Eine nicht-eitrige Meningoenzephalitis unbekannter Ursache (MUO) stellt einen häufigen Befund bei Hunden dar (SCHWAB et al. 2007; HOON-HANKS et al. 2018).
Früher wie heute geht man davon aus, dass MUOs durch virale Infektionen verursacht werden können (SUMMERS et al. 1995). Neben der Morphologie und klassischen molekularen Methoden wie Immunfluoreszenz und Polymerasekettenreaktion (PCR) werden heute molekulare Methoden zur Detektion von bekannten und unbekannten Virusinfektionen wie z.B. Metagenomanalysen durchgeführt. Da auch mit Verwendung dieser Methoden bei vielen der MUOs keine Ätiologie identifiziert werden kann und klinisch ein Teil der Patienten auf eine Immunsuppressionstherapie anspricht, besteht die Hypothese, dass vielen MUOs eine primäre, autoimmune Genese zugrunde liegt (HOON-HANKS et al. 2018).
Neben der typischen perivaskulären, lympho-histiozytären Entzündung im ZNS, gehören auch pathomorphologische Veränderungen wie die granulomatöse Meningoenzephalitis und die nekrotisierende Meningoenzephlitis als Subtypen zu den MUOs (COATES u. JEFFERY 2014; HOON-HANKS et al. 2018). Allen ist gemeinsam, dass ihre Ätiologie trotz intensiver Forschung bisher nicht ermittelt werden konnte – weder anhand klinischer noch pathologischer Befunde. Neben einer Virusätiologie wurden als mögliche Ursachen unter anderen hypoxische, metabolische und toxische Schäden, die auch zur Demyelinisierung führen können, beschrieben (BRAUND 1980; SUMMERS et al. 1995; TIPOLD 1995; KIPAR et al.
1998; UCHIDA et al. 1999; LEE et al. 2002; SCHATZBERG et al. 2005; BLOCH u.
GLASER 2007; BARBER et al. 2012; HOON-HANKS et al. 2018). Nichtsdestotrotz bleibt die nicht-eitrige Meningoenzephalitis in jedem Einzelfall eine MUO solange keine Ätiologie ermittelt wurde. Frühere Studien verwendeten Polymerasekettenreaktion (PCR), Serologie, Kulturen, Immunhistochemie oder eine Kombination dieser Verfahren, um nach Viren, einschließlich Herpesviren,
Adenoviren, Parvoviren, Parainfluenzaviren, Enzephalomyokarditis-Viren, Bunyaviren, Coronaviren, Enteroviren, Flaviviren und Paramyxoviren im ZNS von verschiedenen Spezies zu suchen. Diese Tests waren jedoch immer spezifisch für den vermuteten Erreger, sodass in der Mehrzahl der untersuchten Fälle kein spezifisches Agens gefunden wurde (RAND et al. 1994; TIPOLD 1995; QUESNEL et al. 1997; GLASER et al. 2003; SCHATZBERG et al. 2005; GLASER et al. 2006;
BLOCH u. GLASER 2007; SCHWAB et al. 2007; BARBER et al. 2012). Molekulare Methoden wie das „Next Generation Sequencing“ entwickelten sich in Human- und Veterinärmedizin zu einem wichtigen Instrument für die Erregerentdeckung bei vielen verschiedenen Krankheiten (CHIU 2013; WILSON et al. 2014; LIPKIN u.
