzugt ab in Lipiden mit hohem Anteil an Polyenfettsäuren (z.B. Arachidonsäure u.a.), weil die Abspaltung von Wasserstoff aus den zwischen den Doppelbindungen gelegenen CH2- Gruppen mit nur geringem Energieeintrag gelingt. Neben der Gesamtzahl bestimmen auch die Position der Doppelbindungen sowie die Fettsäurenkettenlänge das Ausmaß der LPO (FRANKEL, 1984; HALLIWELL und CHIRICO, 1993).

(20)

12

Tabelle 5: Lipidperoxidation am Beispiel ungesättigter Fettsäuren

1- Kettenstart (Initiation): RH + OH· → R·+ H2O

2- Kettenreaktion (Propagation): R·+ O2 → ROO·

ROO· + RH → R·+ ROOH

3- Kettenabbruch (Termination):

Rekombination: R· + R·→ R – R

Antioxidantien: 2GSH + 2 R·→ GSSG + RH

RH: ungesättigte Fettsäure, GSH: Glutathion (antioxidant) R·: Fettsäureradikal, ROO·: Lipidperoxiradikal

Durch die bei der Kettenreaktion in Zellmembranen angehäuften Lipidperoxide werden die Struktur sowie die Membranfluidität, Permeabilität und Funktion von Membranen beeinflusst, wodurch die Kommunikation mit anderen Zellen, z.B. die mit dem zellulären Immunsystem, erschwert und die Expression von Rezeptoren und Membranantigenen behindert wird. Dies kann zur Störung der normalen Zellfunktionen bis hin zum Verlust der strukturellen Integrität der Zelle führen (JESBERGER und RICHARDSON, 1991; PHILLIS, 1994; BONGARZONE et al., 1995; JAESCHKE, 1995).

2.3.1.1 Oxidationsprodukte von Lipiden und Lipoproteinen

Im Rahmen der LPO entstehen durch Peroxidation ungesättigter Fettsäuren so genannte

„Lipidperoxidationsprodukte“ (WONG et al., 1987; CONTI et al., 1991; GUTTERIDGE, 1995), welche weitere reaktive Eigenschaften wie biochemische und toxische Effekte, besitzen und die Molekülstruktur von Proteinen, Enzymen, DNA und Ribonukleinsäure schädigen können (MUKAI und GOLDSTEIN, 1976; CONTI et al., 1991; GUTTERIDGE, 1995). Die LPO schließt mehrfach ungesättigte Fettsäuren und andere Bestandteile der Zellmembranen, wie Phosholipide, Glykolipide ein, die mit freien Radikalen reagieren, wodurch nach der Peroxidbildung sogenannte Sekundärprodukte wie Alkohole, Aldehyde (MDA, Hydroxynonenal), Hydroxifettsäuren, Ethane, Pentane und andere niedermolekulare Stoffe entstehen (HALLIWELL und GUTTERIDGE, 1984; 2000). In der Tabelle 6 werden die Lipidperoxidationsprodukte nach ESTERBAUER (1982) zusammengefasst. Quantitativ

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und hinsichtlich der möglichen Zellschädigung sind MDA, Hydroxynonenal, Hexanal und Propanal am bedeutsamsten (ESTERBAUER et al., 1992; HALLIWELL und GUTTERIDGE, 2000). Neben den sekundären besitzen tertiäre Metabolite wie DNA-Addukte (Ethenodexyadenosin, Ethenodeoxycytidin, MDA-Deoxyguanosin) physiologische Relevanz, aus diesen entstehen teilweise durch β-Spaltung des Karbon-Gerüstes und weitere Umbauprozesse wiederum Aldehyde.

Tabelle 6: Lipidperoxidationsprodukte (nach ESTERBAUER, 1982)

• Malondialdehyd

• Alkanale (z.B. Pentanal, Hexanal, Heptanal, Oktanal u.a.)

• Alkenale (z.B. 2-Propenal, 2-Butenal, 2Pentenal, 2-Hexenal, 2-Heptenal, 2-Oktenal)

• Ketone (z.B. Butanon, 2-pentanon, 3-pentanon, 2- oktanon u.a.)

• 2,4-Alkadienale (z.B. Heptadienal, Nonadienal, Decadienal u.a.)

• 4,5-Dihydroxydekanal, 4-Hydroxy-2,5-Nonadienal, 5-Hydroxyoktanal

• 4-Hydroxy-2-Alkenale (z.B. 4-Hydroxy-2-Nonenal, 4-Hydroxy-2-Octenal)

Malondialdehyd entsteht zu einem großen Teil bei der Peroxidation mehrfach ungesättigter Fettsäuren mit mehr als zwei Doppelbindungen wie Linol-, Arachidon- und Docosahexaensäure. Malondialdehyd geht als Ergebnis von Membranschädigungen auch ins Blutplasma über und kann dort gemessen werden (POLI et al., 1985; VALENZUELA, 1991).

Unabhängig von der LPO kann MDA jedoch auch enzymatisch während der Eicosanoidsynthese in Zellen gebildet werden (POLI et al., 1985; VALENZUELA, 1991).

4-Hydroxy-2-Nonenal, ein weiteres ungesättigtes Aldehyd, wird während der Peroxidation der n-6 Fettsäuren (z.B. Linolsäure und Arachidonsäure) durch Teilung von Lipidhydroperoxiden unter Anwesenheit von Übergangsmetallen erzeugt (POLI et al., 1985;

STOHS und BAGCHI, 1995). Andere bedeutende sekundäre Produkte der LPO sind die Isoprostane, eine Klasse toxischer Lipidperoxidationsprodukte, die Ähnlichkeit zu den Prostaglandinen aufweisen. Sie werden bei der Peroxidation der Arachidonsäure, aber auch der Eicosapentaen- und Docosahexaensäure gebildet. Aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit mit Prostaglandin F werden sie als F2-Isoprostane bezeichnet (HALLIWELL und CHIRICO, 1993; HALLIWELL und GUTTERIDGE, 2000).

