Zur Untersuchung des intestinalen Expressionsmusters von H1R, H2R und H4R bei gesunden und kranken Tieren wurden Gewebeschnitte des Magendarmtraktes von Kontrolltieren und die Bioptate der Tiere der Erkrankungsgruppen immunhistochemisch gefärbt.
Zunächst wurde die optimale Verdünnung von Primär- und Sekundärantikörpern im Rahmen von Vorversuchen ermittelt. Gleichzeitig wurde eine Verstärkungsreaktion mit biotinyliertem Tyramin zur Verbesserung des Reaktionsbildes für alle durchgeführten Untersuchungen etabliert.
3.3.1 Antikörper und Seren
Zur Darstellung der Expression der Histaminrezeptoren 1, 2 und 4 wurden die Paraffinschnitte nach der Vorbehandlung (Entparaffinierung, Rehydratisierung und Hemmung der endogenen Peroxidase) einer Demaskierung in kochendem Zitratpuffer unterzogen. Nach der Inkubation mit dem Blockserum wurden die Schnitte mit polyklonalen Primärantikörpern gegen H1R, H2R und H4R inkubiert. Die Verdünnung der Primärantikörper erfolgte mit PBS-Pufferlösung, dem 1% BSA zugesetzt wurde. Nach Inkubation über Nacht wurde der Zweitantikörper aufgetragen, welcher am Vortag mit PBS-Pufferlösung und 20% inaktiviertem Hundeserum angesetzt worden war. Vor dem Auftragen wurde dieser Ansatz des
Zweitantikörpers kurz zentrifugiert. Diese Behandlung unterdrückt unspezifische Bindungen des Zweitantikörpers an kanine Proteinstrukturen auf dem Schnitt und vermindert die unspezifische Markierung von Plasmazellen in der Lamina propria mucosae.
Die Antikörper wurden aliquotiert, teils vorverdünnt und bei -20°C gelagert. Genauere Angaben zu Art, Herkunft und Verdünnungen sowie zum Detektionssystem für die Primärantikörper sowie zu den verwendeten Zweitantikörpern finden sich in Tabelle 8.
Ergänzend muss erwähnt werden, dass der Antikörper gegen H4R aufgrund der vergleichsweise hohen, eingesetzten Konzentration nachgekauft werden musste.
Das Produkt wurde jedoch vom ursprünglichen Anbieter (Novus Biologicals; USA) zu diesem Zeitpunkt nicht mehr vertrieben. Bei dem Antikörper von Acris Antibodies, Herford, handelt es sich um das Ersatzprodukt, welches gegen dasselbe Immunogen gerichtet ist (persönliche Korrespondenz mit Acris Antibodies GmbH, Herford vom 19.10.2011).
Tabelle 8: Verwendete Primär- und Sekundärantikörper und Verdünnungen
Darstellung von
Block-serum Erstantikörper (Hersteller) Zweitantikörper (Hersteller)
(Abcam, Cambridge, UK) Horse anti-goat 1:200 (Vector Laboratories,
Die Anwendung einer Verstärkungsreaktion ermöglicht eine Erhöhung der Antikörpersensitivität, eine Reduzierung der Hintergrundfärbung und verringert den Einsatz von Erstantikörper durch Verwendung höherer Verdünnungen. Bei der
Verstärkungsreaktion mit biotinyliertem Tyramin (tyramine amplification technique, TAT) werden durch Bindung des Tyramins an den Avidin-Biotin-Enzymkomplex zusätzliche Bindungsstellen geschaffen. In einem weiteren Schritt wirkt das an Tyramin gekoppelte Biotin als Tracer-Molekül und bindet weitere Avidin-Biotin-Enzymkomplexe, die im Folgenden das verwendete Chromogen umsetzen (VON WASIELEWSKI et al. 1997; MENGEL et al. 1999, RAMOS-VARA 2005). Durch die Erhöhung der Bindungsstellen und damit der gebundenen Peroxidase kommt es zu einer Verstärkung des Farbsignals. Diese Verstärkungstechnik funktioniert für viele Antikörper, zeigt aber hohe Variabilitäten bezüglich des Verstärkungseffekts, der durch viele Faktoren beeinflusst wird (Art des Gewebes, Tyraminkonzentration, Konzentration des Erstantikörpers, Menge der vorhandenen Epitope) und muss für jeden Antikörper getestet werden (VON WASIELEWSKI et al. 1997; MENGEL et al.
1999). Weiterhin muss eine falsch positive Färbung durch Bindung des Detektionssystems an endogenes Biotin durch adäquate Negativkontrollen sicher ausgeschlossen werden (HORLING et al. 2012).
In den Vorversuchen konnte bei Anwendung der Verstärkungsreaktion nach VON WASIELEWSKI et al. (1997) mit biotinyliertem Tyramin keine Abweichung des Reaktionsmusters an den verwendeten Schnittpräparaten festgestellt werden. Die Negativkontrollen zeigten keine unspezifische Färbung von Gewebestrukturen.
3.3.3 Unspezifische Hintergrundfärbung
Neben der Verwendung einer Verstärkungsreaktion wurden weitere Maßnahmen zur Verminderung einer unspezifischen Hintergrundreaktion ergriffen. Die Hemmung der endogenen Peroxidase des Gewebes, die zur unspezifischen Farbstoffumsetzung des ABC-Detektionssystems führen kann, erfolgte durch Inkubation in 0,5%igem Wasserstoffperoxid im Anschluss an die Entparaffinierung und Rehydratisierung. Vor dem Auftragen des Erstantikörpers wurde mit verdünntem Normalserum geblockt.
Hierbei werden elektrostatische Ladungen von Proteinen gesättigt und unspezifische, hydrophobe Bindungen verhindert, sodass der Primärantikörper nur spezifische Bindungen mit dem gesuchten Epitop eingehen kann. Dabei wurde Normalserum derjenigen Tierart verwendet, aus welcher der Sekundärantikörper stammt. Weiterhin
wurde dem Verdünnungsmedium (Antikörperpuffer) 1% BSA (Bovines Serumalbumin) zugesetzt, welches zusätzlich hydrophobe Immunglobuline bindet und eine unspezifische Bindung dieser am Gewebe vermindert. Nachdem sich in den Vorversuchen in der Negativkontrolle unter Auslassung des Primärantikörpers wenige zytoplasmatisch positive Zellen in der Lamina propria mucosae (vermutlich Plasmazellen) feststellen ließen, erfolgte ein Zusatz von 20% inaktiviertem Hundenormalserum zum Sekundärantikörper. Dieser Ansatz wurde über Nacht bei 4°C inkubiert und vor der Verwendung kurz abzentrifugiert. Dadurch sollten unspezifische Reaktionen des Sekundärantikörpers mit tierartspezifischen Proteinstrukturen abgesättigt werden. Die unspezifische Anfärbung der Zellen in der Lamina propria mucosae ließ sich durch diese Behandlung vollständig beseitigen.
Ein weiteres, bekanntes Problem ist die unspezifische Anfärbung von Mastzellen (BUSSOLATI und GUGLIOTTA 1983; HARLEY et al. 2002) bei der Verwendung eines kommerziellen ABC-Nachweissystems. Zur Verhinderung dieser Reaktion wurde der pH-Wert des Puffers, in welchem die Substrate des ABC-Kits verdünnt werden, von 7,4 auf 9,4 erhöht. Diese Methode hemmt die Reaktion des basischen Proteins Avidin mit den Sulfatgruppen des Heparins der Mastzellen und somit die unspezifische Anfärbung (BUSSOLATI und GUGLIOTTA 1983).
3.3.4 Kontrollen
Zur Überprüfung der immunhistochemischen Reaktion wurden sowohl Reaktionskontrollen als auch Spezifitätskontrollen durchgeführt.
Die Positivkontrollen wurden teilweise als interne Positivkontrollen nach Angaben des Herstellerdatenblattes genutzt. Der Antikörper gegen H1R sollte eine positive Reaktion der glatten Muskulatur des Dünndarms aufweisen. Der gegen H4R gerichtete Antikörper reagiert mit Lymphozyten im Lymphknoten aber auch in Peyer-Platten. Für den Antikörper gegen H2R wurde Tonsillengewebe genutzt.
Als Negativkontrollen wurden Gewebeschnitte der Kontrollhunde mitgeführt, bei denen an Stelle des Erstantikörpers ausschließlich Antikörperpuffer eingesetzt wurde. Zusätzlich erfolgten Versuche, in denen der Erstantikörper durch Serum von
nicht immunisierten Ziegen (Ziegennormalserum) ersetzt wurde. Dabei wurde das Normalserum so weit verdünnt, dass die IgG-Konzentration des verdünnten Normalserums annähernd der IgG-Konzentration des Antikörpers in der Gebrauchsverdünnung entsprach (ausgehend von 18-24 mg/ml IgG im Ziegennormalserum).
