Das Ziel der vorliegenden Untersuchung war die Darstellung verschiedener Histaminrezeptoren im Magendarmtrakt des Hundes. Als Methode für die Markierung der Rezeptorproteine wurde die Immunhistochemie gewählt, die eine etablierte und in Forschung und Diagnostik viel genutzte Technik darstellt (RAMOS-VARA 2005).
Trotzdem existieren zahlreiche Fehlerquellen und Limitationen bei der IHC (siehe Kapitel 2.5), die im Rahmen dieser Arbeit v.a. bei der Untersuchung des H4R eine große Rolle spielten. Die kritische Betrachtung und Diskussion der durchgeführten Untersuchungen und Ergebnisse dieser Arbeit ist daher ein wichtiger Bestandteil dieser Arbeit.
Bei den hier verwendeten Antikörpern gegen den humanen H1R und H2R besteht laut Herstellerangaben eine Kreuzreaktivität mit dem kaninen Antigen, was den Einsatz an Geweben vom Hund erlaubt. Diese Angaben basieren jedoch, wie eine Nachfrage bei den Herstellern ergab, lediglich auf Sequenzhomologien zwischen kaninem und humanem Protein des als Immunogen verwendeten Polypeptids. Diese ist mit 93%
für H1R relativ hoch und beträgt für den H2R sogar 100% (persönliche Korrespondenz mit Abcam, UK vom 20.08.2012 und Novus Biologicals, USA vom 23.08.2013).
Zusätzlich wurde für beide Antikörper eine Absorptionsreaktion durchgeführt, die zur Hemmung der Antikörperreaktion führte (siehe Kapitel 4.2.1). Diese Reaktion zeigt, dass die Antikörper tatsächlich an Epitope des als Immunogen verwendeten Polypeptids binden. Es stellte sich jedoch für die Reaktion gegen H2R heraus, dass eine Anfärbung der neuronalen Plexus sowie multipler, filamentöser Strukturen im
Zottenbereich bestehen blieb. Hierbei handelt es sich daher vermutlich um eine unspezifische Reaktion, deren genaue Ursache unklar bleibt. Eine falsch-positive Anfärbung bedingt durch unspezifische Bindungen des Chromogens an Avidinbindungsstellen wie von HORLING et al. (2012) für Gefrierschnitte des murinen Gastrointestinaltraktes beschrieben, kann mit großer Sicherheit ausgeschlossen werden, da die Negativkontrolle unter Auslassung des Primärantikörpers diesen Effekt nicht zeigte. Auch das Vorhandensein von Antikörpern gegen andere Antigene als H2R in der verwendeten Antikörperlösung, was bei polyklonalen Antikörpern der Fall sein kann (RAMOS-VARA 2005), erscheint unwahrscheinlich, da es sich um ein aufgereinigtes Produkt handelt.
LEONG und LEONG (2011) berichten von einem edge effect (Randeffekt), der sowohl durch eine stärkere Fixation des Gewebes in den peripheren Randbereichen des Gewebeschnittes als auch durch Einsickern der Reagenzien unter den Schnitt und daraus resultierender, stärkerer Farbreaktion in diesen Bereichen zustande kommen kann. Bei den im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Gewebeproben handelt es sich um kleine, endoskopisch entnommene Bioptate, sodass die Gefahr einer unzureichenden Fixation zwar kaum besteht, im Verhältnis zur Gesamtgröße der Proben jedoch die Randbereiche überwiegen. Ein Einfluss des von LEONG und LEONG (2011) beschriebenen Randeffekts darf deshalb nicht außer Acht gelassen werden. Zur Minimierung des Randeffektes wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit zwei Lokalisationen der Tunica mucosa (die apikale Expression im Zottenbereich und die basale Expression im Kryptbereich) sowie jeweils, soweit möglich fünf Gesichtsfelder untersucht. Weiterhin ließen sich darüber hinaus statistisch relevante Korrelationen zwischen Histaminrezeptorexpression und Grad der histologischen Läsionen, repräsentiert durch den WSAVA-Score feststellen. Um die hier gezeigten Ergebnisse zu untermauern, könnte zukünftig eine ergänzende quantitative RT-PCR durchgeführt werden um den Anstieg der Histaminrezeptorexpression auch auf mRNA-Ebene nachzuweisen.
Bezüglich des verwendeten Antikörpers gegen H4R ergaben sich im Laufe dieser Untersuchungen gewisse Schwierigkeiten. Es ließen sich zwar ohne weiteres mit
dem ausgewählten Antikörper gegen den humanen H4R und dem hier verwendeten Protokoll (siehe Kapitel 3.3.5) positive Signale im kaninen Gastrointestinaltrakt darstellen, eine aktuelle Studie von BEERMANN et al. (2012) zweifelt jedoch die Epitopspezifität mehrerer, kommerziell erhältlicher Antikörper gegen den humanen und murinen H4R an. Die Autoren zeigten mittels Durchflusszytometrie und Western Blot sowie unter Verwendung von transfizierten Zellen und Geweben aus knock-out-Mäusen, dass die detektierten, positiven Signale nicht durch spezifische Bindungen an das H4R-Rezeptorprotein, sondern durch ein unspezifisches Bindungsverhalten dieser Antikörper hervorgerufen wurden (BEERMANN et al. 2012).
Ähnliche Beobachtungen machten GUTZMER et al. (2012). Eine strukturelle Ähnlichkeit von Rezeptorsubtypen derselben Familie von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, in diesem Fall also von H1R, H2R und H3R, kann möglicherweise ein solches unspezifisches Bindungsverhalten bedingen (MICHEL et al. 2009). Weiterhin sollte in Betracht gezogen werden, dass Rezeptorproteine mit anderen Zellmembrankomponenten interagieren und sich Einflüsse auf Sekundär- und Tertiärstruktur ergeben können, die möglicherweise Unterschiede im fraglichen Epitop bedingen (BEERMANN et al. 2012). Zwar sind die von BEERMAN et al.
(2012) und GUTZMER et al. (2012) verwendeten Antikörper nicht mit den in der vorliegenden Arbeit benutzten Produkten von Novus Biologicals, USA bzw. Acris Antibodies, Herford, identisch, jedoch sind diese teilweise ebenfalls gegen ein Immunogen in der 3. zytoplasmatischen Domäne gerichtet. Dies lässt auf Überschneidungen der Epitope schließen.
MICHEL et al. (2009) berichten darüber hinaus, dass bei vielen Antikörpern gegen Rezeptoren aus der Klasse der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren die Spezifität fraglich ist. Daher fordern MICHEL et al. (2009) und BEERMANN et al. (2012) eine gründliche Validierung solcher Antikörper durch Hersteller und Arbeitsgruppen, die mindestens eine der folgenden vier Kriterien erfüllt. Erstens sollten sich Zellen und Gewebe von knock-out-Modellen sicher negativ in Immunhistochemie und Immunblots darstellen (MICHEL et al. 2009; BEERMANN et al. 2012). Zweitens sollten Zellen und Tiere, die durch genetische Modifikation eine (zeitweise)
verminderte Rezeptorexpression aufweisen, also knock-down-Modelle, ein deutlich reduziertes Signal zeigen (MICHEL et al. 2009; BEERMANN et al. 2012). Eine dritte Option zur Sicherung der Epitopspezifität stellt die Transfektion von verschiedenen Rezeptorsubtypen in eine geeignete Zelllinie dar. Lediglich der fragliche Rezeptor, nicht jedoch die ähnlichen Rezeptorsubtypen sollten eine positive Färbung hervorrufen (MICHEL et al. 2009; BEERMANN et al. 2012). Und viertens sollten mehrere Antikörper gegen verschiedene Epitope des jeweiligen Rezeptorproteins sehr ähnliche Färbemuster bei Verwendung von immunhistochemischen Methoden oder Immunblots aufweisen (MICHEL et al. 2009; BEERMANN et al. 2012).
Untersuchungen zur Validierung des verwendeten Antikörpers wie von MICHEL et al.
(2009) und BEERMANN et al. (2012) gefordert, wurden im Rahmen dieser Arbeit nicht durchgeführt. Darüber hinaus besteht eine vergleichsweise niedrige Homologie von nur 71% zwischen den Aminosäuresequenzen des H4R-Proteins von Mensch und Hund (JIANG et al. 2008), die den Einsatz eines Antikörpers gegen den humanen H4R an kaninen Geweben als suboptimal erscheinen lässt.
Aufgrund dieser Entwicklungen wurde zusätzlich eine in situ-Hybridisierung zum Nachweis von H4R-mRNA im kaninen Magendarmtrakt etabliert. Dabei ist zu beachten, dass mRNA-Expression und eine Expression auf Proteinebene aufgrund translationaler Modifikationen nicht zwingend übereinstimmen müssen (RAMOS-VARA 2005; MICHEL et al. 2009).