HORNIG 2015; HOON-HANKS et al. 2018; JO et al. 2018). In der Tiermedizin wird der Einsatz solcher Methoden durch den hohen technischen, zeitlichen und finanziellen Aufwand hauptsächlich zu Forschungszwecken genutzt, sodass sich die Frage stellt, ob man nicht eine Art „Vorselektion“ für Fälle aus der Diagnostik entwickeln könnte, um Fälle auszuwählen, bei denen eine Virusinfektion wahrscheinlicher ist als bei anderen Fällen. Da die IFN-I Signalkaskade vor allem in der Virusabwehr eine Rolle spielt, stellt sich die Frage, ob nicht eines der in dieser Arbeit untersuchten ISGs geeignet ist, um in Zukunft als Biomarker verwendet zu werden. Der große Vorteil besteht darin, dass mittels Immunhistologie ein Hinweis auf das Vorhandensein einer viralen Infektion bei einer MUO gefunden werden könnte, was dann als Startpunkt für die Durchführung weiterer, molekularer Methoden wie z.B. der Metagenomanalyse dient. Von den untersuchten Markern werden lediglich MX und STAT2 als relativ virusspezifisch beschrieben (STARK et al. 1998; PAULSON et al. 1999; HALLER u. KOCHS 2002; NAKAMURA et al. 2005;
HALLER et al. 2007; BLASZCZYK et al. 2015; BLASZCZYK et al. 2016;
ZAV'YALOV et al. 2018). Die anderen Marker (ISG15, PKR, OAS, STAT1, IRF3 und IRF7) sind an vielen anderen Prozessen und Signalkaskaden beteiligt, sodass sie nicht geeignet sind um Virusinfektionen spezifisch zu detektieren. Bei einigen dieser Marker zeigte sich in der durchgeführten Studie zudem kaum ein Unterschied in der zellulären Expression zwischen CDV-infizierten und Kontrolltieren, was weiterhin dafürspricht, dass diese Proteine nicht geeignet sind, um eine mögliche Virusinfektion vorauszusagen. Hinsichtlich der MX Expression wurde der größte Unterschied zwischen CDV-infizierten und Kontrolltieren festgestellt und darüber hinaus wies die MX-Expression eine deutliche Assoziation mit den histologischen
Läsionen auf. Da nur vereinzelt Zellen mit einer zeitgleichen Expression von MX-Protein und CDV-Antigen gefunden wurden, führt die Virusinfektion einer Zelle wahrscheinlich nicht direkt zu einer autokrinen MX-Expression. Die nur vereinzelte Co-Expression von MX Protein und CDV-Antigen muss aber nicht unbedingt ein Nachteil sein, da MX Protein auch noch in großer Menge in chronischen Läsionen nach CDV-Elimination nachgewiesen wurde. Insofern könnte der Nachweis von MX Protein auch als Hinweis auf eine zurückliegende Virusinfektion gedeutet werden, wenngleich eine derartige Aussage nur im Zusammenhang mit weiteren Ergebnissen wie z.B. klinischen Befunden und serologischen Ergebnissen erfolgen sollte. Porter et al. (2006) fanden teilweise auch in Enzephalitiden anderer Genese, wie einigen parasitären, mykotischen und idiopathischen Erkrankungen des Hundes, wie z.B. der Neosporidiose, der Aspergillose, der Enzephalitozoonose, der granulomatösen Meningoenzephalitis und der nekrotisierenden Enzephalitis eine nicht so starke, aber dennoch deutliche MX-Expression im Vergleich zu den viralen Erkrankungen (PORTER et al. 2006), sodass MX sehr sensitiv aber möglicherweise als alleiniger Marker nicht spezifisch genug für eine Virusdetektion ist. Inwieweit sich eine MX-Expression in Zusammenhang mit CRP- und/oder Procalcitonin-Werten als diagnostisches Mittel zur Virusdetektion (ZAV'YALOV et al. 2018) bei kaninen Enzephalitiden eignet, bedarf weiterer Forschung.
STAT2 zeigte in dieser Studie nur einen geringen Unterschied in der Expression zwischen den CDV-infizierten und den Kontrolltieren. Dieses Ergebnis ist wahrscheinlich auf die Auswahl des verwendeten anti-STAT2-Antikörpers zurückzuführen, da dieser Antikörper sowohl aktivierte als auch nicht-aktivierte STAT2-Proteine detektiert. Im Rahmen zukünftiger Untersuchungen sollte ein Antikörper hergestellt werden, der selektiv phosphoryliertes, kanines STAT2 erkennt um auf Proteinebene herauszufinden, ob STAT2 durch eine Virusinfektion aktiviert wird und diese Aktivierung visuell mittels Immunhistologie nachweisbar ist.