Lipidperoxidationsprodukte wie Aldehyde und die Addukte aus den reaktiven Aldehyden (z.B. MDA) mit der DNA, wie z.B. Ethenodexyadenosin, Ethenodeoxycytidin, MDA-

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Deoxyguanosin, besitzen erbgutschädigende und kanzerogene Eigenschaften (PLACER et al., 1966; MUKAI und GOLDSTEIN, 1976; PORTER, 1984; NIKI, 1987; VACA et al., 1988;

KALENDER et al., 2002).

Neben dem körpereigenen Metabolismus ist auch die Nahrung eine Quelle für Lipidperoxidationsprodukte (SUAREZ et al., 1996). Aus Humanstudien ist bekannt, dass Lipidperoxidationsprodukte über das Intestinum absorbiert und in Lipoproteine eingebaut werden (URSINI et al., 1998; STAPRÄNS et al., 1999). Bislang ist noch nicht eindeutig geklärt, welche und in welchem Umfang zelluläre Abwehrmechanismen durch die Absorption von Lipidperoxidationsprodukten aktiviert werden.

Bereits eine hohe Zufuhr an Nahrungsfetten ist mit einer erhöhten oxidativen Belastung assoziiert (METE et al., 1999; YUAN und KITTS, 2003). Mehrfach ungesättigte Fettsäuren erhöhen im Vergleich zu einfach ungesättigten Fettsäuren den plasmatischen MDA-Gehalt deutlich (FANG et al., 1996). Bei Aufnahme von mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit der Nahrung werden in Untersuchungen bei Versuchstieren und Menschen auch vermehrt DNA- Addukte (CHUNG et al., 1996; NAIR et al., 1997; LOFT et al., 1998) und DNA-Schädigung von Geweben (De KOK et al., 1994) festgestellt. Für den Menschen geht man jedoch davon aus, dass nur eine längerfristige Verabreichung hoher Fettmengen das Krebsrisiko deutlich steigert (NAIR et al., 1997; LOFT et al., 1998).

2.3.2 Oxidativer Stress und Proteinstruktur

Die Oxidation von Proteinen ist vor allem mit der Schädigung von Enzymen, Signalmolekülen oder Rezeptoren verknüpft, die zur Funktionseinbuße von Zellen und Organen beitragen (BERLETT und STADTMAN, 1997). Reaktive-Spezies können die Membranproteine angreifen, die Membranrezeptoren deaktivieren und die Membran-Enzyme somit behindern (DEAN et al., 1986; BERLETT und STADTMAN, 1997).

Modifikationen von Aminosäuren durch oxidativen Stress führen zu Veränderungen von Proteinstruktur und Proteinfaltung (BERLETT und STADTMAN, 1997). Dadurch kann es zu Proteinfragmentation und Aggregation von Proteinen kommen (JESBERGER und RICHARDSON, 1991; BONGARZONE et al., 1995). Die Empfindlichkeit der Proteine gegenüber oxidativem Stress hängt im Wesentlichen von ihrer Aminosäurezusammensetzung

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ab. Insbesondere die aromatischen Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin sind aufgrund ihrer mehrfach ungesättigten Strukturen besonders sensitiv für RSS-Angriffe. Auch Sulfhydrylgruppen-enthaltende Aminosäuren wie Methionin und Cystein sind ein Hauptangriffspunkt (BOURDON et al., 1999). In Bezug auf die durch die Schädigung ausgelöste funktionelle Beeinträchtigung spielt auch der Ort der oxidativen Veränderung am Protein, eine ausschlaggebende Rolle (AKHLAQ et al., 1987).

Im Enzym Glyceraldehyde-3-Phosphat-Dehydrogenase, zum Beispiel, führt die Oxidation der Gruppen des Cysteins durch RSS OH• und ONOO¯• zu einer Inaktivierung dieses Enzyms, was eine Beeinträchtigung der Glykolyse in den betroffenen Zellen zur Folge hat (SOUZA und RADI, 1998, STADTMANN und LEVINE, 2003). NO• und ONOO¯• nitrieren Tyrosinreste, wodurch z.B. Signaltransduktionsmechanismen unterbrochen werden (GOW et al., 1996; Di STASI et al., 1999).

Mit mehreren sensitiven Methoden (z.B. HPLC, Gelelektrophorese und spektrophotometrische Bestimmung) der Carbonylgruppen-Bestimmung lässt sich die oxidative Schädigung von Proteinen abschätzen. Carbonyle entstehen bei der Reaktion der Proteine mit Aldehyden (z.B. MDA, Hydoxynonenal), sodass ein erhöhter Gehalt an Carbonylen auf eine oxidative Schädigung von Proteinen hinweist (REZNICK und PACKER, 1994; BERLETT und STADTMAN, 1997; MASSY und NGUYEN-KHOA, 2002; DALLE- DONNE et al., 2003).

Oxidierte Proteine werden beim Menschen mit einer Vielzahl von Krankheiten assoziert, einschließlich amyotropher Lateralsklerose, Alzheimer Krankheit, Atemnotsyndrom, muskulärer Dystrophie, Katarakt, rheumatischer Arthritis und frühzeitiges Altern (Progeria, Werner-Syndrom) (OLIVER et al., 1987; BERLETT und STADTMAN, 1997). Obwohl die Konzentration der Carbonyle nicht direkt bestimmt wurde, wird angenommen, dass eine oxidative Modifizierung von Proteinen beim Menschen außerdem im Zusammenhang steht mit Atherosklerose, Diabetes, Parkinson-Krankheit, essentiellem Bluthochdruck, zystischer Fibrose und eitriger Dickdarmentzündung (BERLETT und STADTMAN, 1997).

