Prinzip der Immunhistochemie und deren Fehlerquellen

Die immunhistochemische Methodik nutzt markierte Antikörper zur Darstellung von Antigenen in situ (POLAK und VAN NOORDEN 1987). Dabei existiert eine Vielzahl von Methoden und Möglichkeiten, die eine direkte oder indirekte Antigenmarkierung, die Verwendung monoklonaler und polyklonaler Antikörper sowie den Einsatz verschiedener Enzyme und Detektionssysteme erlauben (NOLL und SCHAUB-KUHNEN 2000; POLAK und VAN NOORDEN 1987).

Die in dieser Arbeit verwendete immunhistochemische Technik basiert auf der Verwendung eines spezifischen, unkonjugierten Erstantikörpers, der das Antigen im Gewebe bindet. Im zweiten Schritt wird ein gegen die Donatorspezies des Primärantikörpers gerichteter, biotinylierter Zweitantikörper verwendet. Mittels ABC-Methode (Avidin-Biotin-Komplex) wird ein Strepavidin-Biotinenzymkomplex an den Zweitantikörper gekoppelt. In einem weiteren Schritt bindet biotinyliertes Tyramin an diesen ABC-Komplex und es entstehen in Zusammenwirkung mit Wasserstoffperoxid weitere Bindungsstellen, die wiederum von den erneut hinzugefügten Streptavidin-Biotin-Enzymkomplexen belegt werden und so eine Signalverstärkung bewirken. Die an den ABC-Komplex gebundene Peroxidase setzt das zugegebene Chromogen (AEC, 3-Amino-9-Ethyl-Carbazol) in ein rot gefärbtes Reaktionsendprodukt um und detektiert damit das Antigen als Farbstoffniederschlag am Ort der Reaktion.

Die Fehlerquellen und Schwierigkeiten der Immunhistochemie sind vielfältig und können sowohl in der Fixierung und Behandlung der zu untersuchenden Gewebeproben als auch in der Auswahl der verwendeten Antikörper und Reagenzien sowie der Abfolge der Reaktionsschritte des Protokolls begründet liegen (NOLL und SCHAUB-KUHNEN 2000).

Die Anforderungen an einen „guten Antikörper“ beinhalten eine hohe Affinität und spezifische Bindung an das gewünschte Antigen, eine ausgeprägte Avidität des Antikörpers sowie den Einsatz in einer möglichst hohen Verdünnung, um unspezifische Reaktionen zu minimieren (POLAK und VAN NOORDEN 1987). Die Verwendung von polyklonalen Antikörpern birgt im Vergleich zu monoklonalen Antikörpern die Gefahr, dass es durch unerwünschte Kreuzreaktionen mit anderen, strukturell ähnlichen Antigenen zu falsch positiven Ergebnissen kommt (NOLL und SCHAUB-KUHNEN 2000). Die Spezifität und Sensitivität von Antikörpern kann stark differieren, vor allem beim Vergleich zweier Antikörper, die unterschiedliche Epitope desselben Antigens detektieren (LEONG und LEONG 2011). Weiterhin gehören kommerziell angebotene Antikörper oft in die Kategorie „research use only“ (nur für Forschungszwecke), deren Herstellung nicht unter Einhaltung festgelegter, stringenter Bestimmungen erfolgt (CHU und WEISS 2009).

Die Fixation und Einbettung des Gewebes kann zur Veränderung der Tertiärstruktur von Proteinen führen und eine Schädigung der antigenen Strukturen von Proteinen und Peptiden herbeiführen (NOLL und SCHAUB-KUHNEN 2000). Auch können sich lange Lagerungsdauer und hohe Lagerungstemperaturen von Schnittpräparaten negativ auf die Epitopstabilität auswirken und zu einer reduzierten Reaktionsintensität führen (VAN DEN BROEK und VAN DE VIJVER 2000). Für die immunhistochemische Antigendetektion an Paraffingewebe ist häufig eine Antigendemaskierung durch Hitzeeinwirkung oder enzymatische Wirkung notwendig, welche durch die Fixation entstandene Aldehydvernetzungen von Proteinen löst und dadurch Epitope freilegt (NOLL und SCHAUB-KUHNEN 2000). Bezüglich der hitzeinduzierten Methoden zur Antigendemaskierung erzielen höhere Temperaturen in der Regel bessere Ergebnisse und bewirken nicht nur eine Verstärkung des

positiven Signals, sondern reduzieren auch in vielen Fällen unspezifische Hintergrundreaktionen (SHI et al. 1997). Die Einhaltung der genauen Reaktionstemperaturen und –zeiten ist hierbei von besonderer Bedeutung (LEONG und LEONG 2011). Zur Verhinderung unspezifischer Färbungen können Nicht-Immunseren zur Absättigung elektrostatischer Ladungen auf dem Gewebeschnitt eingesetzt werden. Eine Hemmung der endogenen Enzymaktivität ist notwendig, um eine Umsetzung des Chromogens durch gewebeeigene Enzyme und damit eine unspezifische Färbung zu verhindern (NOLL und SCHAUB-KUHNEN 2000). Eine weitere Problematik beschreiben HORLING et al. (2012), die eine unspezifische Färbung in und um nervale Plexus im Gastrointestinaltrakt von Ratten festgestellt haben. Diese Problematik entsteht durch endogenes Biotin, welches als zusätzliche Bindungsstelle für Streptavidin fungiert und trat bei der Verwendung von Gefrierschnitten auf (SHI et al 1997; HORLING et al. 2012). Dennoch betonen die Autoren die Wichtigkeit einer adäquaten Negativkontrolle bei Verwendung eines Streptavidin-haltigen Detektionssystems. Eine stärkere Färbung von Zellen in Bereichen des Schnittrandes kann durch den edge effect (Randeffekt) auftreten.

Dieser entsteht infolge stärkerer Fixation des Gewebes in diesen Bereichen oder durch Einsickern der Reagenzien unter den Gewebeschnitt und Reaktion an beiden Oberflächen des Gewebes (RAMOS-VARA 2005; LEONG und LEONG 2011).

Schnittartefakte wie Risse oder Falten sowie nekrotische Bereiche oder apoptotische Zellen im Gewebe können eine falsch-positive Farbreaktion hervorrufen (LEONG und LEONG 2011).

Aufgrund dieser Schwierigkeiten sichert nicht zuletzt die Verwendung adäquater Kontrollen die Ergebnisse einer immunhistochemischen Untersuchung. Man unterscheidet Reaktionskontrollen, die die Funktionsweise der Methodik und der verwendeten Reagenzien betreffen und Spezifitätskontrollen, die die spezifische Bindung des Antikörpers überprüfen (POLAK und VAN NOORDEN 1987; NOLL und SCHAUB-KUHNEN 2000; LEONG und LEONG 2011).

Als Positivkontrolle sollte ein bei der immunhistochemischen Reaktion mitgeführtes Gewebe oder eine im untersuchten Gewebe vorhandene Zellpopulation (interne bzw.

endogene Kontrolle) dienen, welche sicher positiv reagiert (POLAK und VAN NOORDEN 1987; NOLL und SCHAUB-KUHNEN 2000; LEONG und LEONG 2011).

Die Negativkontrollen dienen dem Ausschluss von unspezifischen Reaktionen des Primärantikörpers und des Detektionssystems. Negativkontrollen können unter Auslassung des Erstantikörpers oder Ersetzen des Erstantikörpers durch nicht immunisiertes Serum bzw. Verwendung eines unpassenden Antikörpers erfolgen.

Eine weitere Möglichkeit stellt die Verwendung von Gewebe dar, welches das Antigen sicher nicht enthält (POLAK und VAN NOORDEN 1987; NOLL und SCHAUB-KUHNEN 2000; LEONG und LEONG 2011).

Zur Überprüfung der Antikörperspezifität kann eine Absorptionsreaktion durchgeführt werden, wobei das Antiserum vor der Verwendung mit dem spezifischen Antigen inkubiert wird. Der Antikörper bindet an das Antigen und steht für eine Bindung von Antigenen im Gewebe nicht mehr zur Verfügung (kompetetive Hemmung). Zur Überprüfung der Absorptionsreaktion sollte das Antiserum mit einem unpassenden Antigen inkubiert werden (POLAK und VAN NOORDEN 1987; NOLL und SCHAUB-KUHNEN 2000; LEONG und LEONG 2011).

Trotz allem existiert keine Standardisierung für immunhistochemische Protokolle, die eine sichere Reproduzierbarkeit und Übereinstimmung zum Beispiel bei der Durchführung in unterschiedlichen Laboren sichert (LEONG und LEONG 2011).

Unterschiede entstehen dabei nicht nur durch Art und Dauer der Fixation, Lagerung und Lagerdauer von angefertigten Schnittpräparaten, die Verwendung unterschiedlicher Geräte, Reagenzien, Temperaturen und Reaktionszeiten bei der hitzeinduzierten Antigendemaskierung und Antikörperinkubation, sondern auch durch interobserver variability (Untersucher-bedingte Variabilität) bei der Auswertung (LEONG und LEONG 2011). Auch die Verwendung automatisierter Färbesysteme, die eine genauere Kontrolle von Inkubationszeiten und –temperaturen ermöglichen, und computergestützter Auswertungsmethoden löst diese Probleme nicht vollständig, da unterschiedliche Systeme mit verschiedenen Funktionsprinzipien angeboten werden, die eine Reihe weiterer Variablen schaffen (LEONG und LEONG 2011).

2.5.2 Probleme der immunhistochemischen Darstellung im Falle des