Darüber hinaus ist es wichtig diesen Marker auch bei anderen Infektionen (Viren, Bakterien, Pilze) sowie bei degenerativen Veränderungen im ZNS von Hunden zu untersuchen um die Bedeutung von aktiviertem STAT2 insbesondere bei Virusinfektionen näher zu charakterisieren. Diese Untersuchungen sind wesentlich um die Sensitivität und Spezifität von STAT2 für die Vorhersage von Virusinfektionen im ZNS von Hunden zu ermitteln und eine abschließende Aussage
zu treffen, ob phosphoryliertes STAT2 als Biomarker für die Erkennung einer möglichen, viralen Ätiologie genutzt werden kann.
6 Zusammenfassung
Die Bedeutung des Typ I Interferon Signalwegs im Hund unter besonderer Berücksichtigung der kaninen Staupevirusinfektion
Daniela Klotz
Typ-I Interferone (IFN-I) besitzen antivirale, antiproliferative und immunmodulatorische Eigenschaften. Der Hund weist verglichen mit anderen Tierarten mit IFN α, IFN β, IFN ε und IFN ĸ eine relativ geringe Anzahl an IFN-I-Subtypen auf. Mittels veröffentlichter Sequenzen wurden 5 verschiedene IFN α Subtypen im Hundegenom identifiziert. Alle Subtypen des IFN-I sind bei Hunden auf Chromosom 11 geclustert. Vor allem IFN α und IFN β wird eine antivirale Wirkung zugesprochen. Die Eigenschaften der anderen Subtypen sind derzeit weitestgehend unklar. In der Tiermedizin findet IFN-I mit dem zugelassenen rekombinanten felinen IFN-ω (Virbagen® Omega, Virbac S.A., Frankreich) bereits Anwendung bei der Behandlung der kaninen Parvovirusinfektion. Darüber hinaus ist die Rolle von IFN-I in der Pathogenese sowie der therapeutische Einsatz von IFN-I bei Hunden derzeit nur in geringem Umfang untersucht.
In dieser Arbeit wurde die Rolle von IFN-I sowie von ausgewählten Interferon stimulierten Genen (ISG) im Verlauf der kaninen Staupevirus (CDV)-Infektion im zentralen Nervensystem (ZNS) untersucht. Dazu wurde paraffineingebettetes Kleinhirngewebe von 15 Hunden mit einer spontanen Staupeenzephalitis, sowie paraffineingebettetes Kleinhirngewebe von 6 Hunden ohne eine pathologische Veränderung im ZNS als Kontrolltiere aus dem Archiv des Instituts für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover ausgewählt. Die 130 Läsionen der CDV-infizierten Tiere wurden mittels Histologie (Hämatoxylin-Eosin-Färbung, Luxol-Fast-Blue-Färbung) und Immunhistologie (CDV-Antigen; D110) in die Gruppen 2 (CDV-Antigen ohne Läsion), 3 (akute CDV-Läsion), 4 (subakute CDV-Läsion) und 5 (chronische CDV-Läsion) eingeteilt. Von den Kontrolltieren wurden 53 Areale in der weißen Substanz des Kleinhirns zufällig ausgewählt (Gruppe 1). An Serienschnitten wurden immunhistologische Untersuchungen zur Detektion von IRF (Interferon regulierender Faktor) 3, IRF7, STAT („Signal transducer and activator of transcription”) 1, STAT2, ISG15, OAS (2`5`-Oligoadenylatsynthetase), PKR (Proteinkinase R) und MX („Myxovirus resistance protein“) und eine
morphometrische Messung der Proteinexpression durchgeführt. Darüber hinaus wurden mittels Immunfluoreszenz Doppelmarkierungen von STAT1, STAT2, MX und PKR mit Markern für Oligodendrozyten (Nogo A), Astrozyten (GFAP) und Mikroglia/Makrophagen (IBA 1), sowie Doppelmarkierungen von STAT1, STAT2 und MX mit CDV-Antigen durchgeführt. Zusätzlich wurden transkriptionelle Veränderungen in der IFN-I Signalkaskade während einer Staupevirusinfektion unter Verwendung von bereits veröffentlichten Microarraydaten (ULRICH et al.
2014) untersucht und mit den Ergebnissen der Proteinexpression verglichen.
Die Ergebnisse der durchgeführten Studie zeigen eine Aktivierung des IFN-I Signalwegs in frühen Stadien der CDV-induzierten Leukoenzephalitis im Kleinhirn von Hunden. Eine Aufregulation der IFN-I Expression wurde in keinem Stadium der CDV-Infektion nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass CDV in der Lage ist, die IFN-I Antwort zu modulieren oder zu hemmen. Trotz dieser Feststellung zeigte die vermehrte Expression der ISGs, dass IFN-I-unabhängige Signalwege existieren, die eine antivirale Wirkung ausüben.
Bezüglich MX, PKR, OAS und ISG15 wurden sowohl auf der RNS als auch Proteinebene signifikante Unterschiede zwischen CDV-infizierten und Kontrolltieren nachgewiesen. Insbesondere in Oligodendrozyten und Neuronen war eine starke Proteinexpression der untersuchten ISGs und der Transkriptionsfaktoren STAT1 und STAT2 festzustellen. In aktivierter Mikroglia/Makrophagen fand sich STAT1, STAT2 und MX-Protein, jedoch wurde in kaninen Mikroglia/Makrophagen kein aktiviertes PKR nachgewiesen. Astrozyten exprimierten STAT1-, MX- und PKR-Protein, enthielten aber weder aktiviertes noch inaktiviertes STAT2-Protein.
Auffallend an der MX-Immunfluoreszenz war, dass in Astrozyten eine überwiegend in Zellmembrannähe gelegene Expression vorlag. Die deutlichste Assoziation zu den CDV-Läsionen zeigte sich für MX-Proteine. In Doppelmarkierungen zwischen MX bzw. STAT1 und CDV-Antigen fanden sich nur vereinzelt doppelt positive Zellen.
Die starke Aufregulation der ISGs hemmt sehr wahrscheinlich die Virusreplikation und trägt zu der typischen kontinuierlichen Abnahme des CDV-Antigens während des Fortschreitens der Staupeenzephalitis bei. Die Restriktion des CDV-Antigens in Oligodendrozyten und Neuronen ist wahrscheinlich auf die Proteinexpression der untersuchten ISGs in diesen Zellen zurückzuführen. Bei PKR wurde ein Speziesunterschied in der zellulären Expression entdeckt, da anders als in der
Maus kanine Makrophagen/Mikroglia nicht in der Lage sind aktiviertes PKR-Protein zu exprimieren. Die Expression von MX kann möglicherweise, anders als bisher beschrieben, nicht nur über den JAK-STAT-Signalweg erfolgen, sondern auch durch andere (intra- oder extrazellulär aktivierte) Signalwege induziert werden.
MX ist durch die deutliche Läsionsassoziation von den untersuchten ISGs der vielversprechendste Marker, um bei einer nicht-eitrigen Enzephalitis mit unbekannter Ätiologie als Indiz für eine virale Infektion verwendet zu werden. Da nur vereinzelte Zellen zeitgleich und CDV exprimieren, scheint die MX-Expression jedoch nicht direkt virusabhängig zu sein. Der zweite in dieser Arbeit untersuchte Marker, der laut Literatur als virusspezifisch gilt, ist STAT2. Aufgrund des verwendeten Antikörpers, der aktiviertes und nicht- aktiviertes STAT2-Protein detektiert, kann keine abschließende Aussage getroffen werden, ob ein gegen aktiviertes STAT2 gerichteter Antikörper spezifisch und sensitiv genug wäre, um bei einer nicht-eitrigen Enzephalitis mit unbekannter Ätiologie einen Hinweis auf eine virale Infektion zu bekommen. Diesen Antikörper gegen aktiviertes und nicht-aktiviertes STAT2 bei der Untersuchung zur Pathogenese einer CDV-Infektion zu verwenden, hat sich im Nachhinein dennoch als großer Vorteil herausgestellt:
Kanine Astrozyten exprimieren keine STAT2-Proteine – weder in aktivierter noch inaktiver Form – deshalb kann weder der klassische IFN-I-Signalweg über die Vermittlung via STAT1/STAT2-Heterodimerbildung noch die verzögerte Immunantwort über STAT2/IRF9-Komplexe ablaufen. Durch die fehlenden STAT2-Proteine in Astrozyten findet kaum eine Behinderung der Virusreplikation über den IFN-I-Signalweg in diesen Zellen statt. Dieser Defekt des STAT2-Signalwegs in Astrozyten erklärt, dass bis zu 95 % aller Antigen-positiven Zellen in CDV-Läsionen Astrozyten sind. Der Defekt des STAT2-Signalwegs in Astrozyten könnte eine große Bedeutung in der initialen Phase der Demyelinisierung besitzen, die als direkt virusabhängig beschrieben wird. Die genaue Rolle von IFN-I und ISGs in den immunpathologischen Mechanismen der zweiten Phase der Demyelinisierung ist weiterhin weitestgehend unklar. Die starke Aktivierung der IFN-I-Signalkaskade insbesondere in aktivierten Mikroglia / Makrophagen trägt jedoch wahrscheinlich zu diesen immunvermittelten Mechanismen der Demyelinisierung in späteren Stadien der Staupe bei.
Abschließend lässt sich sagen, dass der IFN-I-Signalweg in frühen Stadien der Staupeenzephalitis aktiviert wird und die Virusreplikation insbesondere in
Oligodendrozyten und Neuronen durch die Expression verschiedener ISGs blockiert wird. Der nachgewiesene Mangel an STAT2-Protein in Astrozyten kann als Ursache für die beschriebene hohe CDV-Proteinexpression in diesen Zellen angesehen werden. Dieser STAT2-Mangel in Astrozyten spielt wahrscheinlich eine entscheidende Rolle bei der primären, Virus-induzierten Phase der Demyelinisierung. In der zweiten, immunvermittelten Phase trägt wahrscheinlich die starke Aktivierung des IFN-I Signalwegs insbesondere in aktivierten Mikroglia/Makrophagen zum progressiven Fortschreiten der demyelinisierenden Staupeenzephalitis bei.
7 Summary
The importance of the type I interferon signaling pathway in the dog, with special focus on canine distemper virus infection
Daniela Klotz
Type I interferons (IFN-I) have antiviral, antiproliferative and immunomodulatory properties. The dog has with IFN α, IFN β, IFN ε and IFN ĸ a relatively low number of IFN-I subtypes compared to other species. Using published sequences, 5 different IFN α subtypes were identified in the dog genome. All subtypes of IFN-I are clustered on chromosome 11 in the canine genome. IFN α and IFN β are known antiviral effectors. The properties of the other subtypes are currently largely unclear.
In veterinary medicine IFN-I is already used with the approved recombinant feline IFN-ω (Virbagen® Omega, Virbac S.A., France) for treatment of canine parvovirus infection. Furthermore, the role of IFN-I in the pathogenesis and therapeutic use of IFN-I in dogs is currently under-investigated.
In this work, the role of IFN-I as well as selected interferon-stimulated genes (ISG) in canine distemper virus (CDV) infection in the central nervous system (CNS) was investigated. For this purpose, paraffin-embedded cerebellar tissue from 15 dogs with spontaneous distemper encephalitis, as well as paraffin-embedded cerebellar tissue from 6 dogs without a pathological change in the CNS were selected as control animals from the archive of the Department of Pathology of the University of Veterinary Medicine Hannover. 130 lesions of the CDV-infected animals were categorized into group 2 (CDV antigen without lesion), 3 (acute CDV lesion), 4 (subacute CDV lesion) and 5 (chronic CDV lesion) by histology (hematoxylin-eosin stain, Luxol fast blue stain) and immunohistology (CDV antigen; D110). Of the control animals, 53 areas in the white matter of the cerebellum were randomly selected (Group 1). Immunohistochemistry for the detection of IRF (interferon regulatory factor) 3, IRF7, STAT (Signal transducer and activator of transcription) 1, STAT2, ISG15, OAS (2`5`-oligoadenylate synthetase), PKR (protein kinase R) and MX (Myxovirus resistance protein) and a morphometric measurement of protein expression was performed. In addition, double-labeling of STAT1, STAT2, MX and PKR with markers for oligodendrocytes (Nogo A), astrocytes (GFAP) and microglia / macrophages (IBA 1) and double labeling of STAT1, STAT2 and MX with CDV
antigen were performed by immunofluorescence. Furthermore, transcriptional changes in the IFN-I signaling cascade during CDV infection using previously published microarray data (ULRICH et al., 2014) were examined and compared with results of the protein expression.
The results of the study show activation of the IFN-I signaling pathway in early stages of CDV-induced leukoencephalitis in the cerebellum of dogs. Up-regulation of IFN-I expression was not detected at any stage of CDV infection, suggesting that CDV is able to modulate or inhibit the IFN-I response. Despite this finding, increased expression of ISGs revealed, that IFN-I-independent signaling pathways exist that exert an antiviral effect.
Regarding MX, PKR, OAS, and ISG15, significant differences were found between CDV-infected and control animals at both the RNA and protein levels. Especially in oligodendrocytes and neurons a strong protein expression of the investigated ISGs and the transcription factors STAT1 and STAT2 was observed. In activated microglia / macrophages, STAT1, STAT2 and MX protein were found, but no activated PKR was detected in canine microglia / macrophages. Astrocytes expressed STAT1, MX and PKR protein, but contained no activated or inactivated STAT2 protein. A striking feature of the MX immunofluorescence was that in astrocytes an expression was predominantly located close to the cell membrane.
The clearest association with the CDV lesions was evident for MX proteins. Using double-immunofluorescence targeting MX and CDV antigen or STAT1 and CDV antigen, only a few doubly positive cells were found.
The strong upregulation of the ISGs most likely inhibits viral replication and contributes to the typical continuous decrease of the CDV antigen during the progression of distemper encephalitis. Restriction of the CDV antigen in oligodendrocytes and neurons is probably due to protein expression of the ISGs detected in these cells. In PKR, a species difference in cellular expression has been discovered, canine macrophages / microglia are incapable of expressing activated PKR protein whereas murine microglia / macrophages do not. Unlike previously described the expression of MX is maybe not only restricted via the JAK-STAT pathway, but may also be induced by other (intra- or extracellularly activated) signaling pathways.
MX is the most promising marker to use in the case of non-purulent encephalitis of unknown etiology as a sign of viral infection, due to the clear lesion association of the investigated ISGs. However, since only a few cells simultaneously express MX and CDV, MX expression does not appear to be directly virus dependent. The second marker investigated in this study, which is considered virus-specific by literature, is STAT2. Based on the antibody used, which detects activated and non-activated STAT2 protein, no conclusive statement can be made as to whether an antibody directed against activated STAT2 would be specific and sensitive enough to indicate an indication of non-purulent encephalitis of unknown etiology to get a hind for viral infection. However, using this antibody against activated and unactivated STAT2 in the study of the pathogenesis of CDV infection has nevertheless turned out to be a great advantage: Canine astrocytes do not express STAT2 proteins - neither in activated or inactive form - therefore neither the classical IFN-I signaling via mediation via STAT1 / STAT2 heterodimer formation nor the delayed immune response via STAT2 / IRF9 complexes can be activated in these cells. The lack of STAT2 proteins in astrocytes hardly inhibits virus replication via the IFN-I signaling pathway in these cells. This defect in the STAT2 signaling pathway in astrocytes explains that up to 95% of all antigen-positive cells in CDV lesions are astrocytes. The defect of the STAT2 signaling pathway in astrocytes could be of great importance in the initial phase of demyelination, which is described as being directly virus dependent. The exact role of IFN-I and ISGs in the immunopathological mechanisms of the second phase of demyelination remains largely unclear. The strong activation of the IFN-I signaling cascade, in particular in activated microglia / macrophages, however, probably contributes to these immune-mediated mechanisms of demyelination in later stages of distemper.
In conclusion, the IFN-I signaling pathway is activated in early stages of distemper encephalitis and viral replication is blocked, in particular in oligodendrocytes and neurons, by the expression of various ISGs. The demonstrated lack of STAT2 protein in astrocytes can be considered as the cause of the described high CDV protein expression in these cells. This STAT2 deficiency in astrocytes probably plays a crucial role in the primary, virus-induced phase of demyelination. In the second immune-mediated phase, the strong activation of the IFN-I signaling pathway, especially in activated microglia / macrophages, most likely contributes to progression of demyelinating distemper encephalitis.
8 Literaturverzeichnis
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AKIRA, S. u. K. TAKEDA (2004): Toll-like receptor signalling. Nat Rev Immunol 4, 499-511
ALBERT, M., M. BECARES, M. FALQUI, C. FERNANDEZ-LOZANO u. S. GUERRA (2018): ISG15,
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