Referenzwerte der zytologischen Knochenmarkdiagnostik beim Hund unter besonderer Berücksichtigung der
Megakaryopoese
I N A U G U R A L – D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von Ljuba Busse aus Hildesheim
Hannover 2001
Wissenschaftliche Betreuung: Apl.-Prof. Dr. R. Mischke
1. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. R. Mischke 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. F. J. Kaup
Tag der mündlichen Prüfung: 27. November 2001
Für meine Familie
Inhaltsverzeichnis
Seite A Einleitung 11 B Literaturübersicht 12
1. Entwicklung des Knochenmarks 12 2. Anatomie des Knochenmarks 12 3. Hämatopoese 15 3.1. Regulation 15 3.2. Reifungskompartments und Regulation 19 3.3. Morphologie der Entwicklungsreihen 22 3.3.1. Erythropoese 22 3.3.2. Myelopoese 24 3.3.3. Monopoese 25 3.3.4. Megakaryopoese 26 3.3.5. Lymphopoese 26 3.3.6. Weitere Zellen 27 4. Knochenmarkpunktion beim Hund 28 4.1. Indikationen 28 4.2. Kontraindikationen und Komplikationen
der Knochenmarkpunktion 29 4.3. Punktionsstellen 30 4.4. Durchführung der Punktion 31 4.5. Anfertigung des Knochenmarkausstrichs 31 4.6. Färbung 32 5. Auswertung 34
5.1. Qualitative Prüfung des Knochenmarkausstrichs 34 5.2. Zellularität 34 5.3. Myelogramm 35 5.4. M:E-Quotient 42 5.5. Reifungsindizes 43 5.6. Beurteilung der Megakaryopoese 45 C Material, Tiere und Methoden 46
1. Material 46
1.1. Geräte und Bezugsquellen 46
1.2. Reagenzien, Verbrauchsmaterial und Bezugsquellen 46
2. Tiere 48
2.1. Altersgruppen 49 3. Methoden 49 3.1. Blutentnahme 49 3.2. Labormethoden der Blutuntersuchung 50 3.3. Gewinnung von Knochenmark und Herstellung
zytologischer Präparate 50 3.3.1. Aspiration 50 3.3.2. Ausstrichmethode 51 3.3.3. Färbung 51 3.4. Auswertung der Knochenmarkzytologie 52 3.4.1. Zellularität 52 3.4.2. Auswertungsschema der Megakaryopoese 52 3.4.3. Myelogramm 53 3.4.4. M:E-Index und Reifungsindizes 53 4. Statistische Auswertung 55 D Ergebnisse 57
1. Beurteilung der Zellularität im Knochenmarkausstrich
gesunder Hunde 57 1.1. Vergleich verschiedener Altersgruppen 57 1.2. Geschlechtseinfluss 61 1.3. Referenzwerte 61 2. Beurteilung der Megakaryopoese 62 2.1. Vergleich verschiedener Altersgruppen 62 2.2. Geschlechtseinfluss 67
2.3. Genauigkeit der Beurteilung der Megakaryopoese- aktivität in Abhängigkeit von der Zahl der untersuchten
Blickfelder 67 2.4. Einfluss des Objektträgers auf die Beurteilung der
Megakaryopoeseaktivität 69
3. Myelogramm 69
3.1. Vergleich verschiedener Altersgruppen 69
3.1.1. Erythropoese 69
3.1.2. Granulopoese 74 3.1.3. Monozyten und Makrophagen 84 3.1.4. Megakaryopoese 85 3.1.5. Lymphozyten und Plasmazellen 88 3.1.6. Mitosen 90 3.1.7. M:E-Quotient 90 3.1.8. Reifungsindizes 91 3.2. Geschlechtseinfluss 95 3.3. Referenzbereiche 97
E Diskussion 99
F Zusammenfassung 108
G Summary 110
H Literaturverzeichnis 112
I Tabellarischer Anhang 137
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen:
Abb. = Abbildung
BFU-E = burst forming unit erythrocyte BFU-Mk = burst forming unit megakaryocyte
bzw. = beziehungsweise
CFU-B = colony forming unit B-lymphocyte
CFU-Ba = colony forming unit basophilic granulocyte CFU-E = colony forming unit erythrocyte
CFU-Eo = colony forming unit eosinophilic granulocyte CFU-G = colony forming unit granulocyte
CFU-GEMM = colony forming unit granulocyte erythrocyte macrophage megakaryocyte
CFU-GM = colony forming unit granulocyte macrophage CFU-L = colony forming unit lymphocyte
CFU-M = colony forming unit macrophage CFU-Mk = colony forming unit megakaryocyte CFU-S = colony forming unit spleen
CFU-T = colony forming unit T-lymphocyte CSF = colony-stimulating factor DNS = Desoxyribonukleinsäure EDTA = Ethylendiamintetraessigsäure G-CSF = granulocyte colony-stimulating factor
GM-CSF = granulocyte macrophage colony-stimulating factor I.E. = Internationale Einheit
IL-3 = Interleukin 3
kg = Kilogramm
M-CSF = macrophage colony-stimulating factor
Megakaryoblast-2 = Megakaryoblast mit zweifach gelapptem Kern Megakaryoblast-4 = Megakaryoblast mit vierfach gelapptem Kern
ml = Milliliter
multi-CSF = multipotential colony-stimulating factor
N = Chromosomensatz
NK-Zellen = natürliche Killerzellen
rc-EPO = recombinant canine erythropoietin
rcG-CSF = recombinant canine granulocyte colony-stimulating factor rcGM-CSF = recombinant canine granulocyte macrophage colony-
stimulating factor
rc-SCF = recombinant canine stem cell factor rhu-IL-3 = recombinant human interleukin 3 rhu-SCF = recombinant human stem cell factor
s = Standardabweichung
s.c. = subkutan
SCF = stem cell factor
Tab. = Tabelle
u. = und
u. a. = unter anderem
µm = Mikrometer
= arithmetischer Mittelwert
z. B. = zum Beispiel
A Einleitung
Die zytologische Knochenmarkuntersuchung gewinnt beim Hund in vielfältigen Indikationsgebieten (z. B. Panzytopenien, myeloproliferative Erkrankungen, Nachweis von Mikrometastasen) eine wachsende diagnostische Bedeutung (HARVEY 1984; JACOBS u. VALLI 1988; GRINDEM 1989; DUNN 1992; TVEDTEN 1999). Wesentliche Grundlage der exakten Beurteilung von Knochenmarkpräparaten sind Referenzwerte für die prozentuale Verteilung der kernhaltigen Zellen, die auf einer breiten Datenbasis ermittelt wurden. Letztere fehlt jedoch bei nahezu allen publizierten Referenzbereichen. Dies ist, neben abweichenden Methoden, sicherlich ein wesentlicher Grund für erhebliche Schwankungen zwischen verschiedenen Literaturangaben (HORN et al. 1953; PENNY u. CARLISLE 1970).
Für die Diagnostik der Thrombozytopenien ist die zytologische Knochenmarkunter- suchung im Hinblick auf die Differenzierung einer Bildungsstörung oder Umsatzstei- gerung der Thrombozyten von erheblicher Bedeutung (WARD 1980; EVANS et al.
1982; GREENE et al. 1982; TVEDTEN 1999). Die Beurteilung der Megakaryopoese ist aufgrund der unregelmäßigen Verteilung der Megakaryozyten im Knochenmark- ausstrich nicht wie bei anderen Zellen mit dem Myelogramm, sondern nur in der Übersichtsvergrößerung möglich (KELLER 1985). Bislang fehlen allerdings Untersuchungen beim Hund, die anhand einer ausreichenden Tierzahl systematisch die verschiedenen methodischen Aspekte, insbesondere die Anzahl der auszuwer- tenden Gesichtsfelder, bearbeiten.
Das wesentliche Ziel der vorliegenden Studie ist es daher, unter besonderer
Berücksichtigung der Alters- und Geschlechtsunterschiede Referenzwerte für das
Myelogramm des Hundes zu ermitteln. Im weiteren soll das Verfahren zur quantitati-
ven Beurteilung der Megakaryopoese im zytologischen Knochenmarkpräparat
optimiert werden und auch hierfür sollen Referenzwerte ermittelt werden.
B Literaturübersicht
1. Entwicklung des Knochenmarks
Erste hämatopoetische Zellen sind beim Säugetier intrauterin im Dottersack nachzu- weisen (AUFDERHEIDE 1981; JAIN 1986). Nach ANDERSEN und GOLDMAN (1970) befinden sich beim Hund am 40. Tag der Embryonalphase Zellen der Erythropoese in der Leber. Am 42. Tag besiedeln Stammzellen hämatogen die Milz und den Thymus und am 45.Tag das Knochenmark (FLIEDNER et al. 1990).
In der postnatalen Phase liegt nahezu das gesamte Knochenmark als aktives Mark vor. Beim adulten Tier sind Brustbein, Rippen, Wirbelkörper sowie die Beckenkochen als platte Knochen neben den Epiphysen der langen Röhrenknochen, besonders des Femurs und Humerus, Hauptbildungsort des aktiven Knochenmarks (AUFDERHEI- DE 1981). Mit zunehmendem Alter findet ein Umbau in den langen Röhrenknochen von aktivem Knochenmark zu inaktivem Fettmark statt (GREENBERG et al. 1966;
JAIN 1986). Der Anteil des Knochenmarks beträgt beim adulten Hund 1,9 bis 2,4%
des Körpergewichts. Dies entspricht etwa zwei Drittel der Lebermasse (FAIRMAN u.
WHIPPLE 1933).
2. Anatomie des Knochenmarks
Die Hämatopoese selbst findet innerhalb des Knochenmarks in extravaskulären Bereichen statt (JAIN 1986). Das die innere Oberfläche der Markhöhle auskleidende Endost bildet aus Osteoblasten und Osteoklasten bestehende Trabekel. Diese ragen neben Retikulum-, Endothel- und Fettzellen in die Markhöhle hinein und durchziehen als Netzwerk Gruppen von hämatopoetischen Zellen (WEISS u. SAKAI 1984;
DELDAR et al. 1985). Die Trabekel übernehmen dabei nicht nur eine Stützfunktion,
sondern spielen vor allem eine entscheidende Rolle bei der Proliferation, Differenzie-
rung und Reifung der lymphohämatopoetischen Zellen (TRENTIN 1971; PROCKOP
1997). Zu diesem funktionell wichtigen Mikromilieu zählen nach WEISS (1967),
DELDAR und WEISS (1984) und MÜLLER-HERMELINK und BAUMANN (1990)
auch Makrophagen und Chondroblasten.
DE BRUYN et al. (1970) und DELDAR et al. (1985) bezeichnen die Gefäßversorgung des Knochenmarks bei Säugetieren als portales System. Periostale Kapillaren verzweigen sich und gelangen als transosteale Kapillaren durch Löcher im Periost in die Markhöhle. Bei Eintritt in den Markraum bilden sich unter Verdopplung des Lumens Sinusoide. Letztere münden in efferente Zentralvenen (Abb.1).
Periostale Kapillaren
Zentralvene
Kortikalis
Sinusoide
Abb. 1: Gefäßversorgung des Knochenmarks, modifiziert nach DE BRUYN et al.
(1970)
Elektronenmikroskopische Untersuchungen von DELDAR und WEISS (1984) beschreiben die Gefäßwand der Sinusoide beim Hund strukturell als unilaminäre (Endothel), bilaminäre (Endothel und Adventitia oder Endothel und Basalmembran) oder trilaminäre Barriere (Endothel, Basalmembran und Adventitia). Der Anteil der unilaminären Sinusoide im Knochenmark des Hundes liegt über 38% (DELDAR et al.
1989). Die Ausschleusung reifer Zellen in das periphere Blut wird durch Öffnungen in den Sinusoiden gewährleistet, die beim Hund im Abstand von 59 bis 109 µm auftreten (DELDAR et al. 1989).
Untersuchungen am Knochenmark von Mäusen belegen, dass Stammzellen (CARSTEN u. BOND 1968; LORD u. HENDRY 1972; NILSSON et al. 1997) sowie Zellen der Granulopoese (LAMBERTSEN u. WEISS 1983) und Monopoese (METCALF 1970) überwiegend im Bereich der endostalen Trabekel lokalisiert sind.
Auch beim Hund lässt sich ein vermehrtes Auftreten der Vorläuferzellen der Granulopoese in der Nähe des Endostes feststellen (DELDAR et al. 1985) (Abb. 2).
Die Zellen der Erythropoese sind dagegen beim Säuger (BESSIS 1973; HANSPAL
1997) und so auch beim Hund (DELDAR et al. 1989) im Knochenmark in Kolonien ringförmig um Makrophagen, sogenannte Ammenzellen angeordnet. Untersuchung- en an caninem Knochenmark zeigen, dass die Vorläuferzellen der Erythropoese den Sinusoiden anliegen, während die zentral liegenden Makrophagen durch zytoplasma- tische Ausläufer mit der Gefäßwand verbunden sind (DELDAR et al. 1989). Weitere Makrophagen sind gleichmäßig im Knochenmark des Hundes verteilt (DELDAR et al.
1989).
Endost
Sinus
Endost G
E F
E F H
H
H G
M M
M
G G
E
L
L L
Abb. 2: Verteilung der hämatopoetischen Vorläuferzellen im caninen Knochenmark, E= Erythropoese mit zentral liegenden Makrophagen, F= Fettzellen, G= Gra- nulopoese, H= Histiozyten, L= Lymphopoese, M= Megakaryozyten
Die Zellen der Megakaryopoese befinden sich überwiegend an der abluminalen Seite der Sinusendothelien. Elektronenmikroskopische Untersuchungen lassen erkennen, dass Megakaryozytenfortsätze durchs Endothel hindurch ins Sinuslumen ragen (DELDAR et al. 1989; KANZ u. MERTELSMANN 1990). Die Vorläuferzellen der Lymphopoese sind diffus über die Markräume verteilt, was immunhistologische Untersuchungen am menschlichen Knochenmark belegen (HAYNES et al. 1988).
Fettzellen hingegen sind im aktiven Knochenmark des Hundes vermehrt um die
Sinusoide angeordnet (DELDAR et al. 1989).
3. Hämatopoese 3.1. Regulation
Wachstum und Differenzierung der hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen werden bei Säugern durch Glykoproteine, die Zytokine, kontrolliert (STEINHEIDER 1988; METCALF 1989; BROUDY 1997). Hierzu zählen koloniestimulierende Faktoren (colony-stimulating factor, CSF), hämatopoetische Wachstumsfaktoren, Interleukine, Interferone sowie Tumornekrosefaktoren (ELMSLIE et al. 1991;
STEINHEIDER 1991).
Der Stammzellfaktor (stem cell factor, SCF) wurde u. a. im fetalen Gewebe (Dottersack, Leber, Knochenmark, Darm und zentrales Nervensystem) von Mäusen (KESHET et al. 1991) wie auch in Fibroblasten des menschlichen Knochenmarks (LINENBERGER et al. 1995) nachgewiesen. Das funktionelle Potential des SCF im Rahmen der Hämatopoese wird durch in vitro-Untersuchungen von BERNSTEIN et al. (1991) und MIGLIACCIO et al. (1992) an humanen Stammzellen veranschaulicht, wo der Einsatz von rekombinantem humanen (rhu) SCF in Kombination mit Interleukin 3 (IL-3) und anderen Zytokinen eine Proliferation der Stamm- und Vorläuferzellen hervorruft. In in vivo-Untersuchungen beim Hund zeigen sich nach s.c. Injektion von rekombinantem caninen SCF (rc-SCF) neben einer Panhyperplasie des Knochenmarks auch ein Anstieg der neutrophilen Granulozyten im peripheren Blut (SCHUENING et al. 1993 u. 1997). Beim Säugetier können neben dem SCF fünf weitere CSF unterschieden werden (OGILVIE 1995):
• Der multi-koloniestimulierende Faktor (multipotential colony-stimulating factor, multi-CSF), auch als IL-3 bezeichnet, wird beim Menschen und bei der Maus - für den Hund liegen entsprechende Untersuchungen nicht vor - von aktivierten T-Lymphozyten, Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) und Mastzellen produziert (NIMER u. UCHIDA 1995). Er stimuliert bei diesen Spezies multipotente hä- matopoetische Vorläuferzellen (LOPEZ et al. 1987; MESSNER et al. 1987) und fördert somit die Proliferation der Myelopoese, Megakaryopoese, Erythro- poese sowie der Mastzellen (IHLE 1987; MORSTYN u. BURGESS 1988;
OTTMAN et al. 1990). Der Einsatz von rekombinantem humanen IL-3 (rhu-IL-
3) führt nach Untersuchungen von CIEKOT et al. (1991) beim Hund nur zu
einem geringgradigen Anstieg der neutrophilen Granulozyten und Makropha-
gen im peripheren Blut, was nach Aussagen der Autoren vermutlich auf signi- fikante strukturelle Unterschiede zwischen endogenem caninen IL-3 und rhu- IL-3 zurückzuführen ist.
• Der Granulozyt-Makrophagen-koloniestimulierende Faktor (granulocyte- macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) wird - zumindest beim Men- schen und bei der Maus - in aktivierten T-Lymphozyten, NK-Zellen, aktivierten Makrophagen, Fibroblasten und Endothelzellen gebildet (NIMER u. UCHIDA 1995). Die s.c. Applikation von rekombinantem caninen GM-CSF (rc-GM-CSF) führt beim gesunden Hund zum Anstieg der neutrophilen Granulozyten, Mo- nozyten (NASH et al. 1994) und Lymphozyten im peripheren Blut (NASH et al.
1991). Darüber hinaus lässt sich an murinen Vorläuferzellen durch GM-CSF die Proliferation der Megakaryopoese und Erythropoese induzieren (ALE- XANDER 1998).
• Der funktionell spezifischere Granulozyt–koloniestimulierende Faktor (granu- locyte colony-stimulating factor, G-CSF) wird ebenso wie der Makrophagen- koloniestimulierende Faktor (macrophage colony-stimulating factor, M-CSF) von Endothelzellen, Fibroblasten, Monozyten und Makrophagen gebildet (SALLERFORS 1994). Die Stimulation des Knochenmarks durch s.c. Injektio- nen von rekombinantem caninen G-CSF (rc-G-CSF) führt bei Hunden zu ei- nem Anstieg der Monozyten und neutrophilen Granulozyten im peripheren Blut (OBRADOVICH et al. 1991; MISHU et al. 1992; DE REVEL et al. 1994) sowie zur Erhöhung des Anteils der Progranulozyten (OBRADOVICH et al. 1991) im Knochenmark. Durch intraperitoneale Injektion des M-CSF wird bei Mäusen ein ansteigender Prozentsatz der Makrophagen in der Leber sowie reifer Mo- nozyten im peripheren Blut beobachtet (HUME et al. 1988). In der zugängli- chen Literatur sind hinsichtlich der Wirkung des M-CSF beim Hund keine Stu- dien beschrieben worden.
• Das Erythropoietin, ein weiterer hämatopoetischer Wachstumsfaktor, gilt bei Säugern als primärer regulatorischer Faktor der Erythropoese (ISCOVE 1977;
FINCH 1982; NATHAN u. SYTKOWSKI 1983). Die fetale Leber (KRANTZ
1991) sowie Fibroblasten der Nierenrinde zählen zu den Hauptbildungsorten
des Erythropoietins (KOURY et al. 1988; ESCHBACH 1989). In einer klini-
schen Studie von RANDOLPH et al. (1999) kann durch s.c. Applikation von
rekombinantem caninen Erythropoietin (rc-EPO) ein deutlicher Anstieg des
Hämatokrits und der absoluten Retikulozytenzahl bei gesunden Hunden beo- bachtet werden. Ferner lassen sich nach Erythropoietingabe beim Menschen und bei der Ratte erhöhte Thrombozytenzahlen feststellen (GORDON u.
HOFFMANN 1992; COWGILL et al. 1998), während beim Hund eine erhöhte Aktivität der Thrombozyten zu verzeichnen ist. Diese geht mit einer prozentua- len Steigerung der unreifen Thrombozyten an der insgesamt abnehmenden Gesamtthrombozytenzahl einher (WOLF et al. 1997).
• Der Wachstumsfaktor Thrombopoetin, beim Hund isoliert von HUNT et al.
(1995), gilt als wichtigstes Stimulans für die Proliferation und Reifung der Me- gakaryozyten (ALEXANDER 1998). Synthetisiert in der Leber, Niere, glatten Muskulatur und in den Fibroblasten des Knochenmarks (KAUSHANSKY 1995;
NAGAHISA et al. 1996), bewirkt Thrombopoetin in vitro bei der Maus und beim Menschen einen fünf- bis zehnfachen Anstieg der peripheren Thrombo- zytenzahl (FARESE et al. 1995; BASSER et al. 1996).
Außer den bereits genannten Faktoren existieren weitere hämatopoetische Wachstumsfaktoren. Bei den Zytokinen lässt sich sowohl eine proliferative als auch inhibitorische Wirkung auf die hämatopoetischen Zellen nachweisen (ELMSLIE et al.
1991). Die Interleukine 1 und 4 stimulieren beispielsweise - allein oder in Kombina-
tion mit anderen Wachstumsfaktoren - die Myelopoese und hemmen gleichzeitig die
Proliferation der Erythropoese. Im Vergleich dazu ist das Wirkungsspektrum des
Interleukins 5 weitestgehend auf die Regulation der Vorläuferzellen der eosinophilen
Granulozyten beschränkt (DEAN 2000). Ein myelosuppressiver Effekt wird vor allem
durch die Interferone und Tumornekrosefaktoren erzielt (DEAN 2000). Einen
Überblick über die wichtigsten Bildungs- und Zielorte der Zytokine gibt Tabelle 1.
Tab. 1: Bildungsort und Zielzellen der Interferone, Interleukine und Tumor- nekrosefaktoren (in Anlehnung an ELMSLIE et al. 1991; DEAN 2000, Er- läuterung der Abkürzungen: siehe S. 17)
Zytokine Bildungsort Zielzellen
Interferon-alpha Makrophagen Lymphozyten
Interferon-beta Fibroblasten Lymphozyten
Interferon-gamma T-Lymphozyten Tumornekrose-
Faktoren
T-Lymphozyten, Makrophagen, Monozyten
Lymphozyten Interleukin 1 Makrophagen, B-Lymphozyten,
Fibroblasten, NK-Zellen, Keratinozyten,
Endo- und Epithelzellen
Lymphozyten
Interleukin 2 T-Lymphozyten, NK-Zellen Lymphozyten, Makrophagen NK-Zellen
Interleukin 4 T-Lymphozyten Lymphozyten, Fibroblasten, CFU-GM
Interleukin 5 T-Lymphozyten, B-Lymphozyten Lymphozyten, eosinophile Granulozyten
Interleukin 6 T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, Monozyten, Makrophagen,
Mastzellen, Fibroblasten, Endo- und Epithelzellen, Keratinozyten
Lymphozyten, CFU-GM, CFU-Mk, Megakaryozyten
Interleukin 7 Knochenmarkstromazellen Lymphozyten
Interleukin 8 Makrophagen, Monozyten Neutrophile Granulozyten Interleukin 9 T-Lymphozyten Stammzellen,
CFU-GEMM Interleukin 10 T-Lymphozyten Lymphozyten
Interleukin 11 Knochenmarkstromazellen Stammzellen, CFU-GM, CFU-Mk, BFU-E
Interleukin 12 Makrophagen Stammzellen
Interleukin 13 Fibroblasten, Endothelzellen CFU-GEMM
Erläuterung der Abkürzungen von Tabelle 1 (S. 18):
BFU-E = burst forming unit erythrocyte BFU-Mk = burst forming unit megakaryocyte CFU-E = colony forming unit erythrocyte
CFU-Eo = colony forming unit eosinophilic granulocyte
CFU-GEMM = colony forming unit granulocyte erythrocyte macrophage megakaryocyte
CFU-GM = colony forming unit granulocyte macrophage CFU-M = colony forming unit macrophage
CFU-Mk = colony forming unit megakaryocyte NK-Zellen = natürliche Killerzellen
3.2. Reifungskompartments und Regulation
Die Hämatopoese lässt sich nach GASPER (2000) in drei Stufen oder Kompartments einordnen (Abb. 3). Die dem Stammzellkompartment zugehörigen Zellen besitzen, belegt durch in vitro- und in vivo-Untersuchungen bei Mäusen, die Fähigkeit zur Bildung aller lympho-hämatopoetischen Zellen (TILL u. MC CULLOCH 1961;
SPANGRUDE et al. 1988) sowie das Potential zur Selbsterneuerung (ABKOWITZ et al. 1990). Stammzellen können sich überall dort, wo die zellulären und extrazellulä- ren Voraussetzungen der Proliferation gegeben sind, zu determinierten Vorläuferzel- len, auch Progenitorzellen genannt, differenzieren (GORDON u. GREAVES 1989).
Die Zellen des Stammzell- und Progenitorkompartments lassen sich lichtmikrosko- pisch von Lymphozyten nicht unterscheiden (THOMAS et al. 1965; FLIEDNER et al.
1968; RICHMAN et al. 1978). Dennoch können sie anhand eines transmembranen Glycoproteins, des CD34, mit Hilfe monoklonaler Antikörper markiert werden (STELLA et al. 1995; KRAUSE et al. 1996). Beim Hund konnte die Arbeitsgruppe um MC SWEENEY et al. (1996 u. 1998) unter Anwendung monoklonaler Antikörper 2,1% (±1%) CD34+ Zellen aus unfraktioniertem Knochenmark sowie 0,1% CD34+
Zellen aus dem peripheren Blut separieren.
Die aus den Stammzellen hervorgehende koloniebildende-Einheit-Granulozyt-
Erythrozyt-Makrophage-Megakaryozyt (colony forming unit granulocyte erythrocyte
macrophage megakaryocyte, CFU-GEMM) hat sowohl beim Hund (SCHWARTZ et al. 1986) als auch bei Mäusen (RASKIN 1996) nachweislich multipotente Eigenschaf- ten. Sie kann - belegt durch in vitro-Untersuchungen mit Kulturassays beim Hund - unter Einwirkung unterschiedlicher Wachstumsfaktoren zur Vorläuferzelle der Erythropoese (burst forming unit erythrocyte, BFU-E) ausreifen (ERICKSON u.
TOROK-STORB 1981; SCHWARTZ et al. 1986; DELDAR et al. 1990; DELDAR et al.
1991). Ferner belegen in vitro-Untersuchungen an humanen Vorläuferzellen des Knochenmarks die Reifung der CFU-GEMM zur Vorläuferzelle der Megakaryopoese (burst forming unit megakaryocyte, BFU-Mk) (KANZ et al. 1982; MESSNER et al.
1982). Beim Hund kann die Differenzierung der CFU-GEMM in die Progenitorzellen der Granulo- und Monopoese [koloniebildende-Einheit-Granulozyt-Makrophage (colony forming unit granulocyte macrophage, CFU-GM)] anhand von Kulturassays nachgewiesen werden (KLEIN et al. 1983; NOTHDURFT et al. 1984; DELDAR et al.
1990). Auch die Bildung der eosinophilen Granulozyten [koloniebildende-Einheit- eosinophiler Granulozyt (colony forming unit eosinophilic granulocyte, CFU-Eo)] und der basophilen Granulozyten [koloniebildende-Einheit-basophiler Granulozyt (colony forming unit basophilic granulocyte, CFU-Ba)] lässt sich direkt aus der CFU-GEMM mittels In-vitro-Untersuchungen an humanen Stammzellen veranschaulichen (BUHRING u. SIMMONS 1999).
Die koloniebildende-Einheit-Lymphozyt (colony forming unit lymphocyte, CFU-L) bildet sich im Vergleich zu den myeloischen Zellen sowohl beim Menschen (FELLER u. MERZ 1990) als auch beim Hund (KLEIN et al. 1983) direkt aus den Stammzellen und differenziert sich zu B- und T-Lymphozytenspezifischen Progenitorzellen aus.
CFU-Ba und CFU-Eos reifen direkt zu den lichtmikroskopisch differenzierbaren Zellen der jeweiligen Zellreihe aus, während die übrigen Zellen sich zunächst über eine weitere Progenitorzelle differenzieren (RASKIN 1996) (Abb. 3).
Die sich in der Entwicklungsphase den Progenitorzellen anschließenden
Vorläuferzellen, auch Precursorzellen genannt, umfassen alle lichtmikroskopisch
differenzierbaren zellreihenspezifischen Zellen. Die morphologischen Kriterien dieser
Zellen werden unter den Punkten 3.3.1. bis 3.3.6. im Abschnitt 3.3. „Morphologie der
Entwicklungsreihen“ näher beschrieben.
CFU-T
CFU-B CFU-L
CFU-S
Pro- erythroblastMakroblastoxyphiler Normoblastpolychromat. NormoblastRetikulozyt eosinophiler Promyelozyt
neutrophiler Promyelozyt Myeloblast
Myeloblast
Myeloblast
Promonozyt
Megakaryozyt Monoblast
Mega- karyoblastPro- Megakaryozyt Pro- lymphozyten
baso. stab. Granulozyt eos. stab. Granulozyt
neutr. stab. Granulozyt basophiler Metamyelozyt
eosinophiler Metamyelozyt
neutrophiler Metamyelozyt basophiler Myelozytbasophiler Promyelozyt
eosinophiler Myelozyt
neutrophiler Myelozyt Pro- lymphozyten Lymphoblast
Lymphoblast Vorläuferzellen/ Precusorzellendeterminierte Vorläuferzellen/ ProgenitorzellenStammzellenEndzelle
basophiler Normoblast CFU-Ba
CFU-Eo
CFU-G
CFU-E CFU-MK CFU-M B-Lym- phozyten T-Lym- phozyten
baso. seg. Granulozyt
neutr. seg. Granulozyt eos. seg. Granulozyt
Monozyt
Thrombozyt
Erythrozyt CFU-GM
CFU- GEMMBFU-MK
BFU-E CFU-T
CFU-B CFU-L
CFU-S
Pro- erythroblastMakroblastoxyphiler Normoblastpolychromat. NormoblastRetikulozyt eosinophiler Promyelozyt
neutrophiler Promyelozyt Myeloblast
Myeloblast
Myeloblast
Promonozyt
Megakaryozyt Monoblast
Mega- karyoblastPro- Megakaryozyt Pro- lymphozyten
baso. stab. Granulozyt eos. stab. Granulozyt
neutr. stab. Granulozyt basophiler Metamyelozyt
eosinophiler Metamyelozyt
neutrophiler Metamyelozyt basophiler Myelozytbasophiler Promyelozyt
eosinophiler Myelozyt
neutrophiler Myelozyt Pro- lymphozyten Lymphoblast
Lymphoblast Vorläuferzellen/ Precusorzellendeterminierte Vorläuferzellen/ ProgenitorzellenStammzellenEndzelle
basophiler Normoblast CFU-Ba
CFU-Eo
CFU-G
CFU-E CFU-MK CFU-M B-Lym- phozyten T-Lym- phozyten
baso. seg. Granulozyt
neutr. seg. Granulozyt eos. seg. Granulozyt
Monozyt
Thrombozyt
Erythrozyt CFU-GM
CFU- GEMMBFU-MK
BFU-E
Abb. 3: Schematische Darstellung der Entwicklungsreihen der Hämatopoese in Anlehnung an GASPER (2000) / Erläuterung der Abkürzungen: sie- he Seite 22
Erläuterung der Abkürzungen zur Abbildung 3:
BFU-E = burst forming unit erythrocyte BFU-Mk = burst forming unit megakaryocyte CFU-B = colony forming unit B-lymphocyte
CFU-Ba = colony forming unit basophilic granulocyte CFU-E = colony forming unit erythrocyte
CFU-Eo = colony forming unit eosinophilic granulocyte CFU-G = colony forming unit granulocyte
CFU-GEMM = colony forming unit granulocyte erythrocyte macrophage
megakaryocyte
CFU-GM = colony forming unit granulocyte macrophage CFU-L = colony forming unit lymphocyte
CFU-M = colony forming unit macrophage CFU-Mk = colony forming unit megakaryocyte CFU-S = colony forming unit spleen
CFU-T = colony forming unit T-lymphocyte
3.3. Morphologie der Entwicklungsreihen 3.3.1. Erythropoese
Die kernhaltigen Vorläuferzellen der Erythropoese lassen sich durch die intensivere Färbung des Zellkerns und des Zytoplasmas lichtmikroskopisch leicht von den Zellen der Granulo- und Monopoese unterscheiden (JAIN 1993).
Der Proerythroblast ist die unreifste und größte lichtmikroskopisch differenzierbare Zelle der Erythropoese (SAAR 1973b; AUFDERHEIDE 1981). Beim Hund beträgt der Zelldurchmesser 10-20 µm (HORN et al. 1953; SAAR 1973b; PENNY 1974). Der Kern, mit drei bis fünf Nukleoli ausgestattet, ist rund, dunkelviolett und weist eine gleichmäßige, dicht gefügte Chromatinstruktur auf (SAAR 1973b; PENNY 1974;
AUFDERHEIDE 1981). STASNEY und HIGGINS (1937) und HORN et al. (1953)
weisen auf Ähnlichkeiten mit dem Kern des Myeloblasten hin. Das Zytoplasma ist
tiefblau und nicht granuliert. Die perinukleäre flecken- oder sichelförmige Aufhel-
lungszone (SAAR 1973b; PENNY 1974) spricht für einen aktiven Golgiapparat (KELLER u. FREUDIGER 1983; JAIN 1993). Nach SAAR (1973b) entsteht durch Teilung des Proerythroblasten zunächst der morphologisch sehr ähnliche, aber im Zelldurchmesser kleinere „kleine Proerythroblast“. Dieser wird beim Menschen von HECKNER und FREUND (2001) als Makroblast bezeichnet.
Im weiteren differenzieren sich durch Zellteilung die Normoblasten. Als Ausdruck der Zellreifung kommt es zur Reduktion der Zell– und Kerngröße sowie zur Abnahme der Basophilie des Zytoplasmas. Durch vermehrte Hämoglobinsynthese wird das Zytoplasma mit fortschreitender Zellreifung oxyphil (SAAR 1973b; AUFDERHEIDE 1981). Der basophile Normoblast ist durch das spezifisch gefelderte Chromatin des Zellkerns, das teilweise als Radspeichenstruktur bezeichnet wird (MULLIGAN 1941;
HORN et al. 1953; PENNY 1974), sowie durch sein noch basophiles Zytoplasma charakterisiert. Das Zytoplasma des kleineren polychromatischen Normoblasten hingegen ist graublau. Während das Chromatin verklumpt, nimmt die Größe des Zellkerns ab (SAAR 1973b). Der nicht mehr teilungsfähige oxyphile Normoblast (HARVEY 1984) enthält einen kleinen, durch Verdichtung des Chromatins entstehenden pyknotischen Zellkern (SAAR 1973b; AUFDERHEIDE 1981). Das Zytoplasma ist grau (PENNY 1974).
Durch Ausstoßung des pyknotischen Zellkerns entsteht der Retikulozyt. Die in der Zelle verbleibenden Zellorganellen, die Polyribosomen, Ribosomen und Mito- chondrien, werden in angefärbtem Zustand als Substantia granulo- oder reticulofila- mentosa bezeichnet. Nach Supravitalfärbung mit Brilliantkresylblau oder Methylen- blau sind sie lichtmikroskopisch als intrazelluläre Netzstrukturen sichtbar (JAIN 1986). Bei Hund und Katze werden zwei verschiedene Formen, die unreiferen aggregierten und die reiferen punktierten Retikulozyten, unterschieden (CRAMER u.
LEWIS 1972). Die reife punktierte Form ist beim Hund im Gegensatz zur Katze nur
selten zu finden (LABER et al. 1974; TVEDTEN 1981). Die aggregierten Retikulozy-
ten des Hundes reifen innerhalb von 31 Stunden (19 – 43, Minimum – Maximum) aus
(NIZET u. ROBSCHEIT-ROBBINS 1950). Beim Mensch werden die Retikulozyten je
nach Größe der präzipitierten und angefärbten Ribosomen in vier Gruppen (1 =
wenig Granula bis 4 = Netzstruktur) unterteilt. Letztere bilden die Mehrheit der
Retikulozyten im peripheren Blut des Menschen (BAIN u. HUHN 1997).
3.3.2. Myelopoese
Der Myeloblast ist die unreifste lichtmikroskopisch differenzierbare Zelle der Granulopoese (SAAR 1973b; JAIN 1993). Myeloblasten sind im zytologischen Knochenmarkpräparat größer als die Proerythroblasten (AUFDERHEIDE 1981) und weisen beim Hund einen runden, teilweise auch seitlich abgeflachten Kern mit feinnetziger Chromatinstruktur und zwei bis fünf Nukleoli auf (STASNEY u. HIGGINS 1937; MULLIGAN 1941; BLOOM u. MEYER 1944; SAAR 1973b). Der schmale Zytoplasmasaum ist basophil und nicht granuliert (SAAR 1973b; AUFDERHEIDE 1981; HARVEY 1984). Durch Zellteilung entsteht der Promyelozyt, die größte Zelle der Granulopoese (MULLIGAN 1941). Das Kern-Zytoplasma-Verhältnis ist beim Promyelozyten zugunsten des Zytoplasmas verschoben (HORN et al. 1953, PENNY 1974; HARVEY 1984). Die Kernstruktur und -größe entspricht der des Myeloblasten (MULLIGAN 1941). Das Zytoplasma ist leicht bläulich und weist die für den Promyelozyten charakteristische azurophile Granula auf (SAAR 1973b; AUF- DERHEIDE 1981; HARVEY 1984). Nach STASNEY und HIGGINS (1937), SAAR (1973b), PENNY (1974) und JAIN (1986) können bereits in diesem Reifestadium Sekundärgranula, also eosinophile, basophile oder neutrophile Granula, neben der azurophilen Primärgranula auftreten. Allerdings werden die zellreihenspezifischen Sekundärgranula in anderen Studien erst beim Myelozyten, der nächsten Reifungs- stufe, beobachtet (HORN et al. 1953; SCHALM 1974; AUFDERHEIDE 1981;
HARVEY 1984). Auch beim Menschen gehören die Sekundärgranula erst zu den Charakteristika des Myelozyten (BAIN u. HUHN 1997; HECKNER u. FREUND 2001).
Beim Übergang zum Myelozyten verringert sich der Zelldurchmesser und die
Kerngröße (HARVEY 1984). Das Chromatin des runden Zellkerns ist grobschollig,
Nukleoli sind nicht mehr zu erkennen (MULLIGAN 1941; PENNY 1974). Die
azurophile Granula weichen der Sekundärgranula und die Basophilie des Zytoplas-
mas nimmt mit fortschreitender Zellreifung ab (SAAR 1973b; JAIN 1986). Ein heller
Fleck nahe der Zentrosphäre des Zellkerns wird als zusätzliches markantes Merkmal
des Myelozyten beschrieben (HECKNER u. FREUND 2001). Metamyelozyten sind
aufgrund des typisch bohnen- oder nierenförmigen Kerns leicht zu identifizieren
(SAAR 1973b; AUFDERHEIDE 1981). Das Chromatin ist teilweise verklumpt und die
spezifische Sekundärgranula sind im Zytoplasma deutlich erkennbar. Metamyelozy-
ten teilen sich nicht mehr (SAAR 1973b; SCHALM 1974; HARVEY 1984; KELLER et
al. 1987; TYLER et al. 1999). Durch Zellreifung entsteht der stabkernige Granulozyt, dessen länglicher Kern eine C- oder S-Form annimmt (MULLIGAN 1941; AUF- DERHEIDE 1981). Durch Kernsegmentierung entstehen die ausgereiften polymorph- kernigen, segmentierten Granulozyten. Beim eosinophilen und basophilen segmentkernigen Granulozyten finden sich zwei Kernsegmente verbunden durch eine feinfädige Segmentbrücke (STASNEY u. HIGGINS 1937; AUFDERHEIDE 1981). Die Kerne der neutrophilen segmentkernigen Granulozyten hingegen weisen meist mehrere Kernsegmente auf (AUFDERHEIDE 1981).
3.3.3. Monopoese
Der Monoblast hat einen runden Kern mit grob strukturiertem Chromatin und zwei bis fünf Nukleoli (BLOOM u. MEYER 1944; AUFDERHEIDE 1981). Das basophile Zytoplasma umschließt kleine Vakuolen (HELMIN u. SAAR 1984). Eine sichere Abgrenzung vom Myeloblasten ist lichtmikroskopisch jedoch nicht möglich (BLOOM u. MEYER 1944; HARVEY 1984). Der Kern des durch Zellteilung entstehenden Promonozyten weist beim Hund bereits einseitige unregelmäßige Einbuchtungen auf (HELMIN u. SAAR 1984). Neben Vakuolen lassen sich vereinzelt azurophile Granula im hell-basophilen Zytoplasma finden (AUFDERHEIDE 1981; JAIN 1993). Nach JAIN (1986) und TYLER et al. (1999) ist der Promonozyt beim Hund nur schwer von neutrophilen Promyelozyten und Metamyelozyten zu unterscheiden. Der pleomorphe Monozyt ist charakterisiert durch seinen gelappten, vielgestaltigen Kern (HELMIN u.
SAAR 1984). Das gräuliche Zytoplasma enthält eine variable Anzahl und Größe von Vakuolen (AUFDERHEIDE 1981; JAIN 1993). Die großen polymorphen Makropha- gen enthalten im Zytoplasma neben dem rund-ovalen Zellkern Vakuolen mit phagozytiertem Material (BLOOM u. MEYER 1944), z. B. pyknotische Zellkerne, Hämosiderin, seltener auch Erythrozyten oder Leukozyten (HORN et al. 1953;
HARVEY 1984).
3.3.4. Megakaryopoese
Die Megakaryopoese weicht hinsichtlich der Zelldifferenzierung der Precursorzellen von der Erythro- und Myelopoese ab. Megakaryoblasten, Promegakaryozyten und Megakaryozyten als lichtmikroskopisch sichtbare kernhaltige Zellen der Thrombo- poese entstehen durch Polyploidisierung des Zellkerns und Endoreduplikation der DNS. Bei dieser Form der Zellreifung kommt es nicht zur Teilung des Zytoplasmas (AUFDERHEIDE 1981; SCHALM 1981; HARVEY 1984). Die polyploiden Zellen enthalten beim Hund 2 N bis zu 128 N Chromosomensätze (BOUDREAUX u. EBBE 1996).
Der Megakaryoblast ist als unreifste Zellform deutlich größer als die Blasten der übrigen Zellreihen (AUFDERHEIDE 1981). Er enthält ein bis vier Kerne (JAIN 1986), das Zytoplasma ist basophil und frei von Granulation (HORN et al. 1953; AUF- DERHEIDE 1981). Das Kern-Zytoplasma-Verhältnis ist zugunsten des Kerns verschoben. Die nächste Reifungsstufe, der Promegakaryozyt, ist deutlich größer als der Megakaryoblast und enthält mehr als vier Kerne. Das Zytoplasma ist auch hier basophil und ohne Granulation (HORN et al. 1953; AUFDERHEIDE 1981). Der Megakaryozyt als reifste kernhaltige Zelle stellt die größte Zelle im Knochenmark dar.
Er ist durch seinen vielgelappten Kern und die deutliche Zunahme des Zytoplasmas charakterisiert (STASNEY u. HIGGINS 1937; BLOOM u. MEYER 1944). In dieser Reifungsstufe kommt es letztlich zum Auftreten von azurophiler Granula im Zytoplasma als Ausdruck der aktiven Thrombozytenbildung (HORN et al. 1953;
AUFDERHEIDE 1981; SCHALM 1981; JAIN 1986).
3.3.5. Lymphopoese
Bezüglich der Lymphozytenmorphologie wird für den Menschen bei HECKNER und
FREUND (2001) zwischen den Vorläufer- und Effektorzellen der Lymphopoese im
Knochenmark unterschieden. Morphologisch sind mit Routinemethoden weder die
Vorläuferzellen noch die zu den Effektorzellen zählenden funktionell unterschied-
lichen T- und B-Lymphozyten im Knochenmark eindeutig zu differenzieren
(DOUGLAS 1978; JAIN 1986; HECKNER u. FREUND 2001). Beim Hund hat der
rund-ovale Kern des Lymphozyten im zytologischen Knochenmarkausstrich den
Durchmesser eines Erythrozyten (FOURNEL-FLEURY 1994). Mitunter lassen sich azurophile Granula im hellblauen schmalen Zytoplasma erkennen (AUFDERHEIDE 1981; KELLER u. FREUDIGER 1983). Aus den B-Lymphozyten entwickeln sich nach Antigenkontakt Plasmazellen. Diese Effektorzelle weist beim Hund einen runden, fast immer exzentrisch liegenden Kern auf, dessen schollenartiges Chromatin morpholo- gisch auch als Radspeichenstruktur bezeichnet wird (BLOOM u. MEYER 1944;
SAAR u. ULRICH 1975). Perinukleär ist eine Aufhellungszone zu erkennen. Im stark basophilen Zytoplasma sind gelegentlich Vakuolen, die Russell-Körperchen, bestehend aus Immunglobulin enthalten (SAAR u. ULRICH 1975; HARVEY 1984).
Im Gegensatz dazu werden in älteren Publikationen beim Hund noch drei Stufen der Entwicklungsreihe der Lymphozyten im Knochenmark beschrieben (AUFDERHEIDE 1981; KELLER u. FREUDIGER 1983). Der Lymphoblast ist neben dem basophilen Zytoplasma durch einen großen Kern mit deutlichen Nukleoli charakterisiert. Er gilt als größte Zelle dieser Zellreihe. Beim kleineren Prolymphozyt lassen sich keine Nukleoli mehr in der dichteren Chromatinstruktur erkennen. Der rund-ovale Kern des ausgereiften Lymphozyten ist von einem schmalen Zytoplasmasaum umgeben.
3.3.6. Weitere Zellen
Osteoblasten liegen nach HORN et al. (1953) im zytologischen Knochenmarkaus- strich meist in Nestern vor. Sie sind durch einen kleinen, rund-ovalen und streng exzentrisch gelagerten Kern gekennzeichnet (HORN et al. 1953; HARVEY 1984).
Das gekörnte Zytoplasma ist stark basophil (HORN et al. 1953). Durch das netzartig locker angeordnete Chromatin unterscheidet sich der Osteoblast von der sonst sehr ähnlichen Plasmazelle (HARVEY 1984; GRINDEM 1989). Nach HARVEY (1984) stellt sich perinukleär eine Aufhellungszone dar, die auf einen aktiven Golgiapparat schließen lässt.
Die vielkernigen Osteoklasten sind neben den Megakaryozyten die größten Zellen
des Knochenmarks. Aufgrund der unterschiedlichen Kernstruktur sind beide
morphologisch leicht voneinander zu unterscheiden (HARVEY 1984). Die 30 bis zu
50 Kerne des Osteoklasten liegen einzeln innerhalb der Zelle, während der
polyploide Kern des Megakaryozyten mehrfach gelappt ist. Die runden bis ovalen
Kerne weisen ein strukturiertes Chromatinnetz mit ein bis drei Nukleoli auf (HORN et
al. 1953). Das Zytoplasma ist leicht basophil und dabei stets azurophil granuliert (HARVEY 1984; GRINDEM 1989).
Fettzellen erscheinen im Knochenmarkausstrich als optisch leere Vakuolen mit wandständigen plattgedrückten Zellkernen (HORN et al. 1953).
Retikulumzellen haben einen rund-ovalen Kern mit feinfädiger Chromatinstruktur und blassblauen Nukleoli. Das blau-graue Zytoplasma enthält feine Vakuolen und ist aufgrund der Größe in Ausstrichpräparaten selten vollständig erhalten (BLOOM u.
MEYER 1944; SAAR u. ULRICH 1975).
Mastzellen in Knochenmarkausstrichen des Hundes haben einen rund-ovalen Kern.
Der breite Zytoplasmasaum ist ausgefüllt mit dunkelbraun-violetten Granula (SAAR u. ULRICH 1975).
4. Knochenmarkpunktion beim Hund 4.1. Indikationen
Die nicht-regenerative Anämie ist nach DUNN (1992) die häufigste Indikation zur Knochenmarkpunktion bei Hund und Katze. Auch bei persistierenden Zytopenien (Neutropenie, Thrombozytopenie, Anämie), ob einzeln oder in Kombination auftretend, sowie bei persistierender Erhöhung des Hämatokrits, Thrombozytosen und andauernden Leukozytosen ist die Untersuchung des Knochenmarks als ergänzende Diagnostik indiziert (HARVEY 1984; GRINDEM 1989; DUNN 1992).
Dies schließt den Verdacht auf eine lympho- oder myeloproliferative Erkrankung des
Knochenmarks ein (STERN 1983; DUNN 1992). Ebenso kann im Rahmen eines
Tumorstagings, insbesondere im Hinblick auf eine mögliche Infiltration des
Knochenmarks durch einen primär extramedullär gelegenen neoplastischen Prozess
(malignes Lymphom, Karzinom), eine Knochenmarkpunktion durchgeführt werden
(JACOBS u. VALLI 1988; GRINDEM 1989). Sie kann ferner bei Hyperproteinämie,
insbesondere bei monoklonaler Gammopathie, als diagnostisches Hilfsmittel
eingesetzt werden. Diese kann sowohl im Zuge von Infektionserkrankungen
(Ehrlichia canis, Leishmania donovani/infantum, Histoplasma capsulatum und
systemische Mykosen) auftreten (HARVEY 1984; GRINDEM 1989; DUNN 1992), als
auch im Zusammenhang mit neoplastischen Prozessen, wie dem Plasmozytom
(HARVEY 1984; JACOBS u. VALLI 1988; DUNN 1992; VILLIERS u. DOBSON 1998) und dem B-Zell-Lymphom (DUNN 1990) stehen. Des weiteren ist die Untersuchung des Knochenmarks bei rezidivierendem oder ständigem Fieber unbekannten Ursprungs angezeigt, um mögliche Neoplasien ausschließen zu können (DUNN 1992). Eine Hyperkalzämie, die beim Hund meist mit einem tumorösen Geschehen einhergeht (DUNN 1990), gibt weiterhin Anlass zur Knochenmarkuntersuchung (RELFORD 1991; DUNN 1992; MÉDAILLE 1993). So lassen sich u. a. bei einem Teil der Patienten mit lymphoblastischer Leukämie (HENRY et al. 1996), malignem Lymphom (MADEWELL 1986) und selten beim Plasmozytom (VILLERS u. DOBSON 1998) erhöhte Kalziumwerte im Blut feststellen. Schließlich können an zytologischen Knochenmarkpräparaten Spezialfärbungen, z. B. zytochemische Färbungen bzw.
Immunzytochemie bei akuter Leukämie (MORITZ u. GRÜNBAUM 1993), sowie Eisenfärbungen bei Anämien durchgeführt werden (HARVEY et al. 1982; RELFORD 1991).
Die Knochenmarkuntersuchung kann über die Diagnostik hinaus auch zum Monitoring des Therapieverlaufes, v. a. im Zusammenhang mit hämatopoetischen Neoplasien und Hypo- oder Aplasien des blutbildenden Systems, eingesetzt werden (KELLER 1986; JACOBS u. VALLI 1988).
4.2. Kontraindikationen und Komplikationen der Knochenmarkpunktion
Kontraindikationen bei der Knochenmarkpunktion werden beim Hund nicht
beschrieben. Blutungen, Infektionen sowie Verletzungen des umgebenen Weichteil-
gewebes treten als mögliche Komplikationen bei einer Knochenmarkpunktion nach
Beobachtungen von DUNN (1992) nur sehr selten auf. Insbesondere bei Patienten
mit Thrombozytopenie kann es zu Nachblutungen aus der Punktionsstelle kommen
(SAAR 1973a; PERMAN et al. 1974), dennoch ist die Knochenmarkpunktion in
solchen Fällen nicht kontraindiziert (PERMAN et al. 1974; GRINDEM 1989; DUNN
1990).
4.3. Punktionsstellen
Das aktive rote Knochenmark ist beim Hund im Bereich der Beckenknochen, Rippen, Sternalsegmente sowie an den Epiphysen der langen Röhrenknochen homogen verteilt. Vergleichende Studien bestätigen dies anhand von zytologischen Knochen- markpräparaten (STASNEY u. HIGGINS 1937; VAN LOON u. CLARK 1943;
REKERS u. COULTER 1948; MELVEGER et al. 1969; PENNY u. CARLISLE 1970).
Daher ist die Auswertung eines Knochenmarkpräparates repräsentativ für den gesamten Organismus. Dies gilt allerdings nicht für fokale Veränderungen im Knochenmark, wie z. B. Myelofibrosen, maligne Lymphome, Knochenmarknekrosen, granulomatöse Entzündungen, Myelome oder metastasierende Karzinome (JACOBS u. VALLI 1988).
HO et al. (1941), MEYER und BLOOM (1943), PENNY und CARLISLE (1970), DUNCAN und PRASSE (1976) und SCHALM (1981) sehen den Darmbeinflügel im Bereich der Crista iliaca beim Hund als Punktionsstelle der ersten Wahl an. Die Penetration der Punktionskanüle kann hier jedoch bei älteren Tieren aufgrund der härteren Kortikalis erschwert sein (SPRANGER u. HIME 1961; PENNY u. CARLISLE 1970). Die von SPRANGER und HIME (1961) beschriebene Methode zur Knochen- markpunktion in der Fossa trochanterica des Femurs wird bei kleinen Hunden auch von PERMAN et al. (1974), DUNN (1992) und MÉDAILLE (1993) favorisiert.
Zur Punktion am Sternum eignen sich die kielartig vorgewölbten zweiten, dritten (VOLLMERHAUS et al. 1981) und vierten Sternalsegmente (HORN et al. 1953;
SAAR 1973a) des Hundes. Die Knochenmarkentnahme an der siebten, achten oder neunten Rippe sollte wegen möglicher Verletzungen intrathorakal gelegener Organe nicht bei kleinen Hunden durchgeführt werden (PENNY u. CARLISLE 1970;
PERMAN et al. 1974). CATTELAN et al. (1990) berichten über gute Erfahrungen bei
der Punktion an der Tuberositas tibiae, während RELFORD (1991) die Knochen-
markentnahme am Humerus allen anderen Methoden unabhängig von Alter und
Größe der Hunde vorzieht.
4.4. Durchführung der Punktion
Eine Vollnarkose ist zur Durchführung der Knochenmarkpunktion nicht notwendig (SAAR 1973a; CATTELAN et al. 1990; RELFORD 1991). Einige Autoren befürworten jedoch die Infiltrationsanästhesie der Haut, des angrenzenden Weichteilgewebes und des schmerzempfindlichen Periosts (STERN 1983; RELFORD 1991; DUNN 1992).
SAAR (1973a) hält allerdings eine Lokalanästhesie nicht für erforderlich, da der Aspirationsschmerz als eigentlich schmerzhafte Phase der Knochenmarkpunktion dadurch unbeeinflusst bleibt. Auch HO et al. (1941) verzichten - unter Verwendung von Spinalkanülen zur Knochenmarkpunktion - auf eine Lokalanästhesie. Nach Rasur und Desinfektion der Punktionsstelle wird mit einer speziellen Knochenmark- punktionskanüle (Punktionskanüle nach Klima und Rosegger, Jamshidi, Iillinois, Vim- Silverman oder Rosenthal) (PENNY 1974; STERN 1983; DUNN 1990) oder einer Spinalkanüle (HO et al. 1941; CATTELAN et al. 1990) die Kortikalis mit leicht drehenden Bewegungen durchdrungen. Nach Erreichen des Markraums wird der Mandrin entfernt und maximal 0,5 ml Knochenmark mit einer 10 ml- oder 20 ml- Spritze aspiriert (CATTELAN et al. 1990; DUNN 1990). Die Gewinnung eines größeren Knochenmarkvolumens ist unvorteilhaft, da das nachfließende Markblut die aspirierte Probe verdünnt und damit die nachfolgende Untersuchung erschwert (HORN et al. 1953; DUNN 1992).
4.5. Anfertigung des Knochenmarkausstrichs
Die Anfertigung qualitativ guter Präparate ist für eine exakte Differenzierung der zellulären Bestandteile des Knochenmarks unbedingt erforderlich. Nur Knochen- markpräparate ohne Blutbeimischungen können eine verwertbare Auswertung gewährleisten. Demzufolge muss zunächst eine Isolierung der Markbröckel vom Markblut erfolgen (HORN et al. 1953; VALLI et al. 1969; HARVEY 1984). Hierzu werden in der zugänglichen Literatur unterschiedliche Methoden beschrieben:
Methode 1: Das gewonnene Knochenmarkaspirat kann auf schräggestellte
Objektträger gespritzt werden. Dabei fließt das Markblut nach unten ab,
während die Markbröckel am Glas haften bleiben (VALLI et al. 1969;
SAAR 1973a; DUNCAN u. PRASSE 1976; HARVEY 1984; DUNN 1990; MÉDAILLE 1993; MORITZ 1993; TYLER et al. 1999).
Methode 2: Das Aspirat kann aber auch zunächst in ein Auffanggefäß überführt werden und die Markbröckel im folgenden mittels Mikrohämatokritröhr- chen (TYLER et al. 1999), Kunststoffspateln (HECKNER u. FREUND 2001), Pipetten (HARVEY 1984; RELFORD 1991), Pinzetten (PENNY 1974) oder Holzstäbchen (HORN et al. 1953) selektiert und auf Objekt- träger übertragen werden.
Auch die Anfertigung der Präparate wird unterschiedlich beschrieben. Die bei der Methode 1 am Objektträger haften bleibenden Markbröckel sowie die bei Methode 2 auf einen Objektträger überführten Markbröckel können durch Auflegen eines zweiten Objektträgers im rechten Winkel (PENNY 1974; DUNCAN u. PRASSE 1976;
HARVEY 1984; DUNN 1990; RELFORD 1991) bzw. in entgegengesetzter Richtung (TYLER et al. 1999) oder eines Deckgläschen (HARVEY 1984; TYLER et al. 1999) und dessen vorsichtiges Wegziehen angefertigt werden. Im Gegensatz dazu können die nach Methode 1 selektierten Markbröckel auch mit dem Rand eines Objektträ- gers (VALLI et al. 1969; MORITZ 1993) bzw. mit einem Deckgläschen (SAAR 1973a) aufgenommen und auf einen weiteren Objektträger kontinuierlich ausgestrichen werden.
4.6. Färbung
Bei den Färbungen nach Romanowsky kommen die Farbstoffe Eosin und Methy- lenblau zur Anwendung (MARSHALL 1978). Giemsa modifizierte die Färbung und kombinierte Methyl-Azur und Eosin (BAIN u. HUHN 1997). Die am häufigsten von deutschsprachigen Autoren verwendete Methode zur Färbung von Knochenmark- präparaten des Hundes ist die, auch als Pappenheim-Färbung bezeichnete, kombinierte May-Grünwald-Giemsa Färbung (ALEXANDROV 1928; HORN et al.
1953; SAAR 1973a; KELLER 1986; MORITZ u. GRÜNBAUM 1993). Die Wright- Färbung, ebenfalls zu den Romanowsky-Färbungen zählend, wird überwiegend im englischen und amerikanischen Schriftum zur Färbung zytologischer Knochenmark- präparate angeführt (MEYER u. BLOOM 1943; DUNCAN u. PRASSE 1976;
SCHALM 1981; HARVEY 1984; HOFF et al. 1985). Bei der Wright-Färbung wird das
Methylenblau im Gegensatz zur May-Grünwald-Giemsa Färbung vorher erhitzt, um somit einen polychromen Farbstoff herzustellen (BAIN u. HUHN 1997). Schnellfär- bungen, die ebenfalls zu der Gruppe der Romanowsky-Färbungen zählen, haben den Nachteil, dass aufgrund fehlender metachromatischer Reaktionen die Granula der Mastzellen teilweise nicht vollständig angefärbt werden (TYLER et al. 1999).
Tab. 2: Reaktionsmuster des zytologischen Knochenmarkpräparates beim gesunden Hund nach FACKLAM und KOCIBA (1985) und GRINDEM et al.
(1986)
Peroxidase Alpha- Naphthylazetat-
Esterase
Periodsäure- Schiff- Reaktion
Myeloblast ± - -
Promyelozyt + - ±
Myelozyt ± - +
Metamyelozyt ± - +
stabkerniger Granulozyt ± - +
neutrophil segmentkerniger Granulozyt ± - +
Myelozyt + - +
Metamyelozyt + - +
stabkerniger Granulozyt + - +
eosinophil segmentkerniger Granulozyt + - +
Myelozyt - - -
Metamyelozyt - - -
stabkerniger Granulozyt - - -
basophil segmentkerniger Granulozyt - - -
Lymphozyten - ± ±
Monozyten ± + ±
Erythropoese - - -
Megakaryopoese - ± +
+ = positiv; - = negativ; ± = einige Zellen positiv und einige Zellen negativ
Durch zytochemische Reaktionen können darüber hinaus bestimmte Charakteristika einzelner Zellreihen hervorgehoben werden (KELLER 1986), was insbesondere bei der Leukämiediagnostik des Hundes eine entscheidende Rolle spielt (MORITZ u.
GRÜNBAUM 1993). Von besonderer Bedeutung sind die Peroxidase-Reaktion zur
Darstellung der Myelopoese und die Alpha-Naphthylazetat-Esterase-Reaktion zur
Identifizierung der Mono- und Megakaryopoese. Der Glykogennachweis mit der Periodsäure-Schiff-Reaktion ermöglicht eine weitergehende Differenzierung der Zellen (JAIN 1986; KELLER 1986; KUCZKA 1987) (Tab. 2). Einzelne Anämieformen können mittels Eisenfärbung der Knochenmarkpräparate mit Berliner Blau genauer differenziert werden (GRINDEM 1989; DUNN 1992).
5. Auswertung
5.1. Qualitative Prüfung des Knochenmarkausstrichs
Einer genauen Beurteilung geht die Prüfung des Präparates im Hinblick auf die Qualität des Ausstrichs und der Färbung voraus (GRINDEM 1989). Hierbei ist insbesondere darauf zu achten, dass makroskopisch ausreichend gut gefärbte Markbröckel sichtbar sind (HARVEY 1984), bei der mikroskopischen Betrachtung die kernhaltigen Vorläuferzellen als Monolayer vorliegen und die Anzahl der rupturierten Zellen möglichst gering ist (TYLER et al. 1999).
5.2. Zellularität
Die eigentliche Auswertung eines Knochenmarkausstrichs beginnt mit der
Beurteilung des Zellgehalts (normo-, hypo-, hyperzellulär) (SAAR 1973a; PENNY
1974; SCHALM 1981; HARVEY 1984; GRINDEM 1989). In der Übersichtsver-
größerung (100fache Vergrößerung) wird das Volumenverhältnis zwischen vorläufer-
und fettzellhaltigen Anteilen in den Markbröckeln ermittelt (HARVEY 1984; TYLER et
al. 1999). Da der Zellgehalt zwischen einzelnen Markbröckeln eines Knochenmark-
ausstrichs stark variiert, ist eine Beurteilung nur unter Einbeziehung möglichst vieler
Markbröckel sinnvoll (HARVEY 1984; GRINDEM 1989). Beim normozellulären
Knochenmark bestehen die Markbröckel beim adulten Hund nach SAAR (1973a) zu
50% und bei GRINDEM (1989) zu 50 bis 75% aus zellhaltigen Anteilen. Die
physiologische Zellularität unterliegt einem deutlichen Einfluss des Alters (GRINDEM
1989; TYLER et al. 1999). Bei TYLER et al. (1999) wird der Fettanteil bei Jungtieren
mit 25%, bei adulten mit 50% und bei alten Tieren mit bis zu 75% angegeben, ohne dass hierzu systematische Untersuchungsergebnisse vorliegen.
5.3. Myelogramm
Zur quantitativen Beurteilung der Knochenmarkausstriche werden bei 1000facher Vergrößerung (Ölimmersion), 500, 700 (HORN et al. 1953) oder 1000 (SAAR u.
ULRICH 1975) kernhaltige Zellen exakt differenziert. Die Ergebnisse werden prozentual in einem Myelogramm zusammengestellt. Dabei sollte sich die Zelldifferenzierung nur auf die Bereiche beschränken, in denen die Zellen einzeln nebeneinander vorliegen (SAAR 1973a). Dafür eignen sich insbesondere die Regionen neben den Markbröckeln, wo kernhaltige Vorläuferzellen in großer Zahl vorhanden sind (MISCHKE u. BUSSE 1998).
Tabelle 3 und 4 fassen die Referenzwerte des Myelogramms bei Hunden von insgesamt 14 Autoren zusammen. Der detaillierte Vergleich der Ergebnisse ist schwierig, da die Patientenzahl, das Alter der untersuchten Hunde, die Anzahl der differenzierten Zellen als auch die Terminologie von den einzelnen Autoren unterschiedlich gewählt worden ist. Dennoch können einige Teilergebnisse der Myelogramme gegenübergestellt werden. Der mittlere Anteil der Granulopoese differiert zwischen den einzelnen Studien stark. Bei STASNEY und HIGGINS (1937), die bei 20-35 Hunden Knochenmark an unterschiedlichen Lokalisationen entnehmen, variiert der Mittelwert der Granulopoese von 30,7 bis 38,5%. Dagegen findet sich der höchste Wert für den Median in der Literaturangabe mit 62,7% (36,7 - 90,1%;
Minimum-Maximum) bei den von REKERS u. COULTER (1948) untersuchten 36
gesunden Hunden. Während STASNEY und HIGGINS (1937) das Alter der Tiere
nicht angeben, sind die Patienten bei der Untersuchung von REKERS und
COULTER (1948) zwischen neun Monaten und zwei Jahren alt. Die gewählte
Ausstrichmethode wird bei beiden Studien nicht erwähnt. Im weiteren lassen sich
Unterschiede zwischen einzelnen Arbeiten auch beim Vergleich der Gesamtzahl der
Erythropoese erkennen. Mit 23,4% (Summe der arithmetischen Mittelwerte der
Erythro- und Proerythroblasten) findet sich bei ALEXANDROV (1928) die niedrigste
Angabe für den mittleren Anteil der kernhaltigen Zellen der Erythropoese. Die Werte
der genannten Studie wurden an 12 Hunden ermittelt. Keinerlei Informationen finden
sich hier zur gewählten Ausstrichmethode und untersuchten Zellzahl. Demgegenüber gibt die Untersuchung von STASNEY und HIGGINS (1937) mit 59,0 ± 1,1% bis 68,0
± 1,2% ( ± s) die höchsten Mittelwerte an. Der Anteil der Lymphozyten wird von vier Autoren unter 1% (VAN LOON u. CLARK 1943; REKERS u. COULTER 1948;
COLES 1986; JAIN 1986), von MELVEGER et al. (1969) hingegen mit 8,2 ± 2,7% bis 10,7 ± 2,7% ( ± s) angegeben. Sofern in das Myelogramm mit einbezogen, beträgt der Anteil der Megakaryozyten bis zu 0,5% (ALEXANDROV 1928; STASNEY u.
HIGGINS 1937; VAN LOON u. CLARK 1943; REKERS u. COULTER 1948;
MELVEGER et al. 1969; SAAR u. ULRICH 1975; COLES 1986). Der prozentuale Anteil der Megakaryoblasten - ausschließlich in der Studie von SAAR und ULRICH (1975) berücksichtigt – beträgt bezogen auf die Gesamtzahl der Knochenmarkzellen 0,01% (0- 0,2%; Minimum-Maximum).
Altersunterschiede werden in der zugänglichen Literatur bezüglich des Myelogramms gesunder Hunde nur bei zwei Studien berücksichtigt. Während EARL et al. (1973) die Ergebnisse wöchentlicher Untersuchungen postmortal entnommener Knochen- markproben bei Hunden bis zum Alter von 56 Tagen angeben, vergleicht MULLIGAN (1941) fünf Hunde im Alter zwischen zwei und sieben Monaten mit 35 adulten Tieren (Tab. 3 und 4). Mit 15,4% (7,8 - 31,3%; Minimum-Maximum) findet sich bei den 21 Tage alten Welpen der niedrigste mittlere Anteil der kernhaltigen Zellen der Erythropoese (EARL et al. 1973). Der Median des prozentualen Anteils der erythroischen Zellen wird bei den Junghunden bis sieben Monate dagegen mit 51,2%
angegeben (MULLIGAN 1941). Bezüglich des mittleren Gehalts der Granulopoese bei Welpen bzw. Junghunden bewegen sich die Literaturangaben zwischen 48,7 (33,4 -72,4%; Minimum-Maximum) (EARL et al. 1973) und 40,4% (MULLIGAN 1941).
Der Anteil der Lymphozyten ist bei den 21 Tage alten Welpen mit 54,7% (43,3 - 67,8%; Minimum-Maximum) sehr hoch (EARL et al. 1973) und liegt bei den Junghunden hingegen mit 1,2% (0,4 - 3%; Minimum-Maximum) im Bereich der Literaturangaben für die adulten Hunde.
Für die noch nicht geschlechtsreifen Welpen im Alter von einem Tag bis zwei Monate
finden sich hinsichtlich der untersuchten kernhaltigen Zellen der Hämatopoese
keinerlei Geschlechtsunterschiede (EARL et al. 1973).
Erläuterung zur Tabelle 3 und Tabelle 4:
eos. = eosinophil
I:M
G= Reifungsindex der Zellreihe der neutrophilen Granulozyten I:M
E= Reifungsindex der Zellreihe der Erythropoese
k. A. = keine Angabe
M:E-Index = Verhältnis zwischen myeloischen und erythroischen Zellen im Knochenmark
Max. = Maximum
Min. = Minimum
neutr. = neutrophil
polychr. = polychromatisch
s = Standardabweichung
= arithmetischer Mittelwert
* = Mittelwerte selbst errechnet
Tab. 3: Myelogramme und das Verhältnis zwischen myeloischen und erythroischen Zellen (M:E-Index) gesunder Welpen beiderlei Geschlechts im Alter von 1, 7, 14, 21, 28, 42 und 56 Tagen nach EARL et al. (1973)
Tab. 4: Literaturübersicht über Angaben zu Myelogrammen (prozentualer Anteil verschiedener kernhaltiger Zellen des Knochenmarks) gesunder Hunde (Erläuterung der Abkürzungen auf Seite 37)
Fortsetzung Tab. 4:
Fortsetzung Tab. 4:
