ISBN 978-3-86345-298-8
Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH 35392 Gießen · Friedrichstraße 17 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375
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V anessa Maria Pfankuche Hannover 2015
Deutschen Nationalbibliografie;
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2015
© 2015 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-298-8
Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17
35392 Gießen 0641/24466 info@dvg.de www.dvg.de
Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen zum onkolytischen Potenzial von Paramyxoviren am Beispiel des kaninen histiozytären
Sarkoms unter besonderer Berücksichtigung der Bedeutung des zytoskelettalen Proteins Cortactin
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Vanessa Maria Pfankuche
aus Korbach / Hessen
Hannover 2015
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D.
2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Gerd Bicker, Ph.D.
Tag der mündlichen Prüfung: 17.11.2015
Die Anfertigung dieser Arbeit wurde durch ein Stipendium der Akademie für Tiergesundheit e.V. gefördert.
Teile dieser Arbeit wurden auf der Jahrestagung der Fachgruppe Pathologie der Deutschen Veterinärmedizinischen Gesellschaft in Fulda (2015) präsentiert.
Puff, C., V. M. Pfankuche, I. Spitzbarth, S. Lapp, R. Ulrich, A. Kalkuhl, U. Deschl, W.
Baumgärtner:
Veränderung des Zelltranskriptoms kaniner histiozytärer Sarkomzellen (DH82-Zellen) durch eine persistierende Staupevirusinfektion
Tierärztliche Praxis Kleintiere 3/2015
Für meine Eltern, Großeltern, Kornelia und Herbert
Irgendwie geht alles
Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 4
2.1 Onkolytische Viren - Allgemein - ... 4
2.1.1 Onkolytische Viren - Geschichte - ... 5
2.1.2 Primäre Mechanismen onkolytischer Viren - direkte Zelllyse - ... 6
2.1.3 Sekundäre Mechanismen onkolytischer Viren - Immunantwort und Tumormikromilieu - ... 6
2.2 Paramyxoviren in der onkolytischen Virotherapie ... 15
2.2.1 Morbilliviren - Struktur - ... 15
2.3 Kanine histiozytäre Erkrankungen ... 24
2.3.1 Das kanine kutane Histiozytom ... 25
2.3.2 Die kutane Langerhans Zell-Histiozytose ... 25
2.3.3 Die reaktiven Histiozytosen ... 26
2.3.4 Der histiozytäre Sarkomkomplex... 27
2.3.5 Die permanente histiozytäre Sarkomzelllinie DH82 ... 30
2.4 Cortactin ... 31
2.4.1 Cortactin - Struktur - ... 32
2.4.2 Cortactin - Bindungspartner - ... 35
2.4.3 Cortactin - Modifikationen - ... 38
2.4.4 Cortactin - Zellausläufer - ... 39
3 Viral oncolysis - can insights from measles be transferred to canine distemper virus? ... 41 4 Morbillivirus triggered reduced angiogenic gene expression as a possible
mode of action of viral oncolysis in a canine translational model for histiocytic sarcoma ... 43 5 Persistent morbillivirus infection leads to an altered cortactin distribution
in histiocytic sarcoma cells with decreased cellular migration capacity .. 86 6 Diskussion... 134 6.1 Eine persistierende CDV-Ond-Infektion kaniner DH82-Zellen induziert eine
Veränderung ihres Transkriptoms ... 134 6.1.1 Eine persistierende CDV-Ond-Infektion führt zu einer Beeinflussung
biologischer Prozesse, die am Tumorwachstum beteiligt sind ... 135 6.1.2 Eine persistierende CDV-Ond-Infektion kaniner DH82-Zellen führt zu
einer Veränderung des Phänotyps Tumor-assoziierter Makrophagen .. 139 6.2 Eine persistierende CDV-Ond-Infektion führt zu einer reduzierten
Migrationsaktivität von DH82-Zellen ... 141 6.2.1 Transwell-Migrationsassay persistierend CDV-Ond-infizierter DH82-
Zellen und nicht infizierter Kontrollen ... 142 6.2.2 Eine persistierende CDV-Ond-Infektion kaniner DH82-Zellen führt zu
einer Modifikation Invadopodien-assoziierter Gene ... 142 6.2.3 Eine persistierende CDV-Ond-Infektion kaniner DH82-Zellen führt zu
einer verminderten Expression des zytoskelettalen Proteins Cortactin 143
Inhaltsverzeichnis III
6.3 CDV als onkolytisches Virus in vitro und Translation der Ergebnisse auf den
Menschen ... 148
7 Zusammenfassung ... 151
8 Summary ... 154
9 Literaturverzeichnis ... 157
10 Anhang ... 208
10.1 Material und Methoden ... 208
10.1.1Zellkulturarbeiten ... 208
10.1.2Microarray-Analysen ... 221
10.2 Übersicht weiterer Ergebnisse ... 224
10.2.1Immunfluoreszenz... 224
10.2.2Western Blot ... 242
10.3 Bezugsquellen verwendeter Materialien ... 243
10.3.1Bezugsquellen von Antikörpern, Chemikalien, Reagenzien, Zellen und Viren ... 243
10.3.2Bezugsquellen für Geräte, Programme und Einmalartikel ... 247
10.4 Lösungen und Puffer ... 252
10.4.1Lösungen für die Zellkultur ... 252
10.4.2Lösungen und Puffer für die Immunfluoreszenz ... 253
10.4.3Lösungen und Puffer für den Western Blot ... 254
10.4.4Färbelösungen ... 256
10.5 Abkürzungsverzeichnis ... 258 11 Danksagung ... 264
Einleitung 1
1 Einleitung
Neoplasien stellen eine der häufigsten Todesursachen bei Menschen und Tieren dar (Adams et al., 2010; Jemal et al., 2011; Lapp et al., 2014; Proschowsky et al., 2003).
Aufgrund des häufig nur palliativen Charakters diverser Behandlungsmethoden, steht die Entwicklung neuartiger Behandlungsschemata permanent im Fokus der Wissenschaft (Patil et al., 2012). Einen vielversprechenden Ansatz stellt die virale Onkolyse dar. Bei onkolytischen Viren handelt es sich um virale Organismen, die zur Tumortherapie eingesetzt werden. Sie sollen gezielt neoplastische Zellen, bei gleichzeitiger Schonung nicht-transformierten Gewebes, zerstören und so zu einer Reduktion neoplastischer Zellen führen (Bourke et al., 2011; Chiocca, 2002; Parato et al., 2005). Verschiedene, diesen Beobachtungen potentiell zugrundeliegende, Mechanismen werden diskutiert. Als ein primärer Mechanismus onkolytischer Viren wird die direkte Zelllyse an sich betrachtet, während sekundäre Mechanismen eine Beeinflussung des Tumormikromilieus, beispielsweise der vaskulo- und angiogenesefördernden und -hemmenden Faktoren, und eine Virus-induzierte Immunantwort mit konsekutiver Zerstörung neoplastischer Zellen darstellen (Chu et al., 2004; Gentschev et al., 2014; Lapp et al., 2014; Ring, 2002). Vielversprechende Ansätze im Bereich der viralen Onkolyse sind bereits für diverse Viren beschrieben.
Ein onkolytisches Potenzial, das teilweise bereits in klinischen Studien getestet wurde, wird unter anderem Mitgliedern der Familien Paramyxoviridae (u. a. Masernvirus und Newcastle Disease Virus), Poxviridae (Vacciniavirus), Reoviridae (Reovirus), Adenoviridae (Adenovirus), Orthomyxoviridae (Influenzavirus), Herpesviridae (Herpes simplex Virus Typ 1), Picornaviridae (Coxsackievirus) und Rhabdoviridae (vesikuläres Stomatitis Virus; Parato et al., 2005) zugeschrieben. Sie werden sowohl unverändert als auch durch Rekombination und Transgene modifiziert, zur Therapie unterschiedlicher Neoplasien getestet (Liu et al., 2007). Der Einfluss und die genaue Funktionsweise onkolytischer Viren auf neoplastische Zellen sind bislang noch teilweise ungeklärt und bedürfen weiterer Studien (Gentschev et al., 2014; Patil et al., 2012).
Einen häufig bei Hunden und seltener bei Menschen auftretenden Tumor mit sehr schlechter Prognose und bislang nur eingeschränkter Behandelbarkeit stellt das
histiozytäre Sarkom dar (Fidel et al., 2006; Hedan et al., 2011; Hornick et al., 2004;
Saboo et al., 2012; Schlick et al., 2012; Vos et al., 2005). Kanine histiozytäre Sarkome treten in der lokalisierten und disseminierten Form auf und betreffen vor allem Hunde der Rassen Berner Sennenhund, Rottweiler, Golden, Labrador und Flat Coated Retriever sowie Pembroke Welsh Corgies (Affolter und Moore, 2002; Kagawa et al., 2015; Mariani et al., 2015). Das lokalisierte histiozytäre Sarkom tritt vor allem gelenknah in der Subkutis der Gliedmaßen auf, wobei eine häufige Infiltration der Tumorzellen in die tiefe Dermis und das angrenzende Muskelgewebe und die Faszien zu beobachten ist (Affolter und Moore, 2002). Primärläsionen des disseminierten histiozytären Sarkoms werden hingegen hauptsächlich in der Milz, Leber, Lunge, dem Knochenmark und in den Lymphknoten beschrieben (Affolter und Moore, 2002).
Insbesondere der disseminierten Variante des histiozytären Sarkoms wird ein sehr aggressives Verhalten mit schlechter Prognose, teils aufgrund einer akuten rapiden Verschlechterung und fehlender Antwort auf Chemotherapeutika, zugeschrieben (Affolter und Moore, 2002).