Aufgrund aktueller Forschungsergebnisse (BEERMAN et al. 2012) wurde zur Absicherung der Antikörperspezifität zusätzlich eine Absorptionsreaktion für die Primärantikörper gegen H1R und H2R durchgeführt. Dabei wurden verschiedene Konzentrationsstufen kommerziell erhältlicher Blocking-Peptide, die dem Immunisierungspeptid bei der Antikörperherstellung entsprechen, mit dem Antikörper versetzt, über Nacht bei 4°C inkubiert und vor Verwendung kurz abzentrifugiert.
3.3.5 Protokoll der immunhistochemischen Reaktionen
Der immunhistochemische Nachweis der Antigene erfolgte mittels Avidin-Biotin-Komplex (ABC)-Methode nach folgendem Protokoll. Die Angaben zu Vorbehandlungen, verwendeten Antikörpern und Verdünnungen finden sich in Tabelle 8.
Erster Tag
1. Entparaffinieren und Rehydrieren der Paraffinschnitte für jeweils 5 Minuten in einer absteigenden Alkoholreihe (Roti-Histol 1 bis 3, Isopropanol, 96%iges und 70%iges Ethanol).
2. Hemmung der endogenen Peroxidase in einer 0,5%igen Wasserstoffperoxid-Lösung (197 ml 70%iges Ethanol und 3 ml 30%iges Wasserstoffperoxid).
3. Dreimaliges Spülen der Schnitte für je 5 Minuten in PBS-Pufferlösung unter langsamem Rühren.
4. Hitzeinduzierte Demaskierung der Antigene durch Kochen der Schnitte in Zitratpuffer für 20 Minuten in der Mikrowelle bei 750 Watt.
5. Dreimaliges Spülen der Schnitte für je 5 Minuten in PBS-Pufferlösung unter langsamem Rühren.
6. Überführen der Schnitte in Shandon Coverplates.
7. Überschichten der Schnitte mit 1:5 verdünntem inaktiviertem Normalserum und Inkubation für 20 Minuten bei Raumtemperatur zur Blockierung elektrostatischer Bindungsstellen.
8. Auftragen des verdünnten Erstantikörpers (jeweilige Verdünnung in PBS mit 1%igem bovinen Serumalbumin) und Inkubation über Nacht bei 4°C.
9. Ansetzen des jeweiligen Zweitantikörpers: Verdünnung 1:200 in PBS mit 1%igem bovinen Serumalbumin und 20%igem inaktivierten Hundenormalserum und Inkubation über Nacht bei 4°C.
Zweiter Tag
10. Spülen der Schnitte durch dreimaliges Überschichten mit PBS-Pufferlösung für je 5 Minuten.
11. Auftragen des verdünnten Zweitantikörpers und Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
12. Spülen der Schnitte durch dreimaliges Überschichten mit PBS-Pufferlösung für je 5 Minuten.
13. Auftragen des ABC-Reagenz und Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur.
14. Spülen der Schnitte durch dreimaliges Überschichten mit PBS-Pufferlösung für je 5 Minuten.
15. Überschichten der Schnitte mit Biotinyl-Thyramid in 0,2%igem Wasserstoffperoxid und Inkubation für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
16. Spülen der Schnitte durch dreimaliges Überschichten mit PBS-Pufferlösung für je 5 Minuten.
17. Auftragen des ABC-Reagenz und Inkubation für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
18. Spülen der Schnitte durch dreimaliges Überschichten mit PBS-Pufferlösung für je 5 Minuten.
19. Aufbringen von 4 Tropfen AEC-Lösung pro Schnitt und Inkubation für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
20. Überschichten der Schnitte mit PBS-Pufferlösung zum Abstoppen der Farbreaktion und Verbringen der Schnitte in eine Küvette.
21. Spülen der Schnitte für 10 Minuten in fließendem Leitungswasser.
22. Gegenfärbung in Hämalaun nach Mayer für 45 Sekunden.
23. Bläuen der Schnitte für 10 Minuten in fließendem Leitungswasser.
24. Eindecken der Schnitte mit Mounting-Medium.