Histopathologische, morphometrische und immunhistochemische Untersuchungen zur Phänotypisierung von Immunzellen in Biopsien aus dem Intestinaltrakt von Katzen mit chronischen idiopathischen Darmentzündungen

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Tierärztliche Hochschule Hannover Institut für Pathologie

Histopathologische, morphometrische und immunhistochemische Untersuchungen zur Phänotypisierung von Immunzellen in Biopsien aus dem Intestinaltrakt von Katzen mit chronischen

idiopathischen Darmentzündungen

INAUGURAL-DISSERATION

Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -

(Dr. med. vet.)

Vorgelegt von

Sina Marsilio

(Peine)

Hannover 2007

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Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein

1. Gutachterin: Univ.-Prof. Dr. M. Hewicker-Trautwein

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Meyer

Tag der mündlichen Prüfung: 15.11.2007

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Denen, die an mich glauben

Ich kann, weil ich will, was ich muss

(Immanuel Kant)

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Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ... 1

2 Literaturübersicht ... 2

2.1 Histologischer Aufbau des Intestinaltraktes... 2

2.1.1 Dünndarm... 2

2.1.2 Kolon... 3

2.1.3 GALT – Gut-Associated Lymphoid Tissue ... 3

2.1.3.1 Aggregiertes lymphoretikuläres Gewebe und Peyersche Platten... 4

2.1.3.2 Diffuses lymphatisches Gewebe ... 5

2.1.3.3 Leukozyten der Lamina propria mucosae... 7

2.1.3.4 Orale Toleranz ... 10

2.2 Inflammatory Bowel Disease bei Katze und Hund ... 13

2.2.1 Histopathologische Diagnostik und Befundinterpretation bei IBD... 13

2.2.1.1 Bioptate... 14

2.2.1.2 Histopathologische Veränderungen ... 15

2.2.1.3 Befundinterpretation ... 17

2.2.2 Klassifikation der IBD-Formen bei Katze und Hund ... 18

2.2.2.1 Lymphoplasmazelluläre Enteritis und Kolitis... 19

2.2.2.2 Eosinophile Gastroenteritis, Enteritis, Enterokolitis und Kolitis ... 20

2.2.2.3 Eosinophile granulomatöse Gastroenterokolitis ... 21

2.2.2.4 Chronische eitrige Kolitis ... 21

2.2.2.5 Histiozytäre ulzerative Kolitis des Boxers... 21

2.2.2.6 Transmurale granulomatöse Enterokolitis (regionale Enteritis) ... 22

2.2.2.7 Granulomatöse Enteritis, Kolitis und Enterokolitis ... 23

2.2.2.8 Immunproliferative Enteropathie des Basenjihundes ... 23

2.2.2.9 Diarrhoe-Syndrom des norwegischen Lundehundes ... 23

2.2.3 Ätiologie der IBD... 24

2.2.3.1 Physiologische enterale mikrobielle Flora... 24

2.2.3.2 Pathogene Mikroorganismen ... 26

2.2.3.3 Nahrungsantigene ... 26

2.2.4 Immunpathogenese der IBD... 27

2.2.4.1 Einfluss der mukosalen Integrität auf die Pathogenese der IBD... 28

2.2.4.2 Immunzellen ... 28

2.2.4.3 Zytokine, Mediatoren und Transkriptionsfaktoren ... 30

2.2.5 Klinische Befunde und Differentialdiagnosen bei IBD... 32

2.2.5.1 Defizitäre Erscheinungen... 32

2.2.5.2 Extraintestinale Erkrankungen... 33

2.2.5.3 Klinische Befunde ... 34

2.2.5.4 Differentialdiagnosen ... 35

2.2.6 Management und Therapie... 36

2.2.6.1 Diätetische Maßnahmen ... 36

2.2.6.2 Pharmakotherapeutische Maßnahmen ... 37

3 Material und Methoden ... 39

3.1 Untersuchungsmaterial ... 39

3.1.1 Kontrolltiere ... 39

3.1.2 Katzen mit chronischer idiopathischer lymphoplasmazellulärer Enterokolitis (IBD-Tiere) ... 40

3.2 Präparation der Gewebeproben für die Histopathologie und Immunhistochemie... 42

3.3 Physikochemische Färbungen... 43

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II

3.3.1 Histologische Beurteilungskriterien ... 43

3.4 Immunhistochemie... 47

3.4.1 Antikörper, Seren, Chromogen und Kontrollen ... 47

3.4.1.1 Primäre Antikörper ... 47

3.4.1.2 Kontrollseren ... 48

3.4.1.3 Sekundärantikörper... 49

3.4.1.4 Blockseren ... 49

3.4.1.5 Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC-Komplex) ... 49

3.4.1.6 Chromogen ... 49

3.4.1.7 Kontrollen ... 50

3.4.2 Demaskierungsverfahren... 50

3.4.3 Immunhistochemische Untersuchungsmethode ... 51

3.4.3.1 Protokoll der immunhistochemischen Untersuchungen... 53

3.4.4 Computergestützte Morphometrie... 56

3.4.4.1 Digitale Fotodokumentation und Bildverarbeitung mit der PC-Software analySIS^® 3.1.... 56

3.4.4.2 Morphometrische Analyse ... 56

3.5 Statistische Auswertung ... 58

4 Ergebnisse ... 59

4.1 Ergebnisse der histologischen Untersuchung ... 59

4.1.1 Ergebnisse der histologischen Untersuchung von Bioptaten der Kontrolltiere ... 59

4.1.2 Ergebnisse der histologischen Untersuchung von Bioptaten der IBD-Tiere ... 59

4.1.2.1 Histopathologische Befunde extraintestinaler Bioptate ... 67

4.2 Ergebnisse der immunhistochemischen Reaktionen... 68

4.2.1 Reaktionsmuster der CD3⁺Zellen ... 68

4.2.2 Reaktionsmuster der Plasmazellen ... 68

4.2.3 Reaktionsmuster der L1⁺ Zellen ... 68

4.3 Ergebnisse der computergestützten Morphometrie ... 69

4.3.1 CD3⁺ Zellen ... 70

4.3.1.1 Verteilung der CD3⁺ Zellen innerhalb der Gruppe der Kontrolltiere ... 70

4.3.1.2 Verteilung von CD3⁺ Zellen innerhalb der Gruppe der IBD-Tiere... 71

4.3.1.3 Gruppenvergleich ... 72

4.3.2 IgA-Plasmazellen ... 79

4.3.2.1 Verteilung von IgA-Plasmazellen innerhalb der Gruppe der Kontrolltiere ... 79

4.3.2.2 Verteilung von IgA-Plasmazellen innerhalb der Gruppe der IBD-Tiere ... 80

4.3.3 IgG-Plasmazellen ... 88

4.3.3.1 Verteilung der IgG-Plasmazellen innerhalb der Gruppe der Kontrolltiere ... 88

4.3.3.2 Verteilung IgG-Plasmazellen innerhalb der Gruppe der IBD-Tiere ... 89

4.3.4 IgM-Plasmazellen ... 94

4.3.4.1 Verteilung von IgM-Plasmazellen innerhalb der Gruppe der Kontrolltiere... 94

4.3.4.2 Verteilung von IgM-Plasmazellen innerhalb der Gruppe der IBD-Tiere... 95

4.3.5 L1⁺ Zellen... 100

4.3.5.1 Verteilung von L1⁺ Zellen innerhalb der Gruppe der Kontrolltiere... 100

4.3.5.2 Verteilung von L1⁺ Zellen innerhalb der Gruppe der IBD-Tiere... 100

4.3.6 Zusammenfassung der Ergebnisse der computergestützten Morphometrie ... 104

4.3.6.1 Verteilungsmuster von Immunzellen in der Lamina propria ... 104

4.3.6.2 Vergleich der Kontrolltiere mit den IBD-Tieren ... 104

4.3.7 Korrelationen zwischen histopathologischen und morphometrischen Befunden ... 105

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III

5 Diskussion... 107

5.1 Alter, Rasse und histopathologische Veränderungen ... 108

5.2 Extraintestinale Erkrankungen ... 109

5.3 Immunhistochemie und Morphometrie ... 110

5.3.1 Anzahl und Verteilungsmuster von CD3⁺ T-Lymphozyten ... 111

5.3.2 Quantitative Untersuchungen von CD3⁺ T-Lymphozyten bei Katzen mit IBD im Vergleich zu darmgesunden Kontrolltieren ... 115

5.3.3 Anzahl und Verteilungsmuster von Plasmazellen ... 118

5.3.4 Quantitative Untersuchungen von Plasmazellen bei Katzen mit IBD im Vergleich zu darmgesunden Kontrolltieren ... 122