Das kanine Staupevirus (CDV) ist ein weltweit auftretendes Virus, das in Familien der Ordnung Carnivora als Auslöser schwerwiegender Erkrankungen bekannt ist (Deem et al., 2000; Lempp et al., 2014). CDV gehört, wie auch das humane Masernvirus zum Genus der Morbilliviren und zur Familie Paramyxoviridae. Es werden teils große Variationen in der Dauer, der Klinik und dem Schweregrad der Erkrankung beschrieben (Beineke et al., 2009), die vor allem im Alter der Tiere, dem Immunstatus der Tiere und dem Erregerstamm begründet sind. Sowohl symptomlose Verläufe als auch Krankheitsverläufe mit einer Mortalität von bis zu 50% werden beobachtet (Beineke et al., 2009; Lempp et al., 2014).
Cortactin stellt ein oftmals in humanen Tumoren überexprimiertes Protein dar, das häufig mit einer schlechteren Prognose assoziiert ist (Kirkbride et al., 2011; Wu et al., 1991; Wu und Parsons, 1993). Cortactin ist ein Mitglied des Aktinzytoskeletts und im Rahmen der Aktivierung der Aktinpolymerisation und der Bildung von Zellausläufern essentiell für die Zellmigration (Schuuring et al., 1993; Wu et al., 1993). Daher ist es
Einleitung 3
ebenfalls bedeutsam im Rahmen der Metastasierung, ein Prozess der häufig für die schlechte Prognose diverser Neoplasien verantwortlich ist (Bergman et al., 2014). Eine Beeinflussung von Cortactin im Sinne einer verminderten Expression oder Aktivität, durch eine Virusinfektion könnte daher einen neuen Ansatzpunkt der viralen Tumortherapie darstellen, um eine Metastasierung von Tumoren zu verhindern und die Prognose zu verbessern.
Aufgrund der engen Verwandtschaft des kaninen Staupevirus mit dem humanen Masernvirus, das bereits in klinischen Studien in der Humanmedizin als onkolytisches Virus getestet wird, wurden die potentiellen onkolytischen Eigenschaften des attenuierten, kaninen Staupevirus-Stammes Onderstepoort nach Infektion der kaninen histiozytären Sarkomzellinie DH82 untersucht und diskutiert.
Im ersten Abschnitt der vorliegenden Studie wurde das kanine Staupevirus, anhand einer vergleichenden Literaturübersicht, als potentielles onkolytisches Virus, diskutiert.
Augenmerk fiel auf das kanine Staupevirus aufgrund seiner engen Verwandtschaft zum humanen Masernvirus, das in der Humanmedizin bereits für seine onkolytischen Fähigkeiten bekannt ist.
Der zweite Teil der Arbeit behandelt die Unterschiede des Transkriptoms nicht- infizierter und persistierend mit dem kaninen Staupevirus-Stamm Onderstepoort infizierter DH82-Zellen anhand von Microarray-Analysen und diskutiert potentielle Signaltransduktionswege onkolytischer Viren anhand auf- und abregulierter Gene verschiedener biologischer Prozesse.
Der dritte Teil der Arbeit untersucht das Migrationsverhalten nicht-infizierter und persistierend mit dem kaninen Staupevirus-Stamm Onderstepoort infizierter DH82- Zellen unter besonderer Berücksichtigung des häufig in humanen Tumoren überexprimierten Proteins Cortactin.
2 Literaturübersicht
2.1 Onkolytische Viren - Allgemein -
Die Tatsache, dass Neoplasien bei Hunden und Menschen eine der häufigsten natürlichen Todesursachen darstellen, rückt die Entwicklung alternativer und neuartiger Behandlungsmethoden permanent in den Fokus der Wissenschaft (Adams et al., 2010; Jemal et al., 2011; Lapp et al., 2014; Proschowsky et al., 2003). Die Diversität von Neoplasien zwingt die Mediziner dazu, speziell an den Tumor angepasste Behandlungsschemata zu generieren. Allerdings stoßen die zurzeit in der Human- und Veterinärmedizin gängigen und etablierten Behandlungsmethoden immer wieder an ihre Grenzen. Sie stellen teilweise lediglich palliative Maßnahmen der Tumorbehandlung dar (Patil et al., 2012). Zu ihnen zählen die Tumorentfernung mittels chirurgischer Eingriffe, Bestrahlung, Chemotherapie, Hyperthermiebehandlung, Immuntherapie und photodynamischer Therapie sowie häufig Kombinationen aus diesen (Agostinis et al., 2010; Jagsi, 2013; Lana et al., 2006; Patil et al., 2012). Die virale Onkolyse stellt daher einen vielversprechenden neuen und dennoch altbekannten Ansatz der Tumortherapie dar. Onkolytische Viren besitzen die Fähigkeit, neoplastische Zellen unter gleichzeitiger, weitestgehender Schonung unveränderten Gewebes zu zerstören. Diese vorrangige Zerstörung von Tumorzellen durch onkolytische Viren basiert auf der Eigenschaft vieler aggressiver Tumorzellen eine verminderte antivirale Antwort und eine erhöhte Toleranz für die virale Replikation zu besitzen (Bourke et al., 2011; Chiocca, 2002; Parato et al., 2005). Auch andere Erklärungen für diese Tumorzell-Selektivität bestimmter Viren bestehen. Parvoviren beispielsweise sind DNS-Viren, die in ihrer Replikation darauf angewiesen sind, dass sich Zellen in ihrer S-Phase befinden. Daher ist anzunehmen, dass die Selektivität von Parvoviren, insbesondere neoplastische Zellen zu zerstören, auf die beeinträchtigte Zellzykluskontrolle in transformierten Zellen zurückgeht (Ring, 2002). Neben dieser natürlich vorhandenen Neigung selektiv Tumorzellen zu infizieren, existieren diverse Ansätze der Modifikation, um diese Selektivität onkolytischer Viren zu erhöhen (Lapp et al., 2014).
Literaturübersicht 5
2.1.1 Onkolytische Viren - Geschichte -
Der Einfluss verschiedenster Viren auf den Rückgang von Neoplasien ist bereits seit Beginn des 20. Jahrhunderts bekannt. N. G. de Pace stellte 1910 auf dem Internationalen Krebskongress in Paris den Fall einer spontanen Regression eines Zervixkarzinoms einer Frau infolge einer Tollwutimpfung vor (Sinkovics und Horvath, 2008). Es existieren viele Berichte ähnlicher, häufig zufällig erfolgreicher Tumortherapien mit onkolytischen Viren aus den folgenden Jahrzehnten und Berichte über prä-klinische und klinische Testreihen in den 1950er und 1960er Jahren (Patil et al., 2012; Vähä-Koskela et al., 2007). Aufgrund häufig festgestellter Nebeneffekte der Virusinfektionen, folgte eine Zeit, in der nur wenige Studien über onkolytische Viren veröffentlicht wurden. Seit Beginn der 90er Jahre des letzten Jahrhunderts erlebt die virale Onkolyse ob des enormen Zugewinns an Erkenntnissen auf dem Gebiet der Virologie und modernen Biotechnologie, die eine Modifikation von Viren ermöglichen, ein erneutes Hoch (Vähä-Koskela et al., 2007). Verschiedensten Viren wird ein onkolytisches Potenzial zugesprochen, das teilweise bereits in klinischen Studien getestet wird, so unter anderem Mitgliedern der Familien Paramyxoviridae (Masernvirus und Newcastle Disease Virus), Poxviridae (Vacciniavirus), Reoviridae (Reovirus), Adenoviridae (Adenovirus), Orthomyxoviridae (Influenzavirus), Herpesviridae (Herpes simplex Virus Typ 1), Picornaviridae (Coxsackievirus) und Rhabdoviridae (vesikuläres Stomatitis Virus; Parato et al., 2005). Sowohl unveränderte als auch rekombinante und transgene Viren werden zur Therapie unterschiedlicher Neoplasien getestet (Liu et al., 2007). Ziel aller Testreihen ist eine möglichst vollständige Zerstörung neoplastischer Zellen unter gleichzeitiger Schonung des nicht- transformierten Gewebes. Der Einfluss und die genaue Funktionsweise onkolytischer Viren auf neoplastische Zellen sind bislang noch teilweise ungeklärt und bedürfen weiterer Studien (Gentschev und Patil, 2014; Patil et al., 2012).
Im Allgemeinen beruht der Erfolg onkolytischer Viren in der Tumortherapie auf verschiedenen Ansatzpunkten. Zum einen sind Viren in der Lage durch direkte Zelllyse auf neoplastische Zellen einzuwirken (Gentschev und Patil, 2014; Patil et al., 2012).
Zum anderen ist auch eine Schädigung bzw. Zerstörung neoplastischer Zellen durch die Induktion immunmodulierender Mechanismen und Veränderungen im
Tumormikromilieu möglich (Gentschev und Patil, 2014; Patil et al., 2012). Eine Kombination dieser Mechanismen ist als sehr wahrscheinlich anzusehen (Gentschev und Patil, 2014; Patil et al., 2012).
2.1.2 Primäre Mechanismen onkolytischer Viren - direkte Zelllyse -
Diverse onkolytische Viren, wie z. B. Adenoviren, sind in der Lage Tumorzellen zu zerstören, indem sie in die Zelle gelangen, ihr Genom in das der Wirtszelle integrieren, replizieren und eine Freisetzung von Virionen bewirken, indem die Wirtszelle zerstört wird (Chu et al., 2004). Es existieren verschiedene Wildtyp-Viren, die eine tumorzellspezifische Zell-Lyse induzieren können. Dazu gehören unter anderem Newcastle Disease Virus, vesikuläres Stomatitis Virus, Vaccinia Virus, Reovirus und autonom-replizierende Parvoviren (Chu et al., 2004; Ring, 2002).
2.1.3 Sekundäre Mechanismen onkolytischer Viren - Immunantwort und Tumormikromilieu -
Einen sekundären Mechanismus der Tumorzellzerstörung stellt zum einen die Aufregulierung des angeborenen oder erworbenen Immunsystems mit einhergehender Tumorzell-Lyse dar. So kann eine Major Histocompatibility complex I (MHC-I) vermittelte Präsentation von viralem Protein mit konsekutiver Induktion einer CD8+ T-Zellantwort die Zellschädigung neoplastischer Zellen initiieren (Lapp et al., 2014). Als ein weiterer Mechanismus der Virus-induzierten Aufregulierung des Immunsystems rücken Tumor-assoziierte Makrophagen des Tumormikromilieus immer mehr in den Fokus. Das Tumormikromilieu setzt sich aus den, die Tumorzellen umgebenden, stromalen Zellen, wie Fibroblasten und Endothelzellen, Zellen des Immunsystems und der extrazellulären Matrix mitsamt seiner darin löslichen Faktoren zusammen (Wojton und Kaur, 2012). Makrophagen werden anhand ihrer Expressionsmuster in verschiedene Kategorien eingeteilt. Der M1- und der M2- Phänotyp stellen innerhalb dieser Charakterisierung die beiden Extreme dar.
Allerdings sind viele Zwischenstufen bereits bekannt (Allavena et al., 2008; Mantovani
Literaturübersicht 7
et al., 2004; Martinez et al., 2006; Schmieder et al., 2012; Sica et al., 2006).
Makrophagen vom M1-Phänotyp sind bekannt für ihre Rolle in der Immunantwort, vor allem im Entzündungsgeschehen. Ihnen obliegt die Ausschüttung diverser pro- inflammatorischer und tumorizider Faktoren, wie Tumor-Nekrose-Faktor, Interleukin- 12, reaktiven Stickstoffverbindungen und reaktiven Sauerstoffspezies mit Induktion einer überwiegend Th1 (T-Helferzelle 1) vermittelten Immunantwort (Schmid und Varner, 2010). Makrophagen vom M2-Phänotyp hingegen sind durch ihre immunsuppressiven Eigenschaften als tumorprogressive Makrophagen bekannt (Allavena et al., 2008; Mantovani et al., 2004; Martinez et al., 2006; Schmieder et al., 2012; Sica et al., 2006). Sie schütten Zytokine, wie Interleukin-10 aus und induzieren eine Th2-Immunantwort (Schmid und Varner, 2010). Die klassische Aktivierung von Monozyten und residenten Makrophagen erfolgt im Wesentlichen durch Interferon- gamma, Interleukin-12 und Interleukin-18. Sie geht mit einer Polarisierung zum M1- Phänotyp einher. Mittels Interleukin-4 und Interleukin-13 erfolgt im Rahmen des alternativen Weges der Aktivierung eine Polarisierung zum M2-Phänotyp, der innerhalb des Tumormikromilieus den vorherrschenden Typ darstellt (Allavena et al., 2008; Mantovani et al., 2004; Martinez et al., 2006; Schmid und Varner, 2010;
Schmieder et al., 2012; Sica et al., 2006). Eine Virus-induzierte Umprogrammierung des tumorprogressiven M2-Phänotyps der Makrophagen hin zum tumorsuppressiven M1-Phänotyp innerhalb und in der Umgebung der Neoplasie stellt daher einen vielversprechenden Ansatz zur Beeinflussung des Tumormikromilieus durch Viren dar (Guo et al., 2013; Hagemann et al., 2008; Lapp et al., 2014).
Große Bedeutung kommt innerhalb des Tumormikromilieus ebenfalls der Regulation der Gefäßversorgung der Neoplasien zu (Gentschev et al., 2014). Ab einem Durchmesser von 1 bis 2 mm benötigen solide Tumoren eine eigene Gefäßversorgung (Kumar et al., 2010). Bei der Gefäßversorgung unterscheidet man zwischen Neoangiogenese und Vaskulogenese (Kumar et al., 2010; Weis und Cheresh, 2011).
Der Begriff Neoangiogenese beschreibt das Einsprossen von Gefäßen aus der Umgebung, während der Begriff Vaskulogense die de novo Synthese von Blutgefäßen durch die Rekrutierung endothelialer Vorläuferzellen aus dem Knochenmark beschreibt (Kumar et al., 2010; Weis und Cheresh, 2011). Eine Veränderung im
Tumormikromilieu kann die Gefäßversorgung der Tumorzellen initiieren. Diese wird als angiogenetic switch bezeichnet und beschreibt das Überwiegen proangiogenetischer, verglichen mit antiangiogenetischen, Faktoren im Tumormikromilieu (Baeriswyl und Christofori, 2009; Bergers und Benjamin, 2003; Folkman et al., 1989; Ribatti et al., 2007).
2.1.3.1 Sekundäre Mechanismen onkolytischer Viren - Tumormikromilieu und proangiogenetische Faktoren -
Potente proangiogenetische Faktoren werden durch Mitglieder der vascular endothelial growth factor (VEGF)-Familie repräsentiert. Daher ist der VEGF-Signalweg ein Angriffspunkt diverser Tumortherapeutika. Ziel ist es, die Bindung von VEGF an seinen Rezeptor zu verhindern (Lauro et al., 2014; Shibuya et al., 2014). Auch in der onkolytischen Virotherapie humaner und kaniner Neoplasien existieren Veröffentlichungen über Modifikationen von Viren, die diesen Signalweg beeinträchtigen sollen. Patil et al., (2012) beschreiben die Verwendung eines Vacciniavirus-Stammes in Mäusen mit Xenotransplantaten kaniner Prostatakarzinom- und Weichteilsarkomzellen, der durch einen anti-VEGF-Antikörper modifiziert ist. In dem Tiermodell mit systemischer Virusverabreichung wurden ein vermindertes Tumorwachstum und eine Hemmung der Angiogenese beobachtet (Patil et al., 2012).
Die VEGF-Familie setzt sich aus mehreren Mitgliedern, wie VEGFA, VEGFB, VEGFC, VEGFD und plazentalem Wachstumsfaktor (placental growth factor; PlGF) zusammen (Takahashi, 2011). Die proangiogenetischen Eigenschaften von VEGFA sind im Gegensatz zu den Eigenschaften von VEGFB unstrittig (Albrecht et al., 2010;
Angelescu et al., 2012; Gollmer et al., 2000; Li et al., 2012; Stephan und Brock, 1996;
Vecchione et al., 2013). VEGFA kommt in vier Isoformen vor, VEGF121, VEGF165, VEGF189 und VEGF206, die durch alternatives messenger Ribonukleinsäure (mRNS)-Splicing entstehen. VEGF165 kommt in Bezug auf die Menge und die biologische Aktivität die größte Bedeutung zu und seine Überexpression, die in vielen humanen (Ishigami et al., 1998; Kaya et al., 2000; Meada et al., 1996) sowie kaninen (Giantin et al., 2012) Neoplasien beobachtet werden kann, ist mit Progression,
Literaturübersicht 9
Invasion und Metastasierung von Tumorzellen korreliert (Ishigami et al., 1998; Kaya et al., 2000; Meada et al., 1996; Takahashi, 2011). VEGFA wird bei hypoxischen Bedingungen innerhalb des Tumormikromilieus von Tumor-assoziierten Makrophagen ausgeschüttet, um eine Gefäßversorgung mit konsekutiver Sauerstoffzufuhr zu gewährleisten (Galdiero et al., 2013). PlGF werden ebenfalls schwache proangiogenetische Eigenschaften zugeschrieben (Takahashi, 2011). Gleiches gilt für VEGFB (Scotney et al., 2002; Takahashi, 2011), wobei viele widersprüchliche Berichte existieren (Li et al., 2012). VEGFB wurde 1996 als ein VEGFA-Homolog entdeckt und kommt, bedingt durch alternatives Splicing, in zwei Isoformen vor, VEGFB167 und VEGFB186. Unter degenerativen Bedingungen agiert VEGFB hauptsächlich als Überlebensfaktor (survival factor), um Zellen vor dem Zelluntergang zu schützen (Li et al., 2012). Während der Entwicklung oder gewissen pathologischen Begebenheiten, wie beispielsweise der Tumorentstehung, hingegen, wirkt VEGFB vor allem als anti- Wachstums- und anti-Angiogenese-Faktor. Aufgrund dieser teilweise widersprüchlichen Wirkungsweisen, die durch unterschiedliche Bedingungen induziert werden können, ist es schwierig, VEGFB eine eindeutige, konstante Funktion zuzuteilen (Li et al., 2012).
VEGFC spielt eine große Rolle in der embryonalen Lymphangiogenese (Karkkainen et al., 2004). Allerdings sind auch Studien bekannt, die VEGFC und seinem Rezeptor VEGF-Rezeptor-3 einen Einfluss auf die erhöhte Tumorzellbewegung und Invasionskapazität, einhergehend mit einer erhöhten Metastasierungsrate beim Menschen, zuschreiben (Su et al., 2006; Su et al., 2007). In kaninen Mammakarzinomen zeigt sich eine positive Korrelation zwischen der VEGFC- Expression und dem Auftreten von Lymphknotenmetastasen (Qiu et al., 2008).
VEGFC und VEGFD stellen die best-charakterisiertesten, lymphangiogenetischen Wachstumsfaktoren dar (Achen et al., 1998; Choi et al., 2008). Diverse Studien haben eine positive Korrelation zwischen der VEGFD-Expression und der Metastasierung von Tumorzellen, wie kolorektalen (White et al., 2002), Mamma- (Nakamura et al., 2003), Pankreas- (Kurahara et al., 2004), Ovar- (Yokoyama et al., 2003), endometrialen (Yokoyama et al., 2003) und Magen-Karzinomzellen (Choi et al., 2008) in Lymphknoten beim Menschen beschrieben.
Die der VEGF-Familie zugehörigen Rezeptoren sind die VEGF-Rezeptoren (VEGFR)- 1, -2 und -3. Bei den VEGFR handelt es sich um Rezeptortyrosinkinasen, die eine extrazelluläre Bindungsstelle besitzen, die jeweils sieben Immunglobulin-ähnliche Schleifen (loops), eine transmembranöse Domäne und eine zytoplasmatische Tyrosinkinase besitzen (Ferrara et al., 2003; Li et al., 2012). Zusätzlich werden sogenannte Co-Rezeptoren, wie die Neuropiline (NRP)-1 und -2 und Heparansulfatproteoglykane beschrieben (Ferrara et al., 2003; Kowanetz und Ferrara 2006; Takahashi und Shibuya, 2005). Die NRPs haben eine extrazelluläre Bindungsstelle, bestehend aus vier bestimmten extrazellulären Domänen, eine transmembranöse Domäne und eine kurze zytoplasmatische Domäne, die keine intrinsische Kinaseaktivität besitzt (Goel und Mercurio, 2013). Sie sind als Co- Rezeptoren in der Lage, Komplexe mit den anderen VEGF-Rezeptoren einzugehen, um deren Affinität zu ihrem jeweiligen Liganden zu erhöhen (Goel und Mercurio, 2013;
Wild et al., 2012). Die Mitglieder der VEGF-Familie binden gezielt an bestimmte dieser Rezeptoren. Allerdings besitzen VEGFs und ihre Rezeptoren eine große Anzahl an unterschiedlichen Varianten, teilweise durch alternatives Splicing, teilweise durch unterschiedliche proteolytische Spaltung, die wiederum unterschiedliche Affinitäten zueinander besitzen (Cébe-Suarez et al., 2006; Li et al., 2012; Robinson und Stringer, 2001; Takahshi und Shibuya, 2005). Zusätzlich wird das Vorkommen löslicher Rezeptorvarianten mit unterschiedlichen, teils antagonistischen, Wirkungen beschrieben (Goel und Mercurio, 2013; Ferrara et al., 2003; Wild et al., 2012).
Aufgrund dieser Komplexität zeigt Abbildung 2.1 eine nach aktuellem Kenntnisstand vereinfachte Darstellung der VEGF-Rezeptoren und ihrer bevorzugten Liganden.
VEGFR-2 wird durch seine Funktion als Hauptvermittler der durch VEGF-induzierten Endothelzellantwort eine Rolle als bedeutender Signalgeber in der physiologischen und pathologischen Angiogenese zugeschrieben (Kowanetz und Ferrara, 2005). Der vereinfachte Signalweg dieses Rezeptors sowie die Aufgaben der übrigen VEGF- Rezeptoren sind in Abbildung 2.1 zu sehen (modifiziert nach: Kowanetz und Ferrara, 2006; Takahashi und Shibuya, 2005). Auch bezüglich der Lokalisation unterscheiden sich die Rezeptoren. VEGFR-1 und -2 werden hauptsächlich auf Endothelzellen und hämatopoetischen Stammzellen exprimiert. VEGFR-1 ist ebenso auf Monozyten und
Literaturübersicht 11
Makrophagen lokalisiert. Im Gegensatz dazu ist der VEGFR-3 hauptsächlich auf lymphatischen Endothelzellen zu finden (Takahashi, 2011). Neuropiline werden auf diversen Epithelzellen exprimiert (Wild et al., 2012). Das Vorkommen dieser Rezeptoren und ihrer Liganden ist zusätzlich auf vielen humanen Tumorzellen beschrieben (Goel und Mercurio, 2013).
Abbildung 2.1:
Nach aktuellem Kenntnisstand kann VEGFA sowohl an VEGFR-1 und VEGFR-2 binden. VEGFB hingegen bindet ebenso wie PIGF an VEGFR-1. VEGFC und VEGFD sind in der Lage an VEGFR-2 und VEGFR-3 zu binden (Achen et al., 1998; Li et al., 2012). Allerdings bestehen, abhängig von der Spleißvariante oder der proteolytischen Spaltung, große Unterschiede in der Affinität von Ligand zu Rezeptor (Cébe-Suarez et al., 2006; Li et al., 2012; Robinson und Stringer 2001; Takahashi und Shibuya, 2005).
Die VEGFR-2-induzierten Signalwege sind in humanen Endothelzellen relativ gut untersucht und verstanden. Nach VEGFA-Bindung kommt es an Y1175 im humanen VEGFR-2 zur Autophosphorylierung. Dadurch wirkt es als Ansatzpunkt der Phospholipase C-gamma, die nach eigener Phosphorylierung und Aktivierung indirekt die Aktivierung des MAPK-Signalweges bedingt. Dadurch wird die Zellproliferation geregelt (Kowanetz und Ferrara, 2006; Takahashi et al., 2001). Die Phosphatidylinositol-3´-Kinase-Aktivität ist wichtig für die Endothelzellmigration.
Außerdem bewirkt sie im Zuge der weiteren Proteinkinase B -Aktivierung einen endothelial nitric oxide synthase (eNOS) bedingten Anstieg der Stickoxidproduktion mit konsekutiver Steigerung der Gefäßpermeabilität. Auch das Überleben der Endothelzelle wird über die Proteinkinase B reguliert (Kowanetz und Ferrara, 2006).
Eine weitere Autophosphorylierungsstelle im humanen VEGFR-2 stellt Y1214 dar.
Diese ist beteiligt an der Aktivierung von Cdc42 und der p38-mitogenaktivierten Proteinkinase, ein Signalweg, der die Zellmotilität reguliert. Die VEGFR-2 bedingte Aktivierung der fokalen Adhäsionskinase und seines Substrats Paxillin reguliert die Endothelzellmotilität (modifiziert nach: Abedi und Zachary, 1997; Kowanetz und Ferrara, 2006; Takahashi und Shibuya, 2005).
Literaturübersicht 13
Abbildung 2.1 (Fortsetzung):
Abbildung 2.1: Vereinfachte Darstellung der VEGF-Rezeptoren und ihrer bevorzugten Liganden (modifiziert nach: Abedi und Zachary, 1997; Kowanetz und Ferrara, 2006; Takahashi und Shibuya, 2005)
Abbildung 2.1 (Fortsetzung):
Legende:
VEGFA: vascular endothelial growth factor A VEGFB: vascular endothelial growth factor B VEGFC: vascular endothelial growth factor C VEGFD: vascular endothelial growth factor D PlGF: placental growth factor
VEGFR-1 (Flt-1): vascular endothelial growth factor receptor 1 (Fms-related tyrosine kinase 1)
VEGFR-2 (KDR/Flk-1): vascular endothelial growth factor receptor 2; (kinase insert domain receptor/fetal liver kinase-1)
VEGFR-3 (Flt-4): vascular endothelial growth factor receptor 3 (Fms-related tyrosine kinase 4)
PLC-γ: Phospholipase C-γ PKC: Proteinkinase C
MEK (MAPKK): Mitogenaktivierte Proteinkinase-Kinase
MAPK (ERK): Mitogenaktivierte Proteinkinase (extracellular-signal regulated kinase) FAK: fokale Adhäsionskinase
Cdc42: cell division control protein 42
p38 MAPK: p38-mitogenaktivierte Proteinkinase PI3K: Phosphatidylinositol 3′-Kinase
Akt/PKB: Proteinkinase B
eNOS: endothelial nitric oxide synthase
Literaturübersicht 15
2.1.3.2 Sekundäre Mechanismen onkolytischer Viren - Tumormikromilieu und antiangiogenetische Faktoren -
Neben vaskulo- und angiogenesefördernden Proteinen, wie den Mitgliedern der VEGF-Familie, existieren auch potente Angiogeneseinhibitoren, die von Zellen abgegeben werden und das Tumormikromilieu beeinflussen können. So beschreiben Brunner et al. (2012) die Abspaltung des Calretikulin-N-Terminus nach einer Staupevirusinfektion von Verozellen. Der Calretikulin-N-Terminus ist auch unter dem funktionshinweisenden Namen Vasostatin bekannt (Pike et al., 1998; Pike et al., 1999).
Dieses wird infolge der Staupevirusinfektion aus der Zelle ausgeschleust und kann so seine angiogeneseinhibierende Wirkung entfalten (Brunner et al., 2012).
2.2 Paramyxoviren in der onkolytischen Virotherapie
Aus der Familie Paramyxoviridae sind unter anderem Masernviren bereits lange als vielversprechende Viren in der onkolytischen Virotherapie bekannt (Lapp et al., 2014).
2.2.1 Morbilliviren - Struktur -
Das humane Masernvirus (MV) und das kanine Staupevirus (canine distemper virus;
CDV) gehören zum Genus der Morbilliviren. Morbilliviren stellen negativ-orientierte, behüllte, einzelsträngige RNS-Viren aus der Familie Paramyxoviridae dar. Das Genom kodiert für sechs Struktur- und zwei Nichtstruktur-Proteine (Beineke et al., 2009; Diallo, 1990; Hall et al., 1980; Lamb und Kolakofsky, 2001; Lempp et al., 2014; Ludlow et al., 2009; Örvell 1980; Wild et al., 1991). Das Nukleokapsidprotein (N) und der Polymerase-Komplex, der aus dem large polymerase Protein (L) und dem Phosphoprotein (P) besteht und zusammen mit der viralen RNS den Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex bildet und das Matrixprotein (M), das mit dem RNP- Komplex und der Hülle kommuniziert, stellen Proteine dar, die wichtig für die Replikation des viralen Genoms sind. In der Lipidhülle, die das Virion umgibt, sind die beiden Oberflächenglykoproteine F und H lokalisiert, die den Eintritt des Virus in die Wirtszelle und den Austritt aus der Wirtszelle heraus vermitteln. Das
Hämagglutininprotein interagiert mit dem auf den Wirtszellen lokalisierten Rezeptor.
Eine pH-Wert unabhängige Konformationsänderung des Fusionsproteins sorgt anschließend für die Aufnahme des viralen Kern-Komplexes in das Wirtszellzytoplasma (Beineke et al., 2009; Diallo, 1990; Hall et al., 1980; Lamb und Kolakofsky, 2001; Lempp et al., 2014; Ludlow et al., 2009; Örvell, 1980; Wild et al., 1991). Die beiden Nichtstrukturproteine C und V werden ebenfalls vom P-Gen kodiert (Yanagi et al., 2006).
2.2.1.1 Das humane Masernvirus - Pathogenese -
Neben den allseits bekannten typischen klinischen Symptomen einer akuten Masernvirusinfektion, wie Fieber und Hautausschlag, kommt es zusätzlich zu einer starken Immunsuppression durch die Infektion von Blutleukozyten mit konsekutiver Zelllyse und Zellverlust, die Sekundärinfektionen begünstigt (de Vries et al., 2012;
Ludlow et al., 2009; Schneider-Schaulies et al., 2001). Diese generalisierte Immunsuppression wird verstärkt durch eine Virus-induzierte, Kontakt-bedingte Proliferationshemmung lymphatischer Zellen mit Zellverlust (Erlenhoefer et al., 2001;
Schlender et al., 1996; Schneider-Schaulies et al., 2001). Hauptsächlich bei subakuten und chronischen Masernvirusinfektionen werden auch neurologische Krankheitsbilder, wie die primäre Masern-Enzephalitis, die Einschlusskörperchen-Enzephalitis und die subakute, sklerosierende Panenzephalitis beschrieben (Ludlow et al., 2009). Das Masernvirus gelangt nach Inhalation von Aerosolen oder Sekreten in den Respirationstrakt und kann von dort in die regionären Lymphknoten gelangen oder über die Tonsillen zur Virämie und systemischer Erkrankung führen (de Vries et al., 2012; Ludlow et al., 2009). Die Infektion lymphatischer Zellen durch das humane Masernvirus erfolgt durch die Bindung des viralen Hämagglutinin-Glykoproteins (H) an den Rezeptor CD150 (cluster of differentiation 150; signaling lymphocyte activation molecule, SLAM), der die Anheftung des Virus an die Wirtszelle ermöglicht (Erlenhoefer at al., 2001; Tatsuo et al., 2000). Das F-Protein (Fusion) veranlasst durch pH-unabhängige Membranfusion an der Zelloberfläche den Eintritt des Masernvirus in die Zelle (Wild et al., 1991). Aufgrund des Vorkommens von CD150 auf einer Vielzahl
Literaturübersicht 17
an Lymphozyten, dendritischen Zellen, Langerhans Zellen und Makrophagen, werden die primären Zielzellen des Masernvirus durch Immunzellen des Respirationstraktes repräsentiert (Ferreira et al., 2010). Ein alternativer Eintritt des Masernvirus in Zellen des Respirationstraktes erfolgt über die Primärinfektion lymphatischer Zellen, die das Virus an die basolaterale Oberfläche respiratorischer Epithelzellen bringen (Leonard et al., 2008). Dort erfolgt der Eintritt des Virus über den basolateral lokalisierten zellulären Rezeptor Nektin-4, den das Masernvirus als alternativen Rezeptor zu CD150 nutzen kann (Mühlebach et al., 2011; Noyce et al., 2011). Einen weiteren, alternativen Rezeptor stellt CD46 dar, der beispielsweise von Masernvirus- Impfstämmen und anderen durch die Substitution von Aminosäuren im Hämagglutinin- Glykoprotein veränderten Stämmen genutzt werden kann (Dörig et al., 1993;
Schneider-Schaulies et al., 2001; Yanagi et al., 2006).
2.2.1.2 Das humane Masernvirus - onkolytische Virotherapie -
Das humane Masernvirus stellt ein in der viralen Onkolyse vielversprechendes Virus zur Behandlung diverser Neoplasien dar. Einen häufig in Studien verwendeten Masernvirus-Stamm stellt der attenuierte Masernvirus-Stamm Edmonston dar. Eine Wirkung dieses Stammes auf Tumorzellen wurde bereits in vielen in vitro und in vivo Experimenten beschrieben (Lapp et al., 2014). Vielversprechende Versuche mit dem nicht-modifizierten Edmonston-Stamm wurden bereits an humanen Myelomen und humanen Myelomzelllinien in vitro und in vivo (Peng et al., 2001), an humanen Ovarkarzinomzellen, humanen Fibrosarkom- und humanen Lungenkarzinomzellen in vitro (Anderson et al., 2004) beschrieben. Ebenso existieren Studien zum Einsatz modifizierter Masernvirusstämme. Um die virale Genexpression von Masernviren in der onkolytischen Virotherapie effizient verfolgen zu können, werden Masernviren eingesetzt, die das lösliche Markerpeptid tumor-associated carcinoembryonic antigen (CEA) exprimieren (Zhang et al., 2012). Die Serum-CEA-Spiegel, die wiederholt auf einfachem Wege erhoben werden können, sind ein guter Hinweis für die Anzahl replizierender Viren. Die CEA-Spiegel korrelieren daher bei Verwendung dieser modifizierten Viren positiv mit der Virusvermehrung in vitro und in vivo (Zhang et al.,
2012). Studien über den Einsatz in dieser Weise veränderter Masernviren existieren in humanen Myelom- und Fibrosarkomzellen in vivo (Peng et al., 2002), in humanen Ovarkarzinomzellen (Galanis et al., 2010; Hasegawa et al., 2006; Iankov et al., 2007;
Myers et al., 2005; Peng et al., 2006), in humanen Mammakarzinomzellen (McDonald et al., 2006), in humanen hepatozellulären Karzinomzellen (Blechacz et al., 2006;
Iankov et al., 2007), in humanen Burkitt´s-Lymphomzellen (Iankov et al., 2007), in humanen malignen Gliomzellen und primären Glioblastomzellen (Allen et al., 2013; Liu et al., 2007), in humanen Prostatakarzinomzellen (Msaouel et al., 2009) und in humanen Hepatoblastomzellen (Zhang et al., 2012) in vivo und in vitro.
Eine weitere vielversprechende Modifikation wird über den Einschluss verschiedener single chain Antikörper in das virale Hämagglutinin des Masernvirus erreicht. Ziel dieser Modifikation ist die Bindung des Virus mittels dieser Antikörper an ganz bestimmte Antigene auf den Tumorzellen, um eine zielgerichtete Zerstörung von neoplastischen Zellen unter weitestgehender Schonung nichttransformierten Gewebes zu erreichen (Lapp et al., 2014).
Das tumor-associated carcinoembryonic antigen (CEA) stellt außerdem ein Antigen dar, das üblicherweise auf der Oberfläche diverser Tumorzellen, wie kolorektalen, pankreatischen und Mammakarzinomzellen überexprimiert wird (Hammond et al., 2001). Mittels des, in das virale Hämagglutinin eingeschleusten gegen CEA gerichteten, Antikörpers erfolgt so die Aufnahme des veränderten Virus primär durch die Tumorzellen (Hammond et al., 2001). Ein weiteres Beispiel für Antikörper, die in das Hämagglutinin-Protein von Masernviren eingebaut wurden, stellen CD20 (Bucheit et al., 2003) und CD133 (Bach et al., 2013) dar.
CD20 ist ein integrales Oberflächenmembran-Phosphoprotein, das ausschließlich auf normalen und neoplastischen B-Zellen exprimiert wird (Bucheit et al., 2003). Daher stellen Zellen, die CD20 exprimieren einen guten Ansatzpunkt dar, um von onkolytischen Viren gezielt zerstört zu werden (Bucheit et al., 2003). In der Therapie von Non-Hodgkin-Lymphomen ist der gegen CD20 gerichtete Antikörper Rituximab als sicheres und häufig effektives Medikament bekannt. Bucheit et al. (2003) konstruierten ein mit einem CD20-Antikörper ausgestattetes Masernvirus. Xenotransplantate aus CD20 exprimierenden humanen Fibrosarkomzellen (HT1080) zeigten nach
Literaturübersicht 19
systemischer Masernvirus-CD20 Injektion ein langsameres Wachstum als nach Injektion des unveränderten onkolytischen Masernvirusstammes MVNSe, während in nicht-CD20 exprimierenden Zellen das Umgekehrte der Fall war (Bucheit et al., 2003).
CD133, auch als Prominin-1 bekannt, wird auf sogenannten Tumor-initiierenden Zellen (tumor-initiating cells, TICs) exprimiert. TICs stellen Zellen dar, von denen bekannt ist, dass sie in Krebszellen differenzieren, die in der Lage sind, einen Tumor zu bilden (Bach et al., 2013). Aufgrund Ihrer Resistenz gegen konventionelle Therapiemethoden, wie Bestrahlung und Chemotherapie, sind sie ein vielversprechender Ansatzpunkt und ein definiertes Angriffsziel von mit CD133 Antikörpern ausgestatteten Masernviren (Bach et al., 2013). Diese modifizierten Masernviren zeigten einen starken antitumoralen Effekt auf subkutan oder multifokal in der Bauchhöhle wachsende humane, hepatozelluläre Karzinomxenotransplantate in non obese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) Mäusen (Bach et al., 2013).
Eine weitere vielversprechende Modifikation von Masernviren und der Infektionskontrolle stellt der Einbau eines humanen thyroidalen Natriumiodid- Symporters (NIS) dar (Hutzen et al., 2012; Lapp et al., 2014). Dieser ist in der Lage, Radioiodid nach enteraler Gabe in infizierten Zellen anzureichern, um die Effizienz einer Bestrahlungstherapie in radiosensitiven Neoplasien zu erhöhen und mittels nicht- invasiver, bildgebender Verfahren den „infizierten“ Tumor darzustellen (Hutzen et al., 2012). Es existieren in vitro und in vivo Studien zum Effekt dieser mittels NIS modifizierten Masernviren beispielsweise in humanen Ovarkarzinomzellen (Hasegawa et al., 2006; Liu et al., 2012), humanen Myelomzellen (Dingli et al., 2004; Liu et al., 2010; Liu et al., 2012; Myers et al., 2007), humanen Glioblastomzellen (Allen et al., 2012; Opyrchal et al., 2012), humanen hepatozellulären Karzinomzellen (Blechacz et al., 2006), humanen Pankreaskarzinomzellen (Carlson et al., 2009; Penheiter et al., 2010), humanen, kolorektalen Karzinomzellen (Touchefeu et al., 2013) und humanen Endometriumstumorzellen (Liu et al., 2014).
2.2.1.3 Das humane Masernvirus - onkolytische Virotherapie - klinische Studien -
Humane Masernviren sind als Therapeutikum von verschiedenen Neoplasien bereits im Stadium von klinischen Tests angekommen. Eine nicht-geblindete klinische Phase 1 Testreihe zur Behandlung kutaner T-Zell Lymphome in fünf Patienten mittels des lebend-attenuierten Edmonston-Zagreb Impfstamms führte zu einer Tumorregression in fünf von sechs Läsionen (Heinzerling et al., 2005). Neben intratumoraler Injektion erfolgte eine Injektion von Interferon alpha (IFN) zwei Tage vor und nach der Virusapplikation, um die Masernvirusreplikation auf IFN-resistente Tumorzellen zu beschränken und die Sicherheit der Studie zu erhöhen. Tumorregression oder Wachstumsverlangsamung wurden auch in Läsionen beobachtet, die keinen direkten Kontakt zur Injektionsstelle hatten. Histologisch zeigten sich innerhalb von entnommenen Tumorbiopsien nach Behandlung, verglichen mit Biopsien vor Behandlung, neben großen Masernvirus-Nukleoprotein-positiven Tumorzellsynzytien eine Zunahme an CD8 mRNS, eine erhöhte Anzahl an IFN-gamma-mRNS und eine reduzierte Anzahl an CD4 mRNS Transkripten (Heinzerling et al., 2005; Lapp et al., 2014). Eine weitere klinische Studie wird von Galanis et al. (2010) beschrieben. 21 Patienten mit Taxol- und Platin-resistenten Ovartumor-Rezidiven und im Referenzbereich liegenden CEA-Spiegeln, wurde alle vier Wochen, bis zu 6-fach ein CEA-exprimierendes Masernvirus in sieben unterschiedlichen Dosen intraperitoneal verabreicht. Es wurden keine dosisabhängige Toxizität, keine behandlungsinduzierte Immunsuppression, keine Bildung von anti-CEA-Antikörpern oder ein Anstieg an Antikörper-Titern, noch eine Virusausscheidung über Urin oder Speichel beobachtet.
Die mittlere Überlebenszeit der Patienten wurde jedoch von sechs Monaten auf 12,15 Monate verlängert (Galanis et al., 2010; Lapp et al., 2014).
Es existiert noch eine Vielzahl weiterer, geplanter oder noch andauernder, klinischer, Phase 1 und 2 Studien. Viele dieser Studien testen die Effektivität und Sicherheit der mittels CEA oder NIS modifzierten Masernviren (Lapp et al., 2014;
http://www.clinicaltrials.gov/).
Literaturübersicht 21
2.2.1.4 Das kanine Staupevirus - Pathogenese -
Das kanine Staupevirus ist ein weltweit auftretendes Virus, das in Familien der Ordnung Carnivora als Auslöser verheerender Erkrankungen bekannt ist (Deem et al., 2000). Hauptsächlich abhängig vom Alter und Immunstatus des Hundes sowie vom Erregerstamm, werden teils große Unterschiede im Hinblick auf die Dauer und die Klinik der Erkrankung beschrieben (Beineke et al., 2009). Auch der Schweregrad der Erkrankung unterliegt starken Variationen. Möglich sind symptomlose Verläufe bis hin zu Krankheitsverläufen mit einer Mortalität von 50% (Beineke et al., 2009; Lempp et al., 2014).
Vergleichbar mit dem humanen Masernvirus erfolgt auch die Infektion mit dem kaninen Staupevirus aerogen und löst eine lymphatische Depletion und Immunsuppression mit positiv korrelierter Begünstigung von Sekundärinfektionen aus (Beineke et al., 2009;
Krakowka et al., 1975). Die initiale Virusreplikation findet im Lymphgewebe des Respirationstraktes statt. Die Zellen, die das Virus zuerst aufnehmen und verbreiten, stellen Gewebsmakrophagen und Monozyten dar, die in oder entlang des respiratorischen Epithels und in den Tonsillen lokalisiert sind. Innerhalb der ersten virämischen Phase erfolgt die Verbreitung des Virus auf hämatogenem und lymphatischem Weg und resultiert in der Infektion sämtlicher lymphatischer Gewebe (Appel, 1970; Beineke et al., 2009). Erste klinische Anzeichen stellen Lethargie, Dehydratation, Anorexie und Gewichtsverlust dar. Daraufhin treten organspezifische Symptome auf, abhängig vom, im Folgenden hauptsächlich betroffenen, Organ. Ein häufiges zusätzliches Symptom stellt der biphasische Fieberverlauf dar (Beineke et al., 2009). In der zweiten virämischen Phase, die häufig mit hohem Fieber einhergeht, erfolgt die Infektion parenchymatöser Zellen des gesamten Körpers (Appel 1969;
Beineke et al., 2009; Blixenkrone-Møller, 1989; Blixenkrone-Møller et al., 1989; Okita et al., 1997). Klinische Anzeichen einer kaninen Staupevirus Infektion bei betroffenen Hunden sind durch katarrhalische, respiratorische und gastrointestinale Alterationen, Veränderungen der Haut und des zentralen Nervensystems, vor allem der kaninen Staupevirus induzierten demyelinisierenden Leukoenzephalitis, gekennzeichnet (Beineke et al., 2009; Gröne et al., 2003; Lempp et al., 2014; Maeda et al., 1994).
2.2.1.5 Der kanine Staupevirusstamm Onderstepoort
Der kanine Staupevirusstamm Onderstepoort wurde, nach Isolation aus einem natürlichen Staupevirusfall, zahlreichen Passagen in Frettchen und zahlreichen Passagen in Hühnereiern, aus dem sogenannten Green´s distemperoid virus abgeleitet (Woma et al., 2010). CDV-Onderstepoort (CDV-Ond) wird als Impfstoff eingesetzt und gilt als vollständig apathogen (Stettler et al., 1997). CDV-Ond zeichnet sich in vitro durch ausgeprägte zytopathogene Effekte mit Synzytienbildung aus (Plattet et al., 2005). Puff et al. (2009) beschreibt die Herstellung einer persistierenden CDV-Ond-infizierten DH82 Tumor-Zelllinie, die virulentes Virus in den Zellkulturüberstand abgibt.
2.2.1.6 Das kanine Staupevirus - onkolytische Virotherapie -
Im Bereich der onkolytischen Virotherapie existieren bislang nur wenige Studien zum onkolytischen Potenzial des kaninen Staupevirus. Suter et al. untersuchten 2005 den Einfluss des attenuierten Staupevirusstammes Onderstepoort auf kanine, lymphoide Zelllinien und neoplastische B- und T-Lymphozyten, die aus Hunden mit spontanen Lymphomen stammten. Sie stellten fest, dass all diese Zellen den, für die Infektion notwendigen, Rezeptor CD150 exprimieren, wohingegen der CD46 Rezeptor nur auf neoplastischen Lymphozyten exprimiert wird. Die Infektionsraten lagen zwischen 40%
und 70% in den nichtneoplastischen lymphoiden Zelllinien, verglichen mit Infektionsraten von 50% bis 90% in den aus Hunden mit B- und T-Zell-Lymphomen isolierten neoplastischen Lymphozyten. Da, in den mit dem kaninen Staupevirus infizierten Zellreihen, Apoptose auftrat, scheint der attenuierte kanine Staupevirusstamm Onderstepoort ein mögliches Virus zur Behandlung kaniner Lymphome darzustellen (Suter et al., 2005). Makrophagen stellen einen wichtigen repräsentativen Zelltyp für die Pathogenese der Staupevirusinfektion dar. Ebenso ist CDV-Ond in vitro in der Lage DH82-Zellen, bei denen es sich um eine Makrophagentumorzelllinie handelt, zu einem hohen Prozentsatz zu infizieren (Puff et al., 2009).
Literaturübersicht 23
2.2.1.7 Das kanine Parainfluenzavirus - Struktur -
Das kanine Parainfluenzavirus (CPiV) ist ein Rubulavirus der Familie Paramyxoviridae.
Es handelt sich um ein kugeliges bis pleomorphes 150 bis 200 nm großes Virion, das aus einem Nukleokapsid besteht, welches von einer Lipidhülle umgeben ist (Ellis et al., 2012). Das kanine Parainfluenzavirus ist ein negativ-orientiertes, einzelsträngiges RNS-Virus, das mit sieben Genen, für acht Proteine kodiert. Das Nukleokapsid des Virus setzt sich aus dem Nukleoprotein (N), dem Phosphoprotein (P) und dem großen Protein (L für large) in Kombination mit dem Genom zusammen. Ein Komplex aus dem P- und dem L-Protein bildet die für die Replikation viraler RNS essentielle virale RNS- abhängige-RNS-Polymerase (Ellis et al., 2012). An der Innenseite der Lipidhülle ist das Matrixprotein (M) lokalisiert, das für die virale Reifung und Freisetzung der Virionen essentiell ist. Die an Ausläufern der Lipidhülle lokalisierten transmembranösen Hämagglutinin-Neuraminidase (HN)- und Fusionsproteine (F) sind für die Anlagerung an und das Eindringen in die Wirtszelle verantwortlich. Das SH-Protein (small hydrophobic) stellt ein transmembranöses Strukturprotein dar, das die Apoptose infizierter Zellen beeinflusst (Buonavoglia und Martella, 2007; Ellis et al., 2012).
2.2.1.8 Das kanine Parainfluenzavirus - Pathogenese -
Die kanine Parainfluenzavirus-Infektion ist mit zwei verschiedenen klinischen Bildern assoziiert. Zum einen wird eine Erkrankung des oberen Respirationstraktes, zum anderen eine sehr seltene Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS) beschrieben. Das kanine Parainfluenzavirus (CPiV) wird häufig bei Hunden mit respiratorischen Erkrankungen nachgewiesen. Daher scheint ihm, in Zusammenhang mit Bordetella bronchiseptica, eine Schlüsselrolle in der Ätiologie der infektiösen Tracheobronchitis zuzukommen (Buonavoglia und Martella, 2007; Ellis et al., 2012;
Weese und Stull, 2013;). Das Virus ist hochkontagiös und die Prävalenz der Infektion scheint mit der Dichte der Hundepopulation assoziiert zu sein. Die Erkrankung wird durch Tröpfchen übertragen und bleibt gewöhnlich auf den oberen Respirationstrakt beschränkt (Buonavoglia und Martella, 2007; Ellis et al., 2012). Sie durchläuft keine virämische Phase. Da natürlich infizierte Hunde häufig simultane Infektionen
verschiedener Viren aufweisen, sind die Symptome meist stärker, als es die experimentelle Infektion von Hunden mit CPiV, bei der das Virus lediglich in den Zellen der Nasenschleimhaut, des Pharynx, der Trachea und den Bronchien replizierte, vermuten lässt (Buonavoglia und Martella, 2007; Ellis et al., 2012). Symptome treten meist zwei bis acht Tage nach der Infektion auf. Bei Monoinfektionen mit CPiV treten nur kurzzeitig andauernde milde Symptome, wie milder Temperaturanstieg, trockener Husten, wässriger Nasenausfluss, Pharyngitis und Tonsillitis auf, die durch Infektionen mit weiteren Pathogenen verkompliziert werden können. Häufig sind junge, ungeimpfte und immunsupprimierte Hunde von einer schwerwiegenden Verlaufsform betroffen, die meist mit Lethargie, Fieber, Inappetenz und Pneumonie einhergeht (Baumgärtner et al., 1991; Buonavoglia und Martella, 2007). Verschiedene Studien berichten jedoch in Einzelfällen von einem Nachweis des CPiV in nicht-respiratorischen Geweben, wie Milz, Leber, Niere, Darminhalt und zerebrospinaler Flüssigkeit (Baumgärtner et al., 1991; Buonavoglia und Martella, 2007; Ellis et al., 2012). Die intrazerebrale Infektion gnotobiotischer Hunde mit CPiV resultierte in einer akuten Enzephalitis mit flächenhafter kortikaler Nekrose und dem Auftreten viralen Antigens in ependymalen Zellen und Neuronen (Baumgärtner et al., 1991). Ähnliche, jedoch weniger dramatische, Läsionen wurden bei experimentell-infizierten Frettchen beobachtet (Baumgärtner et al., 1991).
Die enge Verwandtschaft des CPiV, dessen Ausbreitung lokal begrenzt bleibt, mit CDV und MV, die eine virämische Phase durchlaufen, rückt auch dieses Virus als mögliches onkolytisches Virus in den Fokus, das eine lokal-begrenztere Auswirkung auf die lokalen Tumorzellen haben könnte.
2.3 Kanine histiozytäre Erkrankungen
Der Begriff Histiozyt beschreibt Zellen myeloischer Herkunft, die unter Einfluss verschiedener Zytokine, wie Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor, Tumor-Nekrose-Faktor, transformierendem Wachstumsfaktor beta 1 und Interleukin-4, aus CD34 positiven Stammzellvorläufern zu Makrophagen, Monozyten und den verschiedenen dendritischen Zellreihen (Langerhans Zellen und interstitiell-
Literaturübersicht 25
dendritische Zellen) differenzieren (Favara et al., 1997; Moore et al., 2014; Schwens et al., 2011).
Kanine histiozytäre Sarkome werden auf der Basis ihres Zellursprungs und ihrer morphologischen Eigenschaften charakterisiert (Affolter und Moore, 2002; Boerkamp et al., 2013; Moore et al., 2006). Nach Moore (2014) werden die kaninen histiozytären Erkrankungen in das kanine kutane Histiozytom, die kutane Langerhans Zell- Histiozytose, unterschiedliche Formen der reaktiven Histiozytosen und den histiozytären Sarkomkomplex unterteilt. Im Gegensatz zum Hund treten beim Menschen histiozytäre Erkrankungen nur selten auf, so dass ihr biologisches Verhalten und die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen nur wenig erforscht sind (Affolter und Moore, 2000; Affolter und Moore, 2002; Allison et al., 2008;
Boerkamp et al., 2013; Boerkamp et al., 2014; Moore, 2014; Moore et al., 2006;).
Aufgrund der Ähnlichkeit kaniner histiozytärer Sarkome zum humanen Pendant, stellt der Hund ein nützliches, translationelles Modell für histiozytäre Erkrankungen beim Menschen dar (Hedan et al., 2011).
2.3.1 Das kanine kutane Histiozytom
Das kanine kutane Histiozytom betrifft vor allem junge Hunde. Häufig sind Hunde brachyzephaler Rassen unter 4 Jahren betroffen, aber unter anderem auch Hunde der Rassen Scottish Terrier, Dobermann und Cocker Spaniel. Es handelt sich um eine benigne, meist solitär auftretende Neoplasie, die häufig in spontane Regression übergeht und daher eine gute Prognose aufweist. Häufig sind der Kopf, insbesondere die Ohrmuschel und die Gliedmaßen betroffen. Die Neoplasie zeigt Hinweise auf das Vorliegen transformierter epidermaler Langerhans Zellen als Ursprungszelle (Fulmer et al., 2007; Moore et al., 2014; Schwens et al., 2011).
2.3.2 Die kutane Langerhans Zell-Histiozytose
Als eine beim Menschen häufig beschriebene Krankheit ist die kutane Langerhans Zell-Histiozytose bei Hunden eher eine Seltenheit (Moore, 2014). Es werden kutane
Läsionen unterschiedlicher Größe von nodulären Umfangsvermehrungen bis hin zu größeren Massen beschrieben, die in der Epidermis, begleitet von Rötungen, Alopezie und Ulzeration auftreten können (Moore, 2014). Auch Läsionen an mukokutanen Übergängen und in der Mundhöhle wurden beobachtet (Moore, 2014). Die Läsionen, die häufig eine verzögerte Regression zeigen, beginnen in der Regel in der Haut und bleiben entweder auf die Haut begrenzt oder befallen auch die regionären Lymphknoten und selten weitere Organe (Moore, 2014). Trotz des Vorkommens dieser Veränderungen bei diversen Rassen scheinen Shar Peis eine überrepräsentierte Rasse darzustellen (Moore, 2014). Aufgrund der häufig schwierigen Handhabung ulzerierter Läsionen und bei systemischem Befall sind fatale Verläufe, endend mit Euthanasie, häufig beschrieben (Moore, 2014). Die histiozytären Zellen dieser Erkrankung haben den gleichen Immunophänotyp wie die Histiozyten des kaninen kutanen Histiozytoms (Moore, 2014).
2.3.3 Die reaktiven Histiozytosen
Unter den Begriff der reaktiven Histiozytosen fallen die verwandten, entzündlichen Krankheitsbilder der kaninen kutanen und der systemischen Histiozytose, die sich anhand des klinischen Verteilungsmusters der Läsionen unterscheiden (Affolter und Moore, 2000; Moore, 2014). Die Läsionen bestehen hauptsächlich aus aktivierten, dermalen, interstitiellen dendritischen Zellen und häufig CD8+ T-Zellen (Affolter und Moore, 2000; Moore, 2014). Aufgrund der häufig beobachteten Gefäßinvasivität dieser, in dermale Gefäße, tritt häufig eine lymphohistiozytäre Vaskulitis auf.
Resultierend aus ihrer Ausprägung, bevorzugt in der tiefen Dermis und Subkutis, wird ihnen im Gegensatz zu kaninen, kutanen Histiozytomen (mit einer top-heavy Topografie), eine sogenannte bottom-heavy Topografie zugeschrieben. Ihre genaue Pathogenese ist bislang unbekannt. Allerdings wird eine zugrundeliegende Immundysregulation angenommen (Affolter und Moore, 2000; Moore, 2014).
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2.3.3.1 Die kanine kutane Histiozytose
Die kanine kutane Histiozytose betrifft hauptsächlich die Haut und Unterhaut sowie teilweise die regionären Lymphknoten des Gesichts, der Nase, des Nackens, des Rumpfes, der Extremitäten, des Perineums und des Skrotums (Affolter und Moore, 2000; Mays et al., 1986; Moore, 2014). Eine klare Rasseprädisposition kann nicht beobachtet werden. Meist handelt es sich um multipel auftretende Knoten mit einem Durchmesser bis zu 4 cm, die häufig von Ulzerationen begleitet werden. Es werden spontane Regression sowie gleichzeitig das Auftreten an anderen Lokalisationen beobachtet (Affolter und Moore, 2000; Mays et al., 1986; Moore, 2014).
2.3.3.2 Die kanine systemische Histiozytose
Für die kanine systemische Histiozytose besteht eine Rasseprädisposition bei Berner Sennenhunden (Moore, 1984). Seltener sind neben anderen auch Hunde der Rassen Rottweiler, Labrador Retriever, Basset Hound und Irischer Wolfshund, alle hauptsächlich zwischen 2 und 8 Jahren, betroffen (Affolter und Moore, 2000; Moore, 2014; Schwens et al., 2011). Bei der kaninen systemischen Histiozytose handelt es sich um eine generalisierte, proliferative Erkrankung, die besonders in der frühen Phase der Erkrankung durch einen wellenförmigen Verlauf gekennzeichnet ist (Affolter und Moore, 2000; Moore, 2014; Schwens et al., 2011). Häufig betroffene Lokalisationen stellen die Haut, bevorzugt an Skrotum, Augenlidern, Nasenspitze und -spiegel, die okuläre und nasale Mukosa und periphere Lymphknoten dar. Außerdem können die Lunge, die Milz und das Knochenmark betroffen sein (Affolter und Moore, 2000; Moore, 2014; Schwens et al., 2011). Als Symptome sind je nach Ausprägung Anorexie, starker Gewichtsverlust, Atemgeräusche und Konjunktivitis mit Ödem der Konjunktiva (Chemose) bekannt (Moore, 2014).
2.3.4 Der histiozytäre Sarkomkomplex
Unabhängig von Ihrem Subtyp, stellen histiozytäre Sarkome eine hoch aggressive Neoplasie bei Mensch und Hund dar. Aufgrund fehlender ausreichender Therapiemöglichkeiten ist diese Neoplasie häufig mit einer sehr kurzen Überlebenszeit
verbunden (Fidel et al., 2006; Hedan et al., 2011; Hornick et al., 2004; Saboo et al., 2012; Schlick et al., 2012; Vos et al., 2005). Innerhalb des histiozytären Sarkomkomplexes wird eine lokalisierte von einer disseminierten Form, früher als maligne Histiozytose bezeichnet, unterschieden (Affolter und Moore, 2002; Moore, 2014; Schwens et al., 2011). Der zugrundeliegende Zelltyp dieser Neoplasien wird durch interstitiell-dendritische Zellen repräsentiert. Aufgrund des ubiquitären Vorkommens dieses Zelltyps, können histiozytäre Sarkome in sämtlichen Geweben beobachtet werden (Moore, 2014). Eine familiäre Häufung dieser Neoplasien in bestimmten Berner Sennenhundlinien, in denen der histiozytäre Sarkomkomplex zuerst beschrieben wurde, zeigte in folgenden Stammbaumanalysen einen zugrundeliegenden polygenen Erbgang der Prädisposition für diese Neoplasie (Abadie et al., 2009). Weitere Prädispositionen werden für Rottweiler, Golden, Labrador und Flat Coated Retriever beschrieben (Affolter und Moore, 2002). Hedan et al. (2011) und Shearin et al. (2012) zeigen in histiozytären Sarkomen von Berner Sennenhunden und Flat Coated Retrievern Deletionen in verschiedenen Tumorsuppressorgenen, wie dem Cyclin-abhängigen Kinaseinhibitor 2A/B (CDKN2A/B), dem Retinoblastom-Gen-1 (RB- 1) und dem Phosphatase und Tensin Homolog (PTEN), auf, die den genetischen Alterationen, die für den Menschen bekannt sind, stark ähneln. Hedan et al. (2011) nehmen daher an, dass kanine und humane histiozytär-proliferative Erkrankungen pathogenetische Gemeinsamkeiten aufweisen, die den Hund zu einem vielversprechenden, translationellen Modell für humane histiozytäre Veränderungen machen. Neben allgemeinen Symptomen wie Anorexie, Gewichtsverlust und Lethargie treten weitere, vielfältige Symptome, wie pulmonale oder zentralnervöse Störungen, je nach neoplastisch verändertem Organ oder neoplastisch veränderten Organen, auf.
2.3.4.1 Das kanine lokalisierte histiozytäre Sarkom
Affolter und Moore zeigten 2002 in einer Studie, dass das lokalisierte, histiozytäre Sarkom vor allem in der Subkutis der Gliedmaßen auftritt. Häufig infiltrierten die Tumorzellen die tiefe Dermis und das angrenzende Muskelgewebe und die Faszien.
Literaturübersicht 29
Die lokalisierte Variante zeigte, verglichen mit der disseminierten, nach chirurgischer Exzision oder nach Bestrahlungstherapie, bessere prognostische Aussichten (Affolter und Moore, 2002).
2.3.4.2 Das kanine disseminierte histiozytäre Sarkom
Primärläsionen des disseminierten histiozytären Sarkoms fanden Affolter und Moore (2002) hauptsächlich in der Milz, Leber, Lunge, dem Knochenmark und in Lymphknoten.
Die disseminierte Form des histiozytären Sarkoms zeigte ein sehr aggressives Verhalten mit schlechter Prognose teils aufgrund einer akuten rapiden Verschlechterung und fehlender Antwort auf Chemotherapeutika (Affolter und Moore, 2002). Fidel et al. (2006) zeigen, dass jegliche Behandlung, ob mittels Zytostatika, Bestrahlung, chirurgischer Exzision oder einer Kombinationstherapie, die mittlere Überlebenszeit erkrankter Hunde, verglichen mit ausschließlich palliativ behandelten Hunden, verlängerte. Die längste mittlere Überlebenszeit nach Diagnosestellung wurde infolge einer Kombinationstherapie aus dem Zytostatikum Chlorethyl- Cyclohexyl-Nitroso-Urea (CCNU) und Bestrahlung mit 264 Tagen erreicht. Skorupski et al. (2007) beschreiben die Verlängerung der mittleren Überlebenszeit von Hunden, die auf CCNU-Therapie ansprachen (sogenannte Responder) auf 172 Tage, verglichen mit 60 Tagen bei Hunden, die nicht auf die Therapie ansprachen. Die Responderrate lag allerdings nur bei 46%. Insgesamt stellt diese hochaggressive Neoplasie eine bislang häufig schlecht therapierbare Erkrankung mit schlechter Prognose dar, so dass alternative Therapiemethoden, wie die onkolytische Virotherapie, einen vielversprechenden neuen Ansatz liefern können.
2.3.4.3 Hämophagozytäres histiozytäres Sarkom
Das hämophagozytäre histiozytäre Sarkom ist die Form der histiozytären Sarkome mit der schlechtesten Prognose. Betroffene Hunde haben eine mittlere Überlebenszeit von lediglich 4 Wochen und weisen eine diffuse Splenomegalie auf (Moore, 2014).
Ursprungszellen zeigen ein Expressionsmuster, das den Makrophagen in der roten
Milzpulpa und im Knochenmark sehr ähnelt. Diese Histiozyten durchsetzen gewöhnlich die gesamte rote Milzpulpa und zeigen erhebliche Erythrophagozytose, durchsetzt von Arealen extramedullärer Hämatopoese. Klinisch zeigen die betroffenen Hunde häufig eine ausgeprägte, regenerative, hämolytische Anämie und eine Thrombozytopenie (Moore, 2014).
2.3.4.4 Dendritische Zell-Leukämie
Bislang existieren lediglich zwei Berichte über eine dendritische Zell-Leukämie bei Hunden (Moore, 2014; Schwens et al., 2011). Die Hunde zeigten eine diffuse Infiltration betroffener Organe und des peripheren Blutes mit Zellen dendritischen Ursprungs, die aufgrund ihres Expressionsmusters aus dem Knochenmark stammten (Moore, 2014; Schwens et al., 2011).
2.3.5 Die permanente histiozytäre Sarkomzelllinie DH82
DH82-Zellen stellen eine kommerziell erhältliche, permanente, histiozytäre Sarkomzelllinie dar, die ursprünglich aus dem Knochenmark eines Golden Retrievers stammte, der an der disseminierten Form des histiozytären Sarkoms litt (Wellman et al., 1988).
In der Gewebekultur wachsen die Zellen einschichtig mit lockerer Adhärenz und zeigen teilweise gegenseitige Phagozytose. Außerdem besitzen sie die Fähigkeit zur Phagozytose von Latexpartikeln. Sie zeigen eine typische Makrophagen-gleiche Morphologie und stellen sich als große, runde Einzelzellen, teilweise mehrkernig mit einer Größe zwischen 25 und 55 µm im Durchmesser, mit reichlich basophilem Zytoplasma, variierenden Mengen an eosinophilen Granula, zytoplasmatischen Vakuolen und zytoplasmatischen Pseudopodien dar (Wellman et al., 1988). Der Zellkern ist rund, exzentrisch lokalisiert und enthält häufig mehrere, irregulär geformte, große Nukleoli. Die Zellen sind weiterhin charakterisiert durch die Expression von alpha Naphthylazetatesterase, saurer Phosphatase und verschiedenen Fc (fragment crystallisable)-Rezeptoren (Wellman et al., 1988). Neben dem hauptsächlichen