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16 2.3.3 Oxidativer Stress und Nukleinsäuren

Zahlreiche Autoren beschreiben, dass RSS eine wichtige Rolle bei der Entstehung von DNA- Schäden spielen (HALLIWELL und ARUOMA, 1991; COCHRANE, 1991; DUTHIE und COLLINS, 1997; De BOER und HOEIJMAKERS, 2000; ARIMOTO-KOBAYASHI et al., 2002). Bereits HALLIWELL und DIZDAROGLU (1992) schrieben, dass mehr als 100 unterschiedliche, durch RSS indizierte Schäden wurden an DNA bekannt sind. Die Oxidation der DNA kann theoretisch durch verschiedene Mechanismen gefördert werden: vermehrte Bildung von RSS und verminderte antioxidative Abwehr oder Hemmung der Mechanismen, die beschädigte und/oder veränderte DNA-Abschnitte reparieren oder ersetzen (DOUKI und CADET, 1999; De BOER und HOEIJMAKERS, 2000; BALAJEE und BOHR, 2000;

WILLIAMS und JEFFREY, 2000).

Oxidative Modifikationen der DNA bestehen vor allem aus DNA-Basen und es gibt verschiedene Oxidationsprodukte aus allen DNA-Basen. Die Pyrimidine der DNA können in ihrem Ring gesättigt oder exozyklisch modifiziert, fragmentiert und kontrahiert werden (HALLIWELL und AROUMA, 1991). Purine bilden nach radikalischem Angriff Produkte wie 2,6-Diamino-4-Hydroxy-5-Formamido-Pyrimidin, Hypoxanthin und 8-Oxo-Guanin. Das Guanin besitzt das niedrigste Oxidationspotential aller DNA-Basen, dennoch kommt die Messung der 8-Oxoguanin-Modifikation am häufigsten vor (HALLIWELL und AROUMA, 1991). Daher kann es gut als Marker für die Erkennung von oxidativem Stress in der Zelle genutzt werden (BESSHO et al., 1993; MAYNE, 2003; MACPHERSON et al., 2005).

Durch RSS-Schäden können auch basenfreie Stellen (so genannte AP-Läsionen [AP = apurinische oder apyrimidinische Stellen]) entstehen, die bei der Hydrolyse der N- glykosidischen Bindung zwischen Base und Deoxyribose gebildet werden (O`HUIGIN et al., 1987). Neben den Basen sind auch die Zuckerreste der Nukleinsäuren von RSS-Schäden betroffen (KUCHINO et al., 1987; BOHR, 1995; CHENG et al., 1992). Infolge oxidativer Schäden treten gehäuft Crosslinks, Einzelstrangbrüche und/oder Doppelstrangbrüche auf (HALLIWELL und AROUMA, 1991; DIZDAROGLU, 1991).

Mitochondriale DNA unterliegt weitaus stärkerer oxidativer Belastung als die nukleäre DNA.

Im Tiermodell wurde eine bis zu 10-fach höhere Konzentration oxidierter Nukleotide, wie

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Deoxyguanosin, in mitochondrialer gegenüber nuklearer DNA gefunden (BECKMANN und AMES, 1998).

Malondialdehyd geht kovalente Verbindungen mit den Basen der DNA ein und deren Reaktions-Addukte können auch fern vom Ort ihrer Entstehung toxisch wirken, indem sie die Molekularstruktur von Ribonukleinsäure und DNA schädigen (NATH et al., 1996; MAO et al., 1999). Die bei der Metabolisierung von Lipidperoxidationsprodukten, wie Lipidperoxyl- Radikal, Alkoxyl-Radikal, Okzo-Aldehyde, Akrolein und Kroton-Aldehyd entstehende Epoxide (OAKLEY et al., 1996) wirken auf DNA und dadurch entstehen exozyklische DNA- Addukte (NATH et al., 1996).

Die durch RSS hervorgerufenen Schäden an DNA können enzymatische Reaktionen, Signaltransduktions-Mechanismen und die Genexpression innerhalb einer Zelle oder eines Zellverbandes verändern und den programmierten Zelltod induzieren (BREDESEN, 1995). In verschiedenen Zellkultursystemen lösten z.B. niedrige Konzentrationen von H2O2 Apoptose aus, während hohe Konzentrationen in der Regel Nekrose induzierten (BREDESEN, 1995).

Mutationen durch über einen langen Zeitraum bestehende oxidative DNA-Schäden werden als wichtige Ursache der im Alter gehäuft auftretenden Tumorerkrankungen und degenerativen Prozesse angesehen (SEIS, 1986; EPE et al., 1988; DIZDAROGLU, 1991; CHENG et al., 1992; AMES et al., 1993; SHIGENAGA et al., 1994; BOHR, 1995).

2.3.4 Oxidativer Stress und Leber

Die wenigen klinischen Studien, in denen beim leberkranken Hund Messgrößen des oxidativen Stresses untersucht wurden, beschränkten sich vorwiegend auf die antioxidative Abwehr und kamen diesbezüglich teilweise zu unterschiedlichen Resultaten. So lagen in einer Studie die Superoxidanion neutralisierenden Eigenschaften und SOD-Konzentration im Plasma bei Hunden mit Leberkrankheiten, wie auch Tumoren und Entzündungen sonstiger Weichteile höher als bei gesunden Hunden, was mit einer Aktivierung bzw. erhöhten Produktion der antioxidativen enzymatischen Abwehr bei Erkrankungen erklärt wurde (SATO et al., 2003). In einer weiteren Studie wurden 63 Hunde mit verschiedenen Hepatopathien wie z.B. nekrotischer Hepatitis, extrahepatischer Gallengang-Obstruktion, vakuolärer Hepatopathie und portosystemischem Shunt untersucht und im Vergleich zu gesunden

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Hunden unter anderem verminderte Gewebe-Konzentrationen von Glutathion und ein verminderter Anteil an reduziertem Glutathion im Vergleich zu Glutathion-Disulfid gemessen (CENTER et al., 2002). In einer weiteren Studie wurde bei Dobermann-Hunden mit Kupfer- assoziierter subklinischer Hepatitis, chronischer Hepatitis mit hoher hepatischer Kupferkonzentration wie auch nicht-Kupfer-assoziierter subklinischer Hepatitis im Vergleich zur gesunden Kontrolle die Expression von Genen, die in die Produktion von Proteinen des Kupferstoffwechsels oder oxidativen Stress involviert sind, untersucht. Hierbei zeigte sich bei den Hunden mit Hepatitis zwar ebenfalls eine verminderte Glutathion-Konzentration, jedoch lag bei den zwei Hundegruppen mit Kupfer-assoziierter Hepatitis, wo eine erhöhte Kupfer- Konzentration der Leber zur vermehrten RSS-Entstehung führt, neben einer verminderten Expression von Kupfer-Bindeproteinen wie Ceruloplasmin und Metallothionein eine deutlich reduzierte Genexpression der antioxidativen Enzyme SOD und Katalase vor (SPEE et al., 2005).

Weiterhin wurden einzelne experimentelle Studien zum oxidativen Stress an der caninen Leber im Rahmen von Reperfusions-Modellen nach induzierter Ischämie unternommen (SAKATA et al., 2000; MIRANDA et al., 2007), um anhand des MDA-Spiegels und der Enzymkonzentration des Lebergewebes verschiedene Regime zu vergleichen (MIRANDA et al., 2007) oder den zytoprotektiven Einfluss von Adenosin zu überprüfen (SAKATA et al., 2000). Dabei konnte durch Adenosininfusion in die Pfortader die Bildung von Proteincarbonylen und die Verminderung von Glutathion im Lebergewebe reduziert werden, wie auch die histologisch nachweisbare Neutrophileninfiltration, Superoxidentstehung und Apoptose (SAKATA et al., 2000).

Auch aus verschiedenen klinischen Arbeiten beim Menschen wird der vermehrte oxidative Stress bei verschiedenen Lebererkrankungen deutlich. Diese Untersuchungen basierten oft auch auf der Lipidperoxidation. Eine besonders ausgeprägte Lipidperoxidation wurde im Gewebe beim hepatozellulären Karzinom gefunden, wo die MDA-Konzentration die Werte von zirrhotischen Lebern (LIU et al., 2003; CZECZOT et al., 2006) und gesundem Lebergewebe (CZECZOT et al., 2006) deutlich überstieg. Die Konzentrationen von MDA und Hydroxynonenal in den Leberbioptaten von Menschen mit Hepatitis C und assoziierter Fibrose korrelierten mit dem histopathologischen Grad der Aktivität und dem Fibrosegrad, so dass die Autoren der LPO eine Beteiligung bei der Pathogenese der Entzündungsreaktion

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beigemessen haben (PARADIS et al., 1997). Glutathion lag im karzinomatös veränderten Lebergewebe niedriger als bei der unveränderten, jedoch höher als bei der zirrhotisch veränderten Leber (CZECZOT et al., 2006), während die Glutathion-Transferase höher als bei der unveränderten (CZECZOT et al., 2006), jedoch niedriger als bei der zirrhotisch veränderten Leber war (LIU et al., 2003; CZECZOT et al., 2006). Weitere Messgrößen des Glutathion-Antioxidans-Systems wie Glutathion-Peroxidase (Selen-abhängig und - unabhängig) und Glutathion-Reduktase wiesen im Gewebe des hepatozellulären Karzinoms die niedrigsten Werte auf (CZECZOT et al., 2006). Auch die von LIU et al. (2003) im Karzinomgewebe gemessene totale AOK lag niedriger als im zirrhotisch veränderten Gewebe.

Daher wird auf eine Relevanz des Ungleichgewichtes des Glutathion-Antioxidans-Systems bei der Ausbildung von Leberkrankheiten geschlossen (CZECZOT et al., 2006), wobei aber nicht sicher festzustellen ist, ob diese Ursache oder Folge der Lebererkrankung ist.

Im Blutplasma wird bei Lebererkrankungen übereinstimmend ein erhöhter MDA-Spiegel gemessen, z.B. bei Kindern mit Wilson-Krankheit, wo durch vermehrte Kupferspeicherung eine erhöhte RSS-Bildung zu erwarten ist, und sonstigen chronischen Lebererkrankungen (DALGIC et al., 2005), Kindern mit Hepatitis A (CEMEK et al., 2006), bei Menschen mit Zirrhose (ABOUTWERAT et al., 2003; OSMAN et al., 2007; BHANDARI et al., 2008), chronischer Hepatitis und hepatozellulärem Karzinom (OSMAN et al., 2007). 8-Isoprostan, als weiteres Produkt der Lipidperoxidation wurde in verminderter Konzentration im Blut und Urin von Patienten mit primärer biliärer Zirrhose nachgewiesen (ABOUTWERAT et al., 2003). Auch Stickstoffmonoxid als freies Radikal wurde in erhöhter Konzentration im Blut von Menschen mit chronischer Hepatitis, Zirrhose und hepatozellulärem Karzinom (OSMAN et al., 2007) wie auch Kindern mit Wilson-Krankheit und sonstigen chronischen Lebererkrankungen gemessen (DALGIC et al., 2005). Bei Menschen mit chronischen Leberentzündungen (Hepatitis B und C mit und ohne Zirrhose) ließen sich erhöhte oxidative DNA-Schäden an Blutlymphozyten feststellen, die eine positive Korrelation (r=0,710) mit dem histopathologischen Schweregrad zeigten, so dass auch hier eine direkte Assoziation zwischen der Leberkrankheit und dem oxidativen Stress sichtbar wurde (BÖLÜKBAS et al., 2006).

Interessanterweise zeigten sich für die Antioxidantien auch beim Menschen mit Lebererkrankungen unterschiedliche Ergebnisse. Allerdings fanden nur DALGIC et al. (2005)

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bei Kindern mit Wilson-Krankheit und sonstigen chronischen Lebererkrankungen im Vergleich zur gesunden Vergleichsgruppe keine deutlichen Unterschiede für ß-Karotin, Vitamin C und E und die totale AOK. Ansonsten wurden in der zugänglichen Literatur verminderte Blutkonzentrationen der Substanzen der antioxidativen Abwehr gefunden. Dies betraf zum Beispiel verschiedene Antioxidantien wie Katalase- und SOD-Konzentrationen der Erythrozyten und Glutathion-Konzentration sowie die AOK bei der Zirrhose (ABOUTWERAT et al., 2003; BHANDARI et al., 2008). Die Ergebnisse decken sich mit den Ergebnissen von OSMAN et al. (2007), die bei der Zirrhose als auch bei chronischer Hepatitis und hepatozellulärem Karzinom im Vergleich zur gesunden Kontrolle deutlich verminderte Blutspiegel von SOD, Glutathion-Peroxidase, reduziertem Glutathion und Glutathion sowie Albumin fanden. Auch bei Kindern mit Hepatitis A zeigten sich verminderte Konzentrationen aller gemessenen Antioxidantien (Glutathion, ß-Karotin, Vitamine A, C und E) (CEMEK et al., 2006). Schließlich zeigte sich bei Patienten mit Fettleber verminderte SOD-, Katalase- und Glutathion-Konzentrationen (SARICAM et al., 2005).

Zahlreiche Studien befassten sich mit oxidativem Stress in der Leber basierend auf Rattenmodellen und Zellkulturen. Nach experimentell induzierter Cholestase zeigten sich erhöhte Konzentrationen von Lipidperoxiden, TBARS und Dien-Konjugaten im Leber- und Nierengewebe, während im Herz nur die Lipidperoxide und TBARS und im Gehirn ausschließlich die TBARS erhöht waren (LJUBUNCIC et al., 2000). Analog zeigten sich die Konzentration an reduziertem Glutathion und Glutathion bei cholestatischem Lebergewebe vermindert. Auch in Ischämie/Reperfusions-Modellen der Leber zeigte sich anhand vielfältiger Messgrößen im Lebergewebe wie erhöhter Xanthinoxidase-Aktivität (AJAMIEH et al., 2002; MUN et al., 2003), vermehrten Hydroxyalkenalen (AJAMIEH et al., 2002) sowie erhöhten Konzentrationen von Hydrogen-Peroxid und Superoxid (MUN et al., 2003) ein vermehrter oxidativer Stress, allerdings war die MDA-Konzentration nur bei AJAMIEH et al.

(2002) erhöht, während sie in der Untersuchung von MUN et al. (2003) unverändert war.

Schließlich zeigten sich am 3. und 7. Tag nach CCl4-induzierten akuten Leber-Schäden im Vergleich zur Kontrolle erhöhte Plasma- und Leber-MDA-Konzentrationen und eine verminderte Glutathion-Konzentration im Lebergewebe, wobei die Effekte durch die Substanz Genistein gemildert werden konnten (KUZU et al., 2007).

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Die Rolle des oxidativen Stresses und der mitochondrialen Dysfunktion der Leberzellen bei der nicht-alkoholischen Fettleber der Ratten wurde von OLIVEIRA et al. (2006) untersucht.

Signifikant erhöhte TBARS-Konzentrationen und verminderte Glutathion-Konzentrationen im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigten sich bei der durch Cholindiätfütterung induzierten Fettleber, nicht jedoch unter einer Fettdiät. Die Rolle verschiedener reaktiver Substanzen (Hydroperoxid, BrCCl3 und Eisen) im Hinblick auf die Induktion von oxidativem Stress wurde durch deren Zugabe zu kultivierten Rattenleberzellen untersucht (FRAGA und TAPPEL, 1988). Hydroperoxid induzierte die höchsten TBARS-Konzentrationen und DNA- Schäden im Ethidiumbromid-Fluoreszenztest, auch Eisen erhöhte die Schäden an DNA und Lipiden, während BrCCl3 eine geringere TBARS-Produktion induzierte, ohne signifikante DNA-Schäden auszulösen.

Die Mechanismen der Entstehung des oxidativen Stresses im Lebergewebe und der Leberschädigung sind vielfälltig (JAESCHKE et al., 2002). Als ein wichtiger Mechanismus wird angeführt, dass im mikrosomalen Oxidationssystem Zytochrom P450 bei der Metabolisierung von Medikamenten, Narkosemitteln oder der Entgiftung von endogenen und exogenen Toxinen RSS-Bildung induziert wird (BAST et al., 1983; McCORD, 1993;

LEMASTER et al., 1998; KNIGHT et al., 2001; JAESCHKE et al., 2002; KUZU et al., 2007;

DANG et al., 2008; IWATA et al., 2008).

Eine weitere wichtige Quelle für RSS einschließlich reaktiver Stickstoff-Spezies sind körpereigene Entzündungszellen wie Kupfferzellen und Neutrophile, die durch chemotaktische Faktoren der Kupfferzellen angelockt werden (LIU et al., 1995: KNIGHT et al., 2001; JAESCHKE et al., 2002; SENTÜRK, 2004; BÖLÜKBAS et al., 2006). Dies ist ein sich selbst unterhaltender und verstärkender Prozess, da die erhöhte RSS-Bildung die Kupfferzelle zur Produktion von Tumornekrosefaktor-α anregt, wodurch wiederum vermehrt RSS gebildet werden (LEMASTER et al., 1998; JAESCHKE et al., 2002; SENTÜRK, 2004).

Begünstigend für die Einwanderung von Neutrophilen wirkt sich aus, dass das u.a. nach Einwirkung von Tumornekrosefaktor-α durch die Endothelzellen der Lebersinusoide vermehrt exprimierte interzelluläre Adhäsionsmolekül zur verstärkten Anheftung von Neutrophilen und schließlich deren Transmigration ins Gewebe führt (JAESCHKE et al., 2002; SENTÜRK, 2004; YOKOMORI et al., 2005). Die Entzündungzellen produzieren unter dem oxidativen Stress neben Tumornekrosefaktor-α auch vermehrt toxisches Stickstoffmonoxid zur

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Eliminierung von Bakterien, wobei eine weitere wichtige Quelle für Stickstoffmonoxid, das vasodilatatorisch wirkt, auch die Endothelzelle darstellt (KNIGHT et al., 2001). Die dadurch vermehrt anfallenden Peroxinitrite können nicht mehr entgiftet werden, so dass „nitrosativer Stress“ entsteht und weitläufigere LPO verursacht (Di STASI et al., 1999; DALGIC et al., 2005; OSMAN et al., 2007). Die während der β-Oxidation in den Mitochondrien der Hepatozyten entstehenden RSS werden bei Permeabilitätserhöhungen der Mitochondrien in das fettsäurereiche Zytosol frei, wodurch im Rahmen einer Kettenreaktion reaktive und langlebige Lipidperoxide entstehen (SENTÜRK, 2004), die verschiedene Zellkomponenten angreifen. Membranpermeabilitäts-Erhöhungen der Mitochondrien (Permeabilitätstransition) werden ihrerseits neben Ischämie u.a. durch oxidativen Stress und Bindung des Tumornekrosefaktors-α an seinen Rezeptor auf der Hepatozytenoberfläche ausgelöst (LEMASTER et al., 1998; PESSAYRE et al., 1999). Letzteres aktiviert das Kaspasesystem, wodurch es schließlich zur Apoptose der Hepatozyten kommt (PESSAYRE et al., 1999).

Wenn RSS eine hohe Reaktivität aufweisen und starke Schäden induzieren, kommt es direkt zur Zellnekrose, wobei das Kaspasesystem des Apoptose-Weges übersprungen wird (JAESCHKE et al., 2002; SENTÜRK, 2004). Eine mitochondriale Dysfunktion besitzt auch erhebliche Relevanz bei der Entstehung der Fettleber (FROMENTY und PESSAYRE, 1995;

SENTÜRK, 2004; OLIVEIRA et al., 2006). Ein weiterer pathogenetischer Aspekt ist, dass RSS und Lipidperoxidationsprodukte Stellatzellen aktivieren, die in der Leber Fibrose auslösen (FROMENTY et al., 2004).

2.4 Oxidativer Stress bei sonstigen Organerkrankungen und Stoffwechselzuständen

Bei verschiedenen spontanen Erkrankungen oder besonderen Reaktionszuständen wurde in Originalstudien beim Hund überwiegend eine oxidative Stressbelastung anhand erhöhter RSS- Aktivität und/oder Schäden an Lipiden, Proteinen und DNA und/oder – abgesehen von Tumoren – einer verminderter Konzentration antioxidativer Substanzen in Blut oder anderen Geweben nachgewiesen. Entsprechende Untersuchungsergebnisse liegen vor für verschiedene Tumoren, insbesondere Lymphome (SATO et al., 2003; WINTER et al., 2009) und Mammatumoren (SATO et al., 2003; SZCZUBIAL et al., 2004; KUMARAGURUPARAN et al., 2005), Herzerkrankungen wie dilatative Kardiomyopathie (FREEMAN et al., 1999; 2005;

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HETYEY et al., 2007) und Mitralklappenendokardiose (HETYEY et al., 2007), Niereninsuffizienz (KARGIN und FIDANCI, 2001; BURANAKARL et al., 2008), Diabetes mellitus (CHANSAISAKORN et al., 2009), immunvermittelte Anämie (PESILLO et al., 2004), Peridontitis (PAVLICA et al., 2004), Katarakt (BARROS et al., 1999) und Infektionsrekrankungen wie Leishmaniose (BILDIK et al., 2004), Hepatozoonose (KIRAL et al., 2005), Parvovirusenteritis (PANDA et al., 2009) und Sarkoptes-Räude (CAMKERTEN et al., 2009).

Während im Mammatumorgewebe eine signifikante Zunahme der Lipidhydroperoxid-, Dien- Konjugate- und TBARS-Konzentration gemessen wurde (KUMARAGURUPARAN et al., 2005), sind die Ergebnisse zu den Veränderungen im Blut uneinheitlich. In einer weiteren Studie zu Hunden mit Mammakarzinom war kein Unterschied für die Konzentrationen der TBARS und SH-Gruppen zwischen gesunden Hunden und Hunden mit benignen oder malignen Mammatumoren festzustellen (SZCZUBIAL et al., 2004); auch bei Lymphomen wurde kein erhöhter MDA-Spiegel gefunden, jedoch vermehrt Isoprostane (WINTER et al., 2009), was zu dem vermehrten Gehalt an Superoxid im Blut tumoröser Hunde wie in Gruppen mit Entzündungen passt (SATO et al., 2003). Interessanterweise zeigen die Studien verschiedener Autoren übereinstimmend im Tumorgewebe im Vergleich zum normalen Mammagewebe und im Blutplasma erhöhte antioxidativen Aktivitäten an, z.B. von SOD, Katalase, Glutathion-Peroxidase und Glutathion (KUMARAGURUPARAN et al., 2005) oder eine höhere Konzentration an SOD im Blutplasma bei Hunden mit Tumoren und eine erhöhte Glutathion-Peroxidase bei Tieren mit malignen Tumoren als die Kontrollgruppe (SZCZUBIAL et al., 2004). Hier spiegelt sich eine Überexpression von Antioxidantien durch Tumorzellen wider, die möglicherweise die Tumorzellen resistent gegen Angriffe zytotoxischer T-Zellen macht (KUMARAGURAPARAN et al., 2002; 2005).

Eine erhöhte Plasmakonzentration von MDA bei Hunden mit dilatativer Kardiomyopathie (FREEMAN et al., 1999) konnte in einer aktuellen Studie bei Hunden mit kongestivem Herzversagen durch dilatative Kardiomyopathie oder chronischen Herzklappenerkrankungen nicht bestätigt werden (FREEMAN et al., 2005). Uneinheitlich zeigten sich die Studienergebnisse auch hinsichtlich des Antioxidans Vitamin C, für das bei herzkranken Hunden verminderte (FREEMAN et al., 1999) oder sogar erhöhte Werte gemessen wurden (FREEMAN et al., 2005), während sich Glutathion und Glutathion-Peroxidase wie Vitamin E

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vermindert sowie Vitamin A und SOD unverändert zeigten (FREEMAN et al., 1999).

Allerdings war nur die Vitamin E-Konzantration negativ mit dem Schwergrad der Krankheit korreliert (FREEMAN et al., 1999). Globale antioxidative Kapazitäten zeigten sich bei herzkranken Hunden ebenfalls uneinheitlich von unverändert (Totale antioxidative Kapazität;

HETYEY et al., 2007) bis erhöht (Sauerstoff-Radikale Absorptions-Kapazität, FREEMAN et al., 2005; Eisen-reduzierende Eigenschaft des Plasmas, HETYEY et al., 2007).

In den zwei Arbeiten zum oxidativen Stress bei Niereninsuffizienz wurden übereinstimmend erhöhte Plasma-MDA-Werte gefunden (KARGIN und FIDANCI, 2001; BURANAKARL et al., 2008) sowie auch erhöhte MDA-Werte im Urin (BURANAKARL et al., 2008).

Abgesehen von β-Karotin waren bei KARGIN und FIDANCI (2001) die antioxidativen Substanzen (Glutathion-Peroxidase, SOD, Katalase und Vitamin C) im Blut niereninsuffizienter Hunde vermindert, während BURANAKARL et al. (2008) erhöhte Glutathion- und Katalase-Werte fanden.

In einer aktuellen Studie wurde bei klinisch kranken Hunden im Vergleich zu gesunden Kontrollen eine reduzierte Konzentration des Antioxidans Glutathion in den Erythrozyten nachgewiesen sowie eine negative Korrelation zum Schweregrad der Erkrankung und der Letalität, allerdings war die Patientengruppe älter als die gesunde Kontrollgruppe (VIVIANO et al., 2009). Erstaunlicherweise wurde in dieser Studie bei klinisch kranken Katze eine erhöhte Konzentration des Antioxidans Vitamin C im Vergleich zur Kontrollgruppe gefunden.

Noch zahlreicher sind die Studien zum Hund, bei denen Messgrößen des oxidativen Stresses bei experimentell induzierten Krankheitszuständen oder isolierten caninen Organen untersucht wurden. Dies betrifft auch wieder das Herz mit experimentell induzierten Herzinsuffzienzen (GU et al., 2003; CHEN et al., 2005; ZHANG et al., 2009; u.a.), Lungenerkrankungen wie eine akute Lungenembolie und pulmonäre Hypertension (DIAS- JUNIOR et al., 2005; DIAS-JUNIOR et al., 2009), Mekoniumaspirations-Syndrom (KIRIMI et al., 2003) und die Inhalation von Allergenen (STEVENS et al., 1995), experimentell induzierte Pankreatitis (KELEMEN und TÖRÖK, 1990; SHABANOV et al., 2002), ischämische Niereninsuffizienz (KONYA et al., 1990; KONYA et al., 1991), akute bakterielle Zystitis (ALVES et al., 2004), Diabetes Mellitus (VAJDOVICH et al., 1993; AMMAR et al., 2000), Arthritis (GORANOV, 2007), Selen-induzierte DNA-Schäden an der Prostata (WATERS et al., 2003; WATERS et al., 2005; WATERS et al., 2007), Operations-Trauma

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(MUTINATI et al., 2007) und hämorrhagischer Schock (PRASAD et al., 1988; KAPOOR und PRASAD, 1995; AHUJA et al., 2001).

Am Herzen wurden die Konzentrationen von Messgrößen des oxidativen Stresses, ihre pathophysiologischen Effekte und Wirkung von Antioxidantien in vielfältigen Modellen untersucht. Dies betraf z.B. die Simulation von Herzinfarkten bzw. der Reperfusion nach Ischämie durch Coronargefäßligaturen (RÖTH et al., 1985; TÖRÖK et al., 1986; LANTOS et al., 2001) oder ein durch Herzschrittmacher ausgelöstes Tachykardie-bedingtes Herzversagen (SRIVASTAVA et al., 2002; CHEN et al., 2005; ZHANG et al., 2009). Sowohl bei ischämischen Situationen als auch bei induziertem Herzversagen zeigten sich erhöhte MDA- bzw. TBARS-Werte, erhöhte RSS-Konzentrationen und/oder verminderte Konzentrationen antioxidativer Substanzen im Gewebe und/oder Blutplasma (RÖTH et al., 1985; TÖRÖK et al., 1986; IKEDA et al., 1994; PRASAD et al., 1996; CHENG et al., 1999; LANTOS et al., 2001; SRIVASTAVA et al., 2002; GU et al., 2003; CHEN et al., 2005; ZHANG et al., 2009).

Hierbei ließ sich die antioxidative Wirkung von Vitamin E (PRASAD et al., 1996), einem Dihydroquinolintyp-Antioxidans (TÖRÖK et al., 1986), N-Acetylcystein (GU et al., 2003) und Aldose-Reduktase (SRIVASTAVA et al., 2002) nachweisen. In einer anderen Studie wurde untersucht, inwieweit sich peripheres Venenblut als Medium zur Untersuchung von Messgrößen des oxidativen Stresses im Herzen eignet. Hier zeigte sich, dass die Abnahme der stimulierten Radikalproduktion durch isolierte Neutrophile nach Reperfusion im peripheren Blut gegenüber dem Coronarblut erst verzögert sichtbar war (LANTOS et al., 2001).

In einer interessanten Studie wurde nachgewiesen, dass bronchoalveläre Lavagezellen nach Allergen-induzierter Hypersensibilisierung der Atemwege vermehrt Superoxid produzieren und freisetzen, womit Sauerstoffradikale einen wichtigen Faktor bei der Entstehung der Allergen-induzierten Hypersensibilität der Atemwege darzustellen scheinen (STEVENS et al., 1995).

Der Einfluss verschiedener Antibiotikabehandlungen (Amoxicillin, Benzylpenicillin/

Streptomycin, Sulfonamide, Enrofloxacin, Lincomycin/Spectinomycin) auf die RSS-Bildung wurde bei insgesamt 60 Hündinnen bis zum vierten Tag nach einer Ovarioektemie untersucht (MUTINATI et al., 2007), wobei für Enrofloxacin die deutlichsten Erhöhungen und für Amoxicillin und Lincomycin/Spectinomycin die geringsten Effekte nachweisbar waren. In Experimenten mit Gentamycin-assoziierter Nephrotoxizität wurde einerseits anhand von

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erhöhten MDA-Spiegeln und verminderten Plasmaspiegeln von Antioxidantien (ß-Karotin, Vitamin E, Glutathion [ERTEKIN et al., 2003] oder Gesamtserum-Antioxidantien-Aktivität [VARZI et al., 2007]) das Vorliegen von oxidativem Stress nachgewiesen. Zudem ließ sich der protektive Effekt von Antioxidantien einschließlich einer hiermit assoziierten verminderten Kreatinin-Konzentration demonstrieren (VARZI et al., 2007).

Andere Studien untersuchten Messgrößen des oxidativen Stresses in caninen Spermien in vivo (HATAMOTO et al., 2006) und in vitro (CASSANI et al., 2005). Hierbei fand sich u.a. eine negative Korrelation zwischen SOD-ähnlicher Aktivität und LPO-Aktivität in Spermatozoen (CASSANI et al., 2005). Nach Stress-imitierender Dexamathesongabe fand sich eine erhöhte TBARS-Konzentration im Seminalplasma während Vitamin E-Supplementierung hingegen die TBARS-Konzentration im Seminalplasma reduzierte (HATAMOTO et al., 2006).

Umfangreiche Studien zum oxidativen Stress wurden auch an isolierten Organen (Niere) (McANULTY und HUANG, 1996) und Hundezellkulturen durchgeführt, z.B. Pankreaszellen (SANFEY et al., 1984), Chondrozyten (SEOL et al., 2009), Retinaepithel (ZAPATA et al., 2008) und Tumorzellen (WADA et al., 2005).

In Tracheaepithelzellkulturen wurde z.B. die Superoxidbildung bei der Metabolisiserung verschiedener Xenobiotika untersucht (ROSEN et al., 1989). Der antioxidative Effekt von Vitamin E auf die durch Fe+2-Ascorbate induzierte LPO in den caninen Retinazellen zeigte eine 8-fache Verminderung der TBARS-Konzentration und entsprechend 8-fach höhere Konzentration Docosahexaen-Säure (ZAPATA et al., 2008).

In einer Studie, in der kultivierte Erythrozyten mit Babesia gibsoni infiziert wurden, zeigte sich eine signifikant höhere Superoxid-Produktion und höhere TBARS-Konzentration als bei nicht infizierten Erytrozyten (OTSUKA et al., 2001). Dies deckt sich mit Studien von MURASE et al. (1996), die canine Erythrozyten zusammen mit Babesia gibsoni kultivierten und ebenfalls einen Anstieg der MDA-Konzentration messen konnten. Weitere Experimente zum infektiös ausgelösten oxidativen Stress in der Zellkultur wurden mittels Staupeinfektion der Kultur von Oligodendrozyten (BÜRGE et al., 1989; GRIOT et al., 1990) durchgeführt.

Auch bei Hunden, die experimentell einer körperlichen Belastung ausgesetzt wurden, stiegen Marker der vermehrten Oxidation an und nahm die antioxidative Kapazität ab (MARSHALL et al., 2002). Vergleichende Untersuchungen der RSS-Messungen in Aorta und Coronarsinus

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(TRAVERSE et al., 2006) zeigten, dass der Herz- im Gegensatz zum Skelettmuskel hierzu nicht wesentlich beiträgt.

Bei trächtigen Hündinnen war im Vergleich zu nicht-tragenden Tieren eine verminderte Konzentration verschiedener Antioxidantien wie Vitamin A und E festzustellen, jedoch bestand kein Unterschied bei oxidativen Stressmarkern wie TBARS und Protein-Carbonyl (VANNUCCHI et al., 2007).

Gut untersucht ist auch die Zunahme von Indikatoren des oxidativen Stresses (z.B.

Messgrößen der Protein- und Lipidperoxidation, DNA-Schäden) und die Abnahme der AOK bei älteren Hunden im Vergleich zu jungen Hunden, die mit für die Entstehung altersbedingter Erkrankungen verantwortlich gemacht wird (VAJDOVICH et al., 1997;

KEARNS et al., 1999; SHEN et al., 2001; HEAD et al., 2002; HEATON et al., 2002a; 2002b;

WEDEKIND et al., 2002; BLOUNT et al., 2004; STOWE et al., 2006).

Die erhebliche Bedeutung, die dem oxidativen Stress in der Humanmedizin bei der Pathogenese verschiedenster Erkrankungen beigemessen wird, zeigt sich an einer im Vergleich zum Hund noch wesentlich umfangreicheren Zahl an Übersichtsarbeiten (AMES et al., 1993; STADTMAN und LEVINE, 2000; YOUNG und WOODSIDE, 2001;

CHIHUAILAF et al., 2002; KAWANISHI et al., 2002; COOKE et al., 2003; DALLE- DONNE et al., 2003; SAYRE et al., 2008) und Originalstudien. Das weite Spektrum an Erkrankungen, für die Originalstudien vorliegen, schließt die chronische Pankreatitis (VERLAAN et al., 2006), Herzerkrankungen (COLLINS et al., 1998; RIGATTIERI et al., 1999; NOJIRI et al., 2001), Lungenerkrankungen wie Asthma (ANTCZAK et al., 1997), chronisch-obstruktive Lungenerkrankungen (NOWAK et al., 1999; NADEEM et al., 2005) und akuter Lungenschädigung (KOOY et al., 1995), die Chlamydien-Infektion (BENZER und KILIC, 2006), Psoriasis (SEVERIN et al., 1998), Retinopathien (KRETZER et al., 1984) und Tumorerkrankungen (OAKLEY et al., 1996; KUMARAGURUPARAN et al., 2002; 2002a) wie das multiple Myelom (BOLAMAN et al., 2000) ein. Besondere Aufmerksamkeit wurde der Rolle des oxidativen Stresses bei der Pathogenese von chronischen und degenerativen Erkrankungen zuteil, insbesondere bei Alzheimer-Krankheit (CHIA et al., 1984; PEREZ- GARCIA et al., 2009), Atherosklerose (NYYSSÖNEN et al., 1997; URSINI et al., 1998), rheumatoiden Arthritis (RAMOS et al., 2000; HAGFORS et al., 2003; VASANTHI et al., 2004), Osteoarthritis (OSTALOWSKA et al., 2006) und dem Diabetes mellitus (NISHIGAKI

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