5.3.5 Verteilungsmuster von L1⁺ Zellen ... 124

5.3.6 Quantitative Untersuchungen von L1⁺ Zellen bei Katzen mit IBD im Vergleich zu darmgesunden Kontrolltieren ... 126

5.4 Schlussfolgerungen ... 127

6 Zusammenfassung ... 129

7 Summary ... 131

8 Literatur ... 133

9 Anhang... 150

9.1 Angaben zu den Kontrolltieren ... 150

9.2 Angaben zu den IBD-Tieren ... 153

9.3 Angaben zu statistischen Ergebnissen... 159

9.4 Färbungsprotokolle... 170

9.5 Pufferrezepte für die Immunhistochemie ... 170

9.6 Vorbehandlungsmethoden für die Immunhistochemie ... 171

9.7 Reagenzien für die Immunhistochemie... 171

9.8 Bezugsquellen für Chemikalien und Antikörper ... 172

9.9 Bezugsquellen für Geräte und Einmalartikel... 174

9.10 Abkürzungsverzeichnis ... 176

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1

1 Einleitung

Bei den chronischen idiopathischen Darmentzündungen der Katze (engl. Inflammatory Bowel Disease) handelt es sich um einen heterogenen Krankheitskomplex, welcher durch klinische Symptome einer chronischen persistierenden oder rezidivierenden gastrointestinalen Erkrankung unbekannter Ursache in Zusammenhang mit histologischen Merkmalen einer Darmentzündung gekennzeichnet ist. Die Inflammatory Bowel Disease ist die häufigste Ursache für chronischen Vomitus und Diarrhoe bei der Katze. Die Diagnose „IBD“ kann nur im Rahmen einer Ausschlussdiagnostik gestellt werden, und die histopathologische Untersuchung endoskopischer oder transmuraler gastrointestinaler Bioptate ist zur Diagnosesicherung obligatorisch. Charakteristisch für die IBD ist eine erhöhte Anzahl an Entzündungszellen wie Lymphozyten und Plasmazellen sowie zum Teil Makrophagen, eosinophile und/oder neutrophile Granulozyten in der Mukosa des Intestinaltraktes. Die Ätiologie und Pathogenese dieses Krankheitskomplexes sind bislang weitgehend ungeklärt.

Vermutet wird, dass möglicherweise luminale Antigene eine Dysregulation des intestinalen Schleimhautimmunsystems auslösen und dies im Folgenden zu einem Zusammenbruch der intestinalen Toleranz mit perpetuierender Entzündungsreaktion führen könnte. Die Vermutung, dass Immunzellen des GALT eine wesentliche Rolle bei der Immunpathogenese der IBD spielen könnten, hat einige Untersucher veranlasst, die Immunzellpopulationen der Mukosa bei Hunden mit IBD mittels immunhistochemischer und morphometrischer Methoden zu analysieren. Im Gegensatz zur IBD beim Hund ist die Charakterisierung der Immunzellpopulationen in der Mukosa des Dünndarmes an IBD erkrankter Katzen bisher nur ansatzweise erfolgt. Qualitative und quantitative Daten zur Zusammensetzung der Entzündungszellpopulation der Mukosa des Kolons von darmgesunden Katzen oder Katzen mit IBD sind im einschlägigen Schrifttum bislang nicht verfügbar.

Ziel der vorliegenden Studie war die Charakterisierung und Quantifizierung von CD3⁺ T- Zellen, Makrophagen und Plasmazellen (IgA-, IgG-, IgM- produzierende Plasmazellen) mittels immunhistochemischer Methoden und computergestützter Morphometrie in transmuralen Bioptaten des Dünn- und Dickdarmes von Katzen mit Inflammatory Bowel Disease im Vergleich zu klinisch und histologisch darmgesunden Hauskatzen.

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2

2 Literaturübersicht

2.1 Histologischer Aufbau des Intestinaltraktes

2.1.1 Dünndarm

Der Dünndarm mit seinen drei Abschnitten Duodenum, Jejunum und Ileum zeigt über seine gesamte Länge hinweg eine weitgehende histomorphologische Übereinstimmung. Die Schleimhautoberfläche ist geprägt von Ausstülpungen der Lamina propria, den Dünndarmzotten (Villi intestinales) die mit einem einschichtigen hochprismatischen Epithel bedeckt sind. Die Zotten von Karnivoren sind schlank und gestreckt und im Ileum kürzer als im Duodenum und Jejunum (SMOLLICH u. MICHEL 1992; LIEBICH 1999).

Demgegenüber stellen die Krypten (Glandulae intestinales) Einstülpungen der Schleimhaut dar, die innerhalb der Lamina propria schlauchförmig, gerade und unverzweigt verlaufen und bis an die Lamina muscularis mucosae reichen (LIEBICH 1999). Das Schleimhautepithel besteht maßgeblich aus hochprismatischen Epithelzellen mit feingranuliertem, azidophilem Zytoplasma und einem basal gelegenen längsovalen Kern (BANKS 1993). Verstreut zwischen den Epithelzellen liegen intraepitheliale Lymphozyten, enterochromaffine Zellen sowie Becherzellen, deren Anzahl in Richtung Kolon stetig zunimmt (SEGAL u. PETRAS 1992; BANKS 1993; GUILFORD 1996a; STROMBECK 1996; LIEBICH 1999). Die subepithelial gelegene Lamina propria besteht aus lockerem Bindegewebe mit Myofibroblasten sowie glatten Muskelzellen und führt neben Blut- und Lymphgefäßen auch Nerven. Ein erheblicher Teil der distal der Zotten gelegenen Lamina propria wird von den Lieberkühnschen Krypten eingenommen und schließt eine große Menge lymphoretikulären Gewebes und Immunzellen ein (BANKS 1993; LIEBICH 1999). Die Tela submucosa besteht aus lockerem, kollagenfaserreichem Bindegewebe mit einer unterschiedlichen Zahl von Adipozyten und enthält neben Lymph- und Blutgefäßen auch autonome Ganglien sowie lymphoidzellige Aggregate. Im Duodenum sind darüber hinaus in der Tela submucosa die Brunnerschen Drüsen (Glandulae submucosae) eingelagert, deren Ausführungsgänge in die Krypten münden. Lymphatische Einrichtungen, wie Noduli lymphatici aggregati oder Peyersche Platten, können sich über die Lamina propria hinaus bis in die Tunica submucosa erstrecken (SEGAL u. PETRAS 1992; BANKS 1993; STROMBECK 1996; LIEBICH 1999).

Im lockeren Bindegewebe der Tela submucosa sind in allen Lokalisationen des Dünndarmes

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2 LITERATURÜBERSICHT

3

vereinzelt Lymphozyten und Plasmazellen anzutreffen (LIEBICH 1999). Die Tunica muscularis, mit ihrem inneren Stratum circulare und ihrem äußeren Stratum longitudinale, besteht aus glatten Muskelzellen und enthält zwischen beiden Schichten den Plexus myentericus (Auerbachscher Plexus) sowie zahlreiche Blut- und Lymphgefäße (LIEBICH 1999). Das einschichtige Plattenepithel der Tunica serosa bildet als Deckschicht die äußere Begrenzung zum Abdomen (LIEBICH 1999).

2.1.2 Kolon

Der histologische Wandaufbau des Kolons entspricht in seiner Vierschichtigkeit dem des Dünndarmes. Als Abschnitt des Dickdarmes ist dem Kolon jedoch das Fehlen der Zotten als Charakteristikum zu Eigen. Die Oberfläche des Darmes wird von hochprismatischen Epithelzellen gebildet. Von der Oberfläche aus führen die Krypten als Einstülpungen der Lamina propria in die Tiefe bis zur Lamina muscularis mucosae. Die Krypten (Glandulae intestinales) nehmen den größten Teil der Lamina propria ein und liegen als schmale, gerade, unverzweigte Einziehungen parallel und dicht aneinander und nahe der Lamina muscularis mucosae (CANFIELD et al. 1980; BANKS 1993; ANTONIOLI u. MADARA 1998;

LIEBICH 1999). Das Kryptepithel schließt, neben den iso- bis hochprismatischen Epithelzellen, eine Vielzahl von muzinbildenden Becherzellen ein (CANFIELD et al. 1980;

BANKS 1993; LIEBICH 1999). Die Lamina propria, die durch die dicht aneinander liegenden Krypten einen nur minimalen Raum einnimmt, enthält neben Lymphozyten und Plasmazellen in unterschiedlicher Zahl und Dichte auch einige eosinophile Granulozyten und vereinzelt auch neutrophile Granulozyten und Makrophagen (CANFIELD et al. 1980). Der übrige Wandaufbau entspricht dem des Dünndarms mit vereinzelten lymphoidzelligen Aggregaten in der Lamina propria und Tunica submucosa (LIEBICH 1999). Es gibt nur wenige Arbeiten über die Zusammensetzung der Leukozytenpopulation im Kolon von Karnivoren. Qualitative und quantitative Daten zu Immunzellen im Kolon darmgesunder Katzen wurden bislang nicht veröffentlicht.

2.1.3 GALT – Gut-Associated Lymphoid Tissue

Das gastrointestinale Immunsystem ist eines der größten und komplexesten Abwehrzentren des Körpers. Es spielt eine wichtige Rolle sowohl in der lokalen wie in der systemischen Abwehr. Gleichzeitig moduliert und reguliert es die Immunantwort und ist Ort der Induktion

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oraler Toleranz, der Hyporeaktivität gegenüber nicht-invasiven Antigenen. Als eines der wichtigsten lymphatischen Organe des Körpers ist dem Darm eine große Menge lymphatischen Gewebes eigen. So enthält die Mukosa das größte B-Zell-System des Körpers (GUILFORD 1996a). Das darmassoziierte lymphatische Gewebe, auch als Gut-Associated Lymphoid Tissue (GALT) bezeichnet, umfasst aggregiertes und diffuses lymphoretikuläres Gewebe in der gastrointestinalen Mukosa. Unter aggregiertem lymphoretikulärem Gewebe versteht man Lymphknötchen und Peyersche Platten. Das diffuse oder nicht aggregierte Gewebe schließt luminale, intraepitheliale und Leukozyten der Lamina propria ein (GUILFORD 1996a).

2.1.3.1 Aggregiertes lymphoretikuläres Gewebe und Peyersche Platten

Lymphknötchen (Noduli lymphatici solitarii) sind einzeln oder in aggregierter Form in der Lamina propria im gesamten Gastrointestinaltrakt anzutreffen (SMOLLICH u. MICHEL 1992; GUILFORD 1996a; LIEBICH 1999). Dabei können sie sich über die Lamina propria hinaus bis in die Tela submucosa erstrecken und eine Größe zwischen 0,5 bis 3 mm erreichen (GUILFORD 1996a). Durch die Vereinigung dieser Lymphknötchen entstehen lymphoretikuläre Gewebekomplexe zum Teil beträchtlichen Ausmaßes, die als Noduli lymphatici aggregati oder Peyersche Platten bezeichnet werden und die vor allem im Ileum vorhanden sind (SMOLLICH u. MICHEL 1992; GUILFORD 1996a). Beide lymphatischen Einrichtungen bilden durch Vorwölbung ins Darmlumen und Verdrängung der Zotten so genannte Domes oder Dome-Areale, die mit einem spezialisierten Epithel, dem follikelassoziierten Epithel bedeckt sind (SMOLLICH u. MICHEL 1992; ANTONIOLI u.

MADARA 1998). Der Dome besteht vorwiegend aus T-, B- und antigenpräsentierenden Zellen sowie Makrophagen. Darunter befindet sich der Follikel mit seiner Corona, die vorwiegend B- und T-Helfer-Zellen enthält. Im Inneren der Corona befindet sich ein Germinal- oder Keimzentrum aus proliferierenden B-Zellen. Die interfollikuläre Region beinhaltet vor allem T-Zellen (JANEWAY u. TRAVERS 2002; DAY 1999). Das follikelassoziierte Epithel enthält, als eine spezialisierte Einrichtung des lymphoretikulären Gewebes, neben absorptiven Epithelzellen so genannte M-Zellen (Microfold/Membranous cells). Diese M-Zellen sind maßgeblich am transepithelialen Antigentransport beteiligt, indem sie über Endozytosemechanismen Antigene aufnehmen und zu dem darunter liegenden lymphoretikulären Gewebe transportieren. Gleichzeitig können Lymphozyten und

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Makrophagen in taschenartige Ausstülpungen der apikalen Membran von M-Zellen eindringen und intraepithelial mit Antigenen in Kontakt treten (SMOLLICH u. MICHEL 1992; BANKS 1993; GUILFORD 1996a; ANTONIOLI u. MADARA 1998; BRANDTZAEG 2001b). Das GALT ist Ort der Induktion von Immunantworten. Nach Antigenaufnahme und – präsentation kommt es in den Peyerschen Platten zu einer Aktivierung von B- und T- Helferzellen, vor allem von solchen, die auf die Synthese von IgA spezialisiert sind. Diese erreichen über die Mesenteriallymphknoten und den Ductus thoracicus den Kreislauf.

Anschließend gelangen die zirkulierenden Lymphoblasten aus dem Kreislauf über spezielle Rezeptoren, die Selektine, zurück in alle mukosaassoziierten lymphatischen Gewebe und werden hier zu Effektormolekülen der Immunantwort. Diesen Prozess nennt man “Homing”

(DOE 1989; GEBBERS u. LAISSURE 1989; JANEWAY u. TRAVERS 2002).

2.1.3.2 Diffuses lymphatisches Gewebe

Das diffuse lymphatische Gewebe der Mukosa ist die Effektorseite der Immunantwort im Darm. Hierher gelangen ausgereifte Lymphozyten nach ihrer Antigenerkennung und Aktivierung in den Lymphknötchen und Peyerschen Platten, der anschließenden Zirkulation durch den Kreislauf und das abschließende Homing (DOE 1989; GEBBERS u. LAISSURE 1989; JANEWAY u. TRAVERS 2002). Drei Kompartimente werden hier unterschieden, das luminale, das intraepitheliale und das Kompartment der Lamina propria (GUILFORD 1996a).

Luminale Leukozyten

Luminale Leukozyten sind stets eng mit der Mukosa assoziiert, sie migrieren offenbar durch antigene Stimulation aus der Mukosa ins Lumen. Ihre Funktion ist weitgehend unbekannt, sie treten jedoch bei entzündlichen Prozessen vermehrt auf und sind daher ein diagnostischer Indikator inflammatorischer Veränderungen (GUILFORD 1996a).

Intraepitheliale Lymphozyten (IEL)

Intraepitheliale Lymphozyten sind eine morphologisch, phänotypisch und funktionell heterogene Population lymphoider Zellen (GUILFORD 1996a). Konsens besteht darüber, dass es sich im Intestinaltrakt von Katzen und Hunden bei der Mehrzahl der intraepithelialen Lymphozyten um T-Zellen handelt, wobei der Anteil einzelner Subpopulationen kontrovers diskutiert wird (ROCCABIANCA et al. 2000; WALY et al. 2001; STOKES u. WALY 2006).

Die Ergebnisse verschiedener Studien, die mittels Durchflusszytometrie oder

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morphometrischer Methoden unterschiedliche Subtypen von T-Zellen im Intestinaltrakt der Katze untersuchten, zeigen, dass die Mehrzahl der intraepithelialen T-Lymphozyten aus CD8⁺ T-Zellen, also aus T-Zellen vom zytotoxischen oder suppressorischen Phänotyp besteht (ROCCABIANCA et al. 2000; WALY et al. 2001, 2004; STOKES u. WALY 2006).

Demgegenüber handelt es sich den Autoren zufolge bei den T-Zellen der Lamina propria vorwiegend um CD4⁺ T-Lymphozyten, also um B-Zellen-aktivierende T-Helfer-Zellen (TH2- Zellen) oder inflammatorische T-Zellen (TH1-Zellen). Diese Ergebnisse entsprechen weitgehend den Untersuchungen von Arbeiten über den humanen und kaninen Intestinaltrakt (SELBY et al. 1983; BRANDTZAEG et al. 1988; TREJDOSIEWICZ 1992; ELWOOD et al.

1997; GERMAN et al. 1999b). CD8⁺ zytotoxische oder suppressorische T-Zellen erkennen an den MHC-Klasse-I-Rezeptor von Epithelzellen gebundene Antigene und induzieren den programmierten Zelltod (GEBBERS u. LAISSURE 1989; GUILFORD 1996a; JANEWAY u.

TRAVERS 2002). Auf diese Weise werden infizierte oder transformierte Zellen erkannt und getötet, bevor sich eine Infektion oder ein Tumorgeschehen manifestieren können (JANEWAY 1988).

Ergebnisse aus Studien am menschlichen Intestinaltrakt deuten darauf hin, dass intraepitheliale Lymphozyten zum Großteil aus dem lymphoretikulären Gewebe in das Epithel migrieren. Die Migration selbst ist anscheinend weitgehend Antigen-unabhängig, da intraepitheliale Lymphozyten auch bei Feten nachgewiesen wurden (SPENCER et al. 1986).

Neben CD8⁺ T Zellen ist anscheinend auch eine erhebliche Zahl regulatorischer T-Zellen, so genannter T_regZellen im Epithel angesiedelt, die über immunregulatorische und immunsuppressive Mechanismen zur Aufrechterhaltung oraler Toleranz, der Hyporeaktivität gegenüber nicht-invasiven Antigenen, beitragen (GUILFORD 1996a).

GERMAN et al. (1999b) untersuchten mittels immunhistochemischer und morphometrischer Methoden intraepitheliale Lymphozyten bei Hunden. Die Autoren zeigten, dass je nach Darmabschnitt zwischen 7 und 20 intraepitheliale Lymphozyten pro 100 Enterozyten vorhanden sind. Morphometrische Untersuchungen bei Katzen ergaben erheblich höhere Zahlen für diese Spezies. Während im Kryptepithel, je nach untersuchtem Dünndarmabschnitt, zwischen 4 und 6 intraepitheliale Lymphozyten pro 100 Epithelzellen vorkommen, erhöht sich diese Zahl in der Zotte auf 48 IELs pro 100 Enterozyten im

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Duodenum und bis auf 80 IELs je 100 Enterozyten im Ileum (WALY et al. 2001). Über die Zahlen intraepithelialer Lymphozyten im Kolon der Katze gibt es bislang keine publizierten Ergebnisse.

2.1.3.3 Leukozyten der Lamina propria mucosae

Die Lamina propria ist insgesamt reich an lymphoretikulärem Gewebe und Immunzellen (BANKS 1993; LIEBICH 1999). Bisher gibt es allerdings nur zwei publizierte Untersuchungen, in denen das Infiltrat von Leukozyten in der Mukosa von gesunden Katzen qualitativ und quantitativ charakterisiert wurde (WALY et al. 2001, 2004).

Ergebnisse mehrerer Untersuchungen am Intestinaltrakt von Katzen, Hunden und des Menschen weisen IgA-produzierende Plasmazellen als den zahlenmäßig dominierenden Isotyp unter den Plasmazellen der Lamina propria aus (HART 1979; KLOTZ et al. 1985;

BRANDTZAEG et al. 1988; VIBE-PETERSEN 1991; SEGAL u. PETRAS 1992;

GUILFORD 1996a; GERMAN et al. 1999b; JERGENS et al. 1999; WALY et al. 2001, 2004;

KLEINSCHMIDT et al. 2007). Unterschiedliche Ansichten herrschen indes darüber, ob mehrheitlich T-Zellen oder IgA-Plasmazellen die Lamina propria besiedeln.

Morphometrische Untersuchungen der Lamina propria von Katzen und Hunden zeigen jedoch, dass diese Frage nicht pauschal beantwortet werden kann. Vielmehr spielt die Lokalisation innerhalb der Mukosa eine entscheidende Rolle. Während T-Zellen offensichtlich in größerer Zahl in den Zotten vorkommen, ist die Zahl der IgA-Plasmazellen, aber auch die der IgG- und IgM- produzierenden Plasmazellen anscheinend in den Kryptregionen am größten (GERMAN et al. 1999b; WALY et al. 2001). Insgesamt ist in der Lamina propria, einem Bereich mit ständigem Antigenkontakt, bei Katzen und Hunden eine große Anzahl von Lymphozyten und Plasmazellen vorhanden, und in geringerer Zahl sind dort auch Makrophagen, eosinophile Granulozyten und Mastzellen anzutreffen. Im Kolon können vereinzelt auch neutrophile Granulozyten vorkommen (CANFIELD et al. 1980;

ROTH et al. 1990; YAMASAKI et al. 1996; JERGENS et al. 1998b; GERMAN et al. 1999a;

WALY et al. 2001, 2004).

T-Zellen (CD3⁺ Zellen)

T-Zellen sind eine extrem heterogene Gruppe immunologisch aktiver Zellen, die sich anhand verschiedener Oberflächenmarker in Subtypen unterscheiden lassen. Wichtige Subtypen sind

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CD4⁺ Zellen, welche als T-Helferzellen B-Zellen und Makrophagen aktivieren sowie CD8⁺ Zellen mit zytotoxischen oder suppressorischen Eigenschaften. Die mögliche Funktion der mit Hilfe monoklonaler Antikörper phänotypisierbaren Lymphozytensubpopulationen ist bislang für viele andere Expressionsmuster noch nicht geklärt. Allen T-Zellen ist jedoch der so genannte CD3-Komplex gemein, ein an den T-Zellrezeptor gebundener Proteinkomplex, welcher an der Signaltransduktion beteiligt ist (JANEWAY u. TRAVERS 2002). Die Mehrzahl der T-Zellen der Lamina propria sind bei der Katze wie auch beim Hund CD4⁺ T- Helferzellen (ELWOOD et al. 1997; GERMAN et al. 1999b; WALY et al. 2001, 2004). Sie erkennen an MHC-Klasse-II-Moleküle gebundene Antigene und können sich nach Aktivierung in drei Arten von Effektorzellen, die T-Helfer-Zellen Typ1 (TH1), T-Helfer- Zellen Typ 2 (TH2) und die T-Helfer-Zellen Typ 3 (TH3), differenzieren. TH1-Zellen sind Teil der zellvermittelten Immunität. Sie aktivieren einerseits Makrophagen, andererseits regen sie B-Zellen zur Produktion von IgG an. Dieser Isotyp opsonisiert sehr effektiv extrazelluläre Pathogene für die Aufnahme durch phagozytierende Zellen und kann darüber hinaus die Komplementkaskade auslösen. T_H2-Zellen aktivieren naive antigenspezifische B-Zellen, lösen so eine humorale Immunantwort aus und steuern darüber hinaus den Isotypenwechsel der Immunglobuline. Daneben existiert in der Mukosa eine weitere wichtige Untergruppe von T-Lymphozyten, die T_H3-Zellen. Sie spielen im Rahmen der oralen Toleranzinduktion durch die Sekretion antiinflammatorischer Zytokine eine entscheidende Rolle (JANEWAY u.

TRAVERS 2002; ALLENSPACH u. GASCHEN 2003).

Plasmazellen

Wie bereits erwähnt, wurde in zahlreichen Studien gezeigt, dass unter den verschiedenen Plasmazell-Isotypen die IgA-Plasmazellen im Intestinaltrakt von Katzen und Hunden vorherrschen (HART 1979; KLOTZ et al. 1985; BRANDTZAEG et al. 1988; VIBE- PETERSEN 1991; SEGAL u. PETRAS 1992; GUILFORD 1996a; GERMAN et al. 1999b;

JERGENS et al. 1999; WALY et al. 2001, 2004; KLEINSCHMIDT et al. 2007).

Sekretorisches IgA bindet Antigene im Darmlumen und hemmt somit deren Anlagerung und Aufnahme in die intestinale Mukosa. Auf diese Weise verhindert IgA nicht nur effektiv Infektionen, sondern vermeidet auch allergische oder Hypersensibilitätsreaktionen im Intestinaltrakt (DOE 1989; WILLARD 1999). Immunglobulin A bildet somit an mukosalen Oberflächen die so genannte “first line of defence“ (BRANDTZAEG 1995). Darüber hinaus

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schützen die IgA-Antikörper die Mukosa indirekt, da sekretorisches IgA, im Gegensatz zu IgG oder IgM, nicht in der Lage ist, Entzündungsmediatoren zu aktivieren (DOE 1989).

Antigene werden aber auch von M-Zellen und Epithelzellen aufgenommen, prozessiert und darunter liegenden T-Zellen präsentiert oder sie werden direkt bis in Lymphknötchen oder Peyersche Platten transportiert und dort von dendritischen Zellen den T-Zellen präsentiert.

Die dadurch aktivierten T-Helferzellen stimulieren ihrerseits B-Zellen und unterstützen deren Differenzierung in IgA produzierende Plasmazellen (BRANDTZAEG et al. 1989; GEBBERS u. LAISSURE 1989).

L1⁺ Zellen

Zellen, die sich mit dem Antikörperklon MAC387, der mit dem L1-Antigen reagiert, anfärben lassen, repräsentieren bei der Katze eine Gruppe von Zellen mit den morphologischen Charakteristika von Makrophagen und Monozyten (WALY et al. 2001). Beim Hund reagiert der Antikörper anscheinend zusätzlich mit neutrophilen Granulozyten (GERMAN et al.

1999b). Makrophagen erfüllen innerhalb des Systems der Immunabwehr mehrere Funktionen.

Sie besitzen eine Vielzahl von Rezeptoren, wie den Mannose- oder den scavenger-Rezeptor, mit deren Hilfe sie Antigene erkennen, binden und phagozytieren können. Damit sind sie Teil der unspezifischen oder angeborenen Immunantwort. Im Anschluss an die Phagozytose erfolgt die Prozessierung der Antigene in Endosomen und Lysosomen. Die dabei entstandenen Peptide werden durch MHC-Klasse-II-Moleküle an der Zelloberfläche der Makrophagen den T-Zellen präsentiert. Durch die Antigenaufnahme wird zeitgleich die Bildung und Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen sowie von B7-Molekülen stimuliert.

B7-Moleküle sind costimulierende Moleküle auf antigenpräsentierenden Zellen. Der entsprechende Rezeptor auf T-Zellen ist CD28 auf naiven T-Zellen sowie CTLA-4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) auf bewaffneten T-Effektorzellen. Durch ihre costimulierende Aktivität regen Makrophagen naive T-Zellen zur Proliferation und Differenzierung an. Bei der Bindung von B7 an CTLA-4 kommt es zu einem negativen Signal an die aktivierten T-Effektorzellen, wodurch ihre proliferative Antwort begrenzt wird (BRANDTZAEG et al. 1988; JANEWAY u. TRAVERS 2002). Die Antigenpräsentation durch MHC-Klasse-II-Moleküle sowie die costimulierende Aktivität von Makrophagen machen sie auch zu einem Teil der adaptiven Immunantwort.

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10 2.1.3.4 Orale Toleranz

Im Gegensatz zu den meisten anderen lymphatischen Geweben ist eine vollständige Elimination der luminalen Antigene durch das GALT nicht möglich. Es gilt eine Balance zwischen der Elimination virulenter Antigene und der Toleranz gegenüber harmlosen, persistent vorhandenen Antigenen herzustellen (MACDERMOTT 1996). Daher verfügt das GALT über ein komplexes suppressorisches System zur Kontrolle der Immunantwort, vor allem gegenüber bekannten, avirulenten enterischen Antigenen, wozu auch diätetische Antigene oder die normale mikrobielle Flora gehören. Dieses suppressorische System besteht im Wesentlichen aus drei Elementen, einer Permeabilitätsbarriere gegenüber Makromolekülen, einer vorherrschenden IgA-Antikörperantwort sowie einer effektiven T- Suppressorzell-Funktion. Essentiell ist eine intakte mukosale Barriere, die die Lamina propria vor Kontakt mit unbekannten Antigenen schützt. Nur sehr wenige Nahrungsantigene durchdringen die intakte Mukosaschranke. Bei erwachsenen Tieren sind dies etwa 0,002%

aller mit der Nahrung aufgenommenen Antigene (ALLENSPACH u. GASCHEN 2003). So wird die Lamina propria vor einer Überflutung mit unbekannten Antigenen geschützt.

Darüber hinaus ist Immunglobulin A als der vorherrschende Antikörperisotyp im Darm von Bedeutung. Sekretorische IgA-Antikörper aggregieren einerseits luminale Antigene und schirmen so die Mukosa von Antigenen ab, andererseits provozieren sie, anders als andere Isotypen, keine starken inflammatorischen Reaktionen durch Aktivierung des Komplementsystemes. Eine entscheidende Rolle spielt außerdem das Netzwerk regulatorischer T-Zellen und hyporeaktiver antigenpräsentierender Zellen, das neben der lokalen auch eine systemische Toleranz gegenüber harmlosen Antigenen induziert. Die T- Zellen haben eine zentrale Funktion bei der Entwicklung der oralen Toleranz. Die normale Immunantwort im Darm ist eine durch T-Helfer-Zellen-Typ 2 dominierte, so genannte T_H2- Antwort, mit Induktion von regulatorischen T-Zellen, antiinflammatorischen Zytokinen und IgA-produzierenden B-Zellen (MAGNE 1992; GUILFORD 1996a, 1996b; STROBEL 2002;

ALLENSPACH u. GASCHEN 2003; CAVE 2003).

Die Peyerschen Platten sind zentraler Ort der Induktion einer Immunantwort. Spezialisierte M-Zellen des follikelassoziierten Epithels stellen Unterbrechungen der mukosalen Schranke dar. Sie nehmen, wie erwähnt, rezeptorvermittelt oder über unspezifische Mechanismen unlösliche, partikuläre Antigene oder ganze Mikroorganismen auf (BRANDTZAEG 2001b).

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Diese werden zu subepithelial gelegenen antigenpräsentierenden Zellen (APC) wie B-Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen transportiert. Antigenpräsentierende Zellen prozessieren die Antigene und präsentieren sie naiven B- und T-Zellen im darunter liegenden Follikel. Im Gegensatz zu anderen APCs weisen die der intestinalen Mukosa einen Mangel costimulierender Moleküle, wie CD80 und CD86 auf. Die aktivierten B- und T-Zellen proliferieren daher nur wenig. In Zusammenhang mit einer spezifischen Mikroumgebung und bestimmten Chemokinen, die sich von anderen Lymphgeweben des Körpers unterscheiden, kommt es zur Induktion von regulatorischen TH2 und TH3 Zellen (KELLERMANN u.

MCEVOY 2001). Diese verlassen die Mukosa über afferente Lymphbahnen, erreichen so den Kreislauf und gelangen anschließend durch Bindung an zelluläre Adhäsionsmoleküle (cellular adhesion molecules, CAM), die von Venulen mit hohem Endothel exprimiert werden, zurück in die Lamina propria der Schleimhäute. Hier verweilen sie als T- und B-Gedächtniszellen bis zu einem weiteren Kontakt mit ihrem spezifischen Antigen. Als T-Effektorzellen der Lamina propria des Intestinaltraktes sezernieren sie nach ihrer Aktivierung vorwiegend antiinflammatorische Zytokine wie den Transforming Growth Factor β (TGF-β) oder Interleukin 10 (IL-10). Diese führen bei B-Zellen zu einem Isotypenswitch zu Immunglobulin A, während die Immunglobulin G Produktion und T_H1-Lymphozyten supprimiert werden.

Durch Aggegation von Antigenen schützt Immunglobulin A die Darmoberfläche vor übermässigem Kontakt mit Antigenen und trägt so zur Aufrechterhaltung der oralen Toleranz bei (JANEWAY u. TRAVERS 2002; ALLENSPACH u. GASCHEN 2003; CAVE 2003).

Um trotz Suppression der Immunantwort dennoch mit ausreichender Effektivität gegen pathogene Agenzien vorgehen zu können, sind dem Immunsystem des Darms spezielle Rezeptoren für hochkonservierte Strukturen von Mikroorganismen eigen. Die am besten charakterisierten Rezeptoren sind die Toll-like Rezeptoren (TLR) mit ihren 10 Varianten (AKIRA 2003). Wichtige TL-Rezeptoren sind der TLR-4, welcher einen Lipopolysaccharidrezeptor repräsentiert sowie der TLR-2, der an Peptidoglykane von gramnegativen Bakterien bindet (HEINE u. LIEN 2003). Die Antigenbindung an den Toll- like Rezeptor führt zu einer intrazellulären Signalkaskade, mit Freisetzung des transcription nuclear factor NF-κB von dem inhibitorischen Molekül (IκB) und der Induktion der Gentranskription verschiedener Gene, die für inflammatorische Zytokine und costimulierende

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Faktoren kodieren (IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, CD80/CD86). Die Toll-like Rezeptoren sind somit Sensoren, welche die Präsenz von Mikroorganismen anzeigen können (CAVE 2003).

Zellen innerhalb der Mukosa zeigen nur wenig TLR-2 und TLR-4 Expression. Die Expression kann jedoch durch inflammatorische Zytokine innerhalb kürzester Zeit heraufreguliert werden (ABREU et al. 2001). Intestinale antigenpräsentierende Zellen exprimieren indes in Abwesenheit solcher „Warnsignale“ keine costimulierenden CD80/CD86-Moleküle und produzieren nur wenig proinflammatorische Zytokine wie TNF-α, IL-1 und IL-12. Durch solche APCs aktivierte T-Zellen zeigen nur geringe Proliferationsneigung mit vielfacher Apoptose der Lymphozytenklone. Überlebende Gedächtniszellen tendieren zur Produktion der antiinflammatorischen suppressorischen Chemokine TNF-β und IL-10 (JENKINS et al.

2001).

Die Kombination aus Apoptose zahlreicher T-Zellklone aktivierter T-Zellen und Sekretion von antiinflammatorischen und die IgA-Produktion fördernden Zytokinen ist die Basis der immunologischen Toleranz gegenüber nicht-invasiven, luminalen Antigenen. Die orale Toleranz ist demnach eine sensible Balance. Einerseits wird Immunsuppression durch Induktion von Immunglobulin A, T-Zell-Deletion und Anergie gefördert. Andererseits bleibt das Reaktionspotential durch Retention von antigenspezifischen Lymphozyten, mit der Fähigkeit auf invasive Antigene mit Immunglobulinswitch zu IgM, IgG oder IgE sowie mit der Produktion inflammatorischer Zytokine zu reagieren, erhalten (CAVE 2003).

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13

2.2 Inflammatory Bowel Disease bei Katze und Hund

Der Begriff „chronisch idiopathische Enteropathie“ oder englisch “Inflammatory Bowel Disease (IBD)“ beschreibt einen Erkrankungskomplex, der durch persistierende oder rezidivierende Symptome einer gastrointestinalen Erkrankung unbekannter Ursache in Zusammenhang mit histologischen Merkmalen einer entzündlichen Reaktion gekennzeichnet ist (GUILFORD 1996b; WILLARD 1999; JERGENS 2002; TAMS 2003). IBD ist eine der häufigsten Ursachen für chronischen Vomitus und Diarrhoe bei der Katze (TAMS 1993, 2003; GUILFORD 1996b; JERGENS 1999; MENESES et al. 2003). Da die Erkrankung idiopathisch auftritt, ist eine umfassende klinische Untersuchung zum Ausschluss der zahlreichen Differentialdiagnosen essentiell. Für eine definitive Diagnose ist die histopathologische Untersuchung endoskopisch oder chirurgisch entnommener Bioptate des Intestinaltraktes obligatorisch (TAMS 1986a, 1993; GHERMAI 1989; JERGENS 2002, 2003;

MENESES et al. 2003). Eine Rasse- oder Geschlechtsprädisposition gibt es, den meisten Autoren zufolge, bei der Katze nicht (TAMS 1986a, 1987, 1993; JERGENS et al. 1992;

GUILFORD 1996b; MENESES et al. 2003). Eine Häufung von IBD-Fällen ist jedoch, einigen Untersuchern zufolge, bei Katzen mittleren und hohen Alters zu beobachten (TAMS 1986a, 1987, 2003; DENNIS et al. 1992, 1993; JERGENS et al. 1992; MÜNSTER 1995, WALY et al. 2004). Einige Autoren berichten auch von vermehrten Krankheitsfällen bei männlichen Tieren oder reinrassigen Katzen, jedoch ohne eine bestimmte Rasseprädisposition (DENNIS et al. 1993; HART et al. 1994; LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997).

2.2.1 Histopathologische Diagnostik und Befundinterpretation bei IBD

Die Diagnose des Vorliegens von IBD erfordert in jedem Fall die histopathologische Untersuchung von Bioptaten aus dem Intestinaltrakt (TAMS 1987, 2003; JERGENS et al.

1992; GUILFORD 1996b; JERGENS 1999; WILCOCK 1992; JERGENS 2004). Jedoch berichten WILLARD et al. (2002) in einer Studie über die histopathologische Evaluation von Proben aus dem Intestinaltrakt von Katzen und Hunden darüber, dass es erhebliche Variationen in der Befundung zwischen verschiedenen Untersuchern gibt. Dies liegt vor allem daran, dass die vermehrte Infiltration der Lamina propria mit Entzündungszellen zwar ein Charakteristikum bei IBD ist, die Lamina propria jedoch gleichzeitig eine physiologische Infiltration mit Immunzellen als Teil des diffusen Gut-Associated Lymphoid Tissue aufweist

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(WILCOCK 1992; LIEBICH 1999; WILLARD 1999; WALY et al. 2004). Darüber hinaus kommen für eine erhöhte Anzahl inflammatorischer Zellen in der Lamina propria verschiedene Auslöser in Betracht. Dazu zählen bei der Katze Hyperthyreoidismus (Thyreotoxikose), verschiedene infektiöse Erreger, wie Bakterien, Viren und Parasiten sowie Neoplasien (TAMS 1993, 2003; JERGENS 2002; CARRERAS et al. 2003; MENESES et al.

2003; WALY et al. 2005; EVANS et al. 2006). Isolierte Veränderungen der Leukozytenpopulation der Lamina propria ohne weitere Anzeichen einer entzündlichen Reaktion oder Schädigung von Enterozyten stellen keinen Beweis für das Vorliegen von IBD dar (WILCOCK 1992; JERGENS 2002, 2003). Vielmehr sollten weitere Veränderungen der Mukosa, wie Epithelveränderungen oder Architekturstörungen berücksichtigt werden, da sie, je nach Art und Ausprägung, den Grad und die Chronizität des Prozesses widerspiegeln (WILCOCK et al. 1992; JERGENS 2002, 2003).

2.2.1.1 Bioptate

Die histopathologische Untersuchung von Bioptaten aus dem Intestinaltrakt von Katzen mit IBD ist für die Diagnosesicherung des Vorliegens von IBD obligatorisch. Zwei Biopsietechniken sind dabei von Bedeutung: die endoskopische Probenentnahme und die Gewinnung von Vollstückbiopsien, die laparoskopisch oder laparotomisch als Stanzbiopsie oder durch chirurgische Resektion entnommen werden (NOLTE 1997; MENESES et al.

2003; BILZER 2006; EVANS et al. 2006) Die endoskopische Bioptatgewinnung ist ein minimalinvasiver Eingriff, bei dem Bioptate aus dem Magen, proximalen Anteilen des Dünndarms sowie dem Kolon entnommen werden können. Allerdings enthalten die Proben ausschließlich Anteile der Mukosa bis zur Lamina muscularis mucosae und können darüber hinaus nur aus den genannten Anteilen des Gastrointestinaltraktes entnommen werden. Ein entscheidender Nachteil der Endoskopie ist außerdem, dass Erkrankungen im Bauchhöhlenbereich, z.B. Serosawand des Magens, infiltrierende Tumoren, Peritonitis, Pankreatitis, Pankreasneoplasien, die die gleichen Symptome hervorrufen können, wie sie beim Vorliegen einer Gastritis, einer entzündlichen Enteritis oder einer Kolitis auftreten, mit diesem Untersuchungsverfahren nicht diagnostiziert werden können (NOLTE 1997).

Veränderungen der Mukosa, wie Zerreißbarkeit des Gewebes, Ödem, Erythem oder granuläres, kopfsteinpflasterartiges Aussehen deuten auf eine entzündliche Reaktion hin (WILLARD 1999). Jedoch können auch Bereiche, die bei der endoskopischen Untersuchung

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unauffällig waren, deutliche histopathologische Abweichungen aufweisen (DENNIS et al.

1992). Offensichtliche Läsionen wie Erosionen oder Ulzerationen sind bei der Katze selten und, sofern vorhanden, nicht pathognomonisch (TAMS 1986a; DENNIS et al. 1992, 1993;

BAEZ et al. 1999; WILLARD 1999; BILZER 2006). Die Laparotomie bietet die Vorteile einer transmuralen Bioptatgewinnung. Neben der Mukosa können so auch die Tela submucosa, Tunica muscularis und die Serosa histopathologisch beurteilt werden. Vor allem in Fällen mit lymphoplasmazellulärer IBD ist dadurch eine bessere Abgrenzung zur wichtigsten Differentialdiagnose, dem diffusen intestinalen Lymphom, möglich (TAMS 1986a; EVANS et al. 2006). Darüber hinaus können Proben auch aus Jejunum und Ileum entnommen und histopathologisch beurteilt werden (TAMS 1987; VAN DER GAAG 1988;

VAN DER GAAG u. HAPPÉ 1990; WILCOCK 1992; TAMS 2003). KLEINSCHMIDT et al.

(2006) konnten in einer retrospektiven Studie an transmuralen Bioptaten des Gastrointestinaltraktes von Hunden mit klinischen Symptomen einer chronischen Enteropathie zeigen, dass die histopathologische Diagnosestellung bei transmuralen Bioptaten im Vergleich zu endoskopisch gewonnenen Gewebeproben sicherer ist. Dies gilt den Autoren zufolge vor allem für die Diagnose von diffusen intestinalen Lymphomen.

2.2.1.2 Histopathologische Veränderungen

Wie bereits erwähnt, ist die Infiltration der Lamina propria und zu Teil auch der Tela submucosa und Tunica muscularis mit unterschiedlichen Immunzellen ein charakteristisches Merkmal der entzündlichen Reaktion für zum Formenkreis der IBD gehörender Darmerkrankungen (TAMS 1986a, 1993, 2003; NELSON et al. 1984; GHERMAI 1989;

DENNIS et al. 1992, 1993; LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997; GUILFORD 1996b;

MENESES et al. 2003). Das Entzündungszellinfiltrat kann aus Lymphozyten, Plasmazellen, Makrophagen und/oder eosinophilen und neutrophilen Granulozyten bestehen (TAMS 1986a, 1987, 1993, 2003; GHERMAI 1989; JERGENS et al. 1992; WILCOCK 1992; GUILFORD 1996b; LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997; JERGENS 1999; TAMS 2003; JERGENS 2004). Die Klassifizierung der IBD erfolgt anhand des entzündlichen Infiltrates und des betroffenen Darmabschnittes (GUILFORD 1996b; GERMAN et al. 2003; MENESES et al.

2003) (siehe Abschnitt 2.2.2: Klassifikation der IBD-Formen).

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Neben den entzündlichen Infiltraten können jedoch zahlreiche weitere Veränderungen in der Mukosa auftreten (TAMS 1986a; GHERMAI 1989; ROTH et al. 1990; DENNIS et al. 1992, 1993; WILCOCK 1992; LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997; JERGENS 2002, 2003;

KLEINSCHMIDT et al. 2006). Abweichende Befunde der Gewebemorphologie können im Epithel, an den Zotten, an den Krypten sowie in der Lamina propria auftreten oder die Mukosa insgesamt betreffen (BARLOUGH et al. 1981; VAN DER GAAG 1988; VIBE- PETERSEN 1991; WILCOCK 1992; DENNIS et al. 1992, 1993; LECOINDRE u.

CHEVALLIER 1997; TAMS 2003; WALY et al. 2004; KLEINSCHMIDT et al. 2006).

Zu den Veränderungen des Darmepithels, die bei IBD vorkommen können, gehören Hypertrophie, Abflachungen oder Degenerationen von Epithelzellen sowie Erosionen und Ulzerationen. Teilweise kommen vermehrt intraepitheliale Lymphozyten oder vermehrt Mitosen von Epithelzellen vor. Zuweilen kann im Kolon ein Becherzellverlust auftreten.

Abweichungen der Zottenmorphologie stellen sich als verkürzt aussehende, plumpe Zotten bis hin zur Zottenatrophie sowie als Zottenfusionen dar. Zu den Veränderungen der Kryptenmorphologie, die bei IBD vorkommen können, gehören Kryptendilatationen sowie Kryptenabszesse mit Ansammlung neutrophiler Granulozyten in den Lumina. In schwerwiegenden Fällen kommt es zu Kryptenverlusten. Durch Ödematisierung oder Infiltration der Lamina propria mit Entzündungszellen können die Krypten auseinander gedrängt und von der Lamina muscularis mucosae abgehoben werden. Lymphangiektasien können in der Mukosa, Submukosa und/oder der Tunica muscularis sowie transmural auftreten. Das Gesamterscheinungsbild der Mukosa kann durch Atrophie oder Hypertrophie geprägt sein. Infolge lang anhaltender Entzündungsreaktionen entstehen Fibrosierungen in der Mukosa (BARLOUGH et al. 1981; VAN DER GAAG 1988; VIBE-PETERSEN 1991;

WILCOCK 1992; DENNIS et al. 1992, 1993; LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997; TAMS 2003; WALY et al. 2004; KLEINSCHMIDT et al. 2006).

Bei der lymphoplasmazellulären Form der IBD kann die Abgrenzung zum diffusen intestinalen Lymphom schwierig sein. Bei beiden Erkrankungen kommen, neben einer Infiltration der Mukosa mit Lymphozyten, zahlreiche Veränderungen der Gewebearchitektur wie Zottenatrophie und –fusion und Kryptenverlust vor (WILCOCK 1992; WASMER et al.

1995; KRECIC und BLACK 2000; TAMS 2003; CARRERAS et al. 2003; WALY et al.

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2005). Frühere Arbeiten beschreiben als Kennzeichen eines diffusen intestinalen Lymphoms Parameter wie Infiltration extraintestinaler Organe, Uniformität der Lymphozytenpopulation, zahlreiche Mitosen sowie progressive Infiltration bis in die Tunica muscularis und die Serosa hinein (WILCOCK 1992; TAMS 2003). WALY et al. (2005) konnten jedoch in einer retrospektiven Studie an Katzen mit intestinalem Lymphom mittels immunhistochemischer Färbungen zeigen, dass auch Lymphome mit gemischtem B- und T- Zellphänotyp vorkommen. Mitosen traten, den Autoren zufolge, relativ selten auf. In einigen Fällen wurde aufgrund der immunhistochemischen Untersuchungsergebnisse die Diagnose eines Lymphomes revidiert, und es wurde stattdessen ein inflammatorischer Prozess festgestellt.

Die Autoren empfehlen daher zur Differenzierung zwischen entzündlichen Veränderungen und diffusen intestinalen Lymphomen immunhistochemische Untersuchungsmethoden zu verwenden. Bei endoskopisch entnommenen Bioptaten ist zu beachten, dass diese maximal bis zur Tela submucosa reichen und daher eine Infiltration tieferer Gewebeschichten mit Tumor- oder Entzündungszellen, wie der Tunica muscularis, nicht erkannt werden kann (WILCOCK 1992; TAMS 2003).

2.2.1.3 Befundinterpretation

Wie bereits erwähnt, bestehen hinsichtlich der histopathologischen Diagnosen z. T. erhebliche Varianzen zwischen verschiedenen Untersuchern (WILLARD 2002). Dies hat in der Vergangenheit mehrere Autoren veranlasst, histologische Beurteilungsschemata für intestinale Gewebeproben von Katzen und Hunden zu erstellen (JERGENS et al. 1992;

WILCOCK 1992; DENNIS et al. 1992, 1993; LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997; WALY et al. 2004; ROTTER 2005; BILZER 2006; MÜNSTER et al. 2006). Bislang konnte sich allerdings keines dieser Schemata allgemein durchsetzen. Daher gründete die World Small Animal Veterinary Association (WSAVA) die Gastrointestinal Standardization Group mit dem Ziel, eine international anerkannte und verbindliche Klassifikation für die histologische Beurteilung gastrointestinaler Bioptate von Katzen und Hunden zu formulieren. Die Artikel sollen in gebundener Form, in Fachzeitschriften sowie im Internet veröffentlicht werden, stehen derzeit jedoch noch nicht zur Verfügung (BILZER 2006).

Eine Graduierung der histopathologischen Befunde bei IBD in gering-, mittel- oder hochgradige Veränderungen erfolgt im Allgemeinen unter Berücksichtigung der Ausprägung

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und der Kombination verschiedener Veränderungen wie Zellinfiltrationen und/oder Architektur- und Epithelveränderungen (HART et al. 1994; JERGENS 2002; ROTTER 2005). Die meisten Untersucher sprechen von einer geringgradigen entzündlichen Veränderung, wenn eine Entzündungszellinfiltration ohne weitere Abweichungen der Gewebemorphologie vorliegt (ROTH et al. 1990; DENNIS et al. 1992, 1993; WEISS et al.

1996; TAMS 2003). Anderen Autoren zufolge sind darüber hinausgehende geringgradige Abweichungen der normalen Gewebemorphologie, wie geringgradig plump erscheinende Zotten, mäßiges Ödem und/oder Fibrose, vereinzelte neutrophile Granulozyten oder vermehrt intraepitheliale Lymphozyten, noch als geringgradige Entzündungserscheinungen zu klassifizieren (LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997; ROTTER 2005; BILZER 2006;

MÜNSTER et al. 2006). Mittelgradige entzündliche Veränderungen liegen, den meisten Untersuchern nach, bei vermehrtem entzündlichem Infiltrat in Verbindung mit Architekturveränderungen der Gewebemorphologie vor. Dazu gehören die Auseinanderdrängung von Krypten durch Infiltrate, Ödem oder Fibrose, verstärkt plump aussehende Zotten, Epithelabflachung, Epithelunreife oder Nekrosen von Epithelzellen sowie vermehrt intraepitheliale Lymphozyten. Bei einer mittel- bis hochgradigen Infiltrationen der Mukosa mit Entzündungszellen in Kombination mit Architekturveränderungen des Gewebes, die über die oben genannten hinausgehen, spricht die Mehrheit der Autoren von hochgradiger Darmentzündung. Dazu zählen Veränderungen wie ausgeprägte Auseinanderdrängung von Krypten durch Infiltrate, Ödem und/oder Fibrosen, deutliche Zottenatrophie und/oder –fusion, Kryptenatrophien und/oder Verlust von Krypten sowie Erosionen und Ulzerationen (ROTH et al. 1990; DENNIS et al. 1992, 1993; WEISS et al. 1996; LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997; TAMS 2003; ROTTER 2005; BILZER 2006; MÜNSTER et al. 2006).

2.2.2 Klassifikation der IBD-Formen bei Katze und Hund

Die Klassifizierung der IBD erfolgt einerseits nach dem Typ des entzündlichen Infiltrates, andererseits nach dem betroffenen Bereich des Intestinaltraktes (GUILFORD 1996b;

GERMAN et al. 2003; MENESES et al. 2003). Außer dem jeweiligen entzündlichen Infiltrat finden sich bei allen IBD Formen mehr oder weniger stark ausgeprägte Veränderungen des Epithels, der Zotten und/oder der Kryptenmorphologie sowie Abweichungen von der normalen Gewebetextur in der Lamina propria (siehe Abschnitt 2.2.1.2: Histopathologische Veränderungen). Die entzündlichen Veränderungen können auf den Dünndarm beschränkt

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sein (Enteritis), bestimmte Abschnitte des Dünn- oder Dickdarms betreffen (Duodenitis, Jejunitis, Ileitis, Kolitis) oder Dünndarm und Kolon insgesamt (Enterokolitis) einbeziehen.

Enterokolitiden können bei der Katze zwar vorkommen, häufiger ist jedoch nur der Dünndarm betroffen (TAMS 2003). Zwischen den verschiedenen Formen der IBD kann es Überschneidungen geben, so dass nicht jede chronische idiopathische entzündliche Enteropathie endgültig klassifiziert werden kann. Bei der Katze werden die lymphoplasmazelluläre Enteritis und Kolitis, die eosinophile Enteritis, das hypereosinophile Syndrom, die eosinophile granulomatöse Gastroenterokolitis, die chronische eitrige Kolitis, die granulomatöse Enteritis, Enterokolitis oder Kolitis sowie die transmurale granulomatöse Enterokolitis unterschieden.

Neben den genannten Formen gibt es beim Hund weitere Erkrankungen, die dem Formenkreis der IBD zuzurechnen sind und für die offensichtlich eine genetische Prädisposition besteht.

Dazu gehören die histiozytäre ulzerative Kolitis (histiocytic ulcerative Colitis - HUC) des Boxers, die immunproliferative Enteropathie des Basenjihundes sowie das Diarrhoe-Syndrom des norwegischen Lundehundes. Derartige rassespezifische Erkrankungen, die dem Formenkreis der IBD zugerechnet werden, sind bei der Katze nicht bekannt.

2.2.2.1 Lymphoplasmazelluläre Enteritis und Kolitis

Die häufigste Form der IBD bei Katze und Hund ist die lymphoplasmazelluläre Enteritis (LPE), lymphoplasmazelluläre Kolitis (LPK) oder lymphoplasmazelluläre Enterokolitis (LPEK). Klinisch stehen Vomitus und Diarrhoe, aber auch zahlreiche weitere Symptome wie Gewichtsverlust und Hypoproteinämie im Vordergrund (GHERMAI 1989; DENNIS et al.

1992, 1993; JERGENS 1992; WILCOCK 1992; TAMS 1993; GUILFORD 1996b;

LECOINDRE u. CHEVALLIER 1997; WILLARD 1999; TAMS 2003; CRAVEN et al.

2004). Beim Hund werden Rasseprädispositionen für den Deutschen Schäferhund, den Shar Pei und den Boxer angegeben (VAN DER GAAG 1988). Derartige Rasseprädispositionen sind bei der Katze bislang nicht beschrieben worden. DENNIS et al. (1992, 1993) berichten allerdings von einer Häufung bei Rassekatzen im Allgemeinen. Sowohl bei der Katze als auch beim Hund sind in der Regel Tiere mittleren und höheren Alters betroffen (VAN DER GAAG u. HAPPÉ 1990; DENNIS 1992, 1993). Die histologischen Veränderungen sind gekennzeichnet durch eine Infiltration der Mukosa mit Lymphozyten und Plasmazellen.

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Vereinzelt können auch eosinophile oder neutrophile Granulozyten sowie Makrophagen vorkommen. Des Weiteren werden die erwähnten variablen Veränderungen der Gewebemorphologie, wie vermehrte intraepitheliale Lymphozyten, Architekturveränderungen der Mukosa oder Epithelschädigungen beobachtet (siehe Abschnitt 2.2.1.2:

Histopathologische Veränderungen) (WILCOCK 1992; JERGENS 2002, 2003; TAMS 2003).

Differentialdiagnostisch ist vor allem das diffuse intestinale Lymphom zu berücksichtigen (WILCOCK 1992; TAMS 2003).

2.2.2.2 Eosinophile Gastroenteritis, Enteritis, Enterokolitis und Kolitis

Die eosinophile Gastroenterokolitis ist die zweithäufigste Form der IBD bei Katze und Hund.

Hypersensivitätsreaktionen gegenüber Futtermittelallergenen oder Parasiten könnten die pathogenetische Grundlage der Erkrankung darstellen. Jedoch kann die Erkrankung nicht in allen Fällen durch Eliminationsdiäten oder Antiparasitika günstig beeinflusst werden. Fälle von eosinophiler Enteritis unbekannter Unrasche werden daher dem Formenkreis der IBD zugeordnet (GUILFORD 1996b). Histologisch ist die eosinophile Gastroenterokolitis der lymphoplasmazellulären Form sehr ähnlich mit dem Unterschied, dass eosinophile Granulozyten den herausragenden Anteil des entzündlichen Infiltrates darstellen (WILCOCK 1992; TAMS 1993, 2003). Die Infiltration ist meistens diffus und erstreckt sich häufig auch in tiefere Gewebeschichten wie die Tela submucosa (WILCOCK 1992). Je nach betroffenem Abschnitt des Gastrointestinaltraktes liegt eine Gastroenteritis, Enteritis oder Kolitis vor.

Differentialdiagnostisch müssen gastrointestinale Parasiten, Futtermittelallergien und Mastzelltumore ausgeschlossen werden.

Von der eosinophilen Gastroenterokolitis ist das hypereosinophile Syndrom der Katze zu differenzieren. Dieses stellt eine seltene, aber lebensbedrohliche Form der IBD dar, die mit einer massiven Infiltration des Darms mit eosinophilen Granulozyten und anderen Entzündungszellen, aber auch extraintestinaler Organe, wie Leber, Nieren, Milz, Lymphknoten, Herz oder Knochenmark, einer Blut-Eosinophilie sowie oft hochgradiger Verdickung der Darmwand einhergeht (TAMS 1993, 2003). Die Erkrankung kommt vorwiegend bei über 7 Jahre alten Tieren vor. Klinische Erscheinungen sind den unter 2.2.2.1 genannten IBD Formen ähnlich, darüber hinaus treten jedoch verstärkt Verdickungen der Darmwand, Hepatomegalie und Hämatochezie auf (GUILFORD 1996b).

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2.2.2.3 Eosinophile granulomatöse Gastroenterokolitis

Diese Erkrankung ist durch das Vorkommen von aus mehrheitlich eosinophilen Granulozyten bestehenden Granulomen in Ösophagus, Magen, Dünn- und/oder Dickdarm gekennzeichnet.

Die Granulome lassen sich oftmals sonographisch darstellen, endoskopisch sind häufig fokale Verdickungen der Mukosa vorhanden. Derartige Granulome können sich transmural ausbreiten und so zu intestinalen Obstruktionen führen. Klinisch zeichnet sich die Erkrankung vor allem durch Erbrechen aus. Sie tritt vorwiegend bei jüngeren Hunden auf, und eine Rasseprädisposition wird für den Rottweiler angegeben. Bei der Katze wird von ähnlichen Veränderungen auch in der Mundhöhle und an den Lippen berichtet (GUILFORD 1996b).

BRELLOU et al. (2006) beschrieben erstmals einen Fall von eosinophiler granulomatöser Gastroenteritis und Hepatitis unbekannter Ursache bei einem Siberian Husky.

2.2.2.4 Chronische eitrige Kolitis

Neutrophile Granulozyten nehmen bei den meisten chronischen intestinalen Darmentzündungen höchstens einen kleinen Anteil des entzündlichen Infiltrates ein. Sie deuten in der Regel auf eine bakterielle Beteiligung hin und begleiten die zelluläre Immunantwort bei einer akuten Entzündungsreaktion im Gastrointestinaltrakt (WILCOCK 1992; GUILFORD 1996b). Es sind jedoch auch Fälle von chronischen Kolitiden beschrieben, bei denen neutrophile Granulozyten einen großen oder gar den überwiegenden Anteil des Infiltrates ausmachen. Die Erkrankung tritt anscheinend vorwiegend im felinen Kolon auf und trägt daher die Bezeichnung „chronische eitrige Kolitis“. Differentialdiagnostisch sind vor allem Infektionen mit enteropathogenen Erregern wie Salmonella sp., Clostridium sp., E. coli, Yersinia sp., Proteus sp. u.a. zu berücksichtigen. Als weitere Ursache werden zudem auch Reaktionen auf chronische Abrasionen durch aufgenommene Haare angenommen (GUILFORD 1996b; LEIB et al. 1986).

2.2.2.5 Histiozytäre ulzerative Kolitis des Boxers

Die histiozytäre ulzerative Kolitis oder granulomatöse Kolitis des Boxers kommt vorwiegend bei Boxern unter 4 Jahren vor, ist jedoch auch bei einigen anderen Rassen beschrieben worden. Sie ist gekennzeichnet durch die Infiltration der Mukosa und Submukosa des Kolons mit PAS (periodic acid shift) positiven Makrophagen; daneben können auch Lymphozyten und Plasmazellen Bestandteil des entzündlichen Infiltrates sein. Im Rahmen der

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entzündlichen, granulomatösen Veränderungen kommt es in den betroffenen Bereichen zu starken Wandverdickungen und Ulzerationen (GERMAN et al. 2000b, 2003; STOKES et al.

2001; TANAKA et al. 2003; HOSTUTLER et al. 2004; VAN KRUININGEN et al. 2005;

SIMPSON et al. 2006). Das in den Makrophagen befindliche PAS positive Material besteht aus lipidreichen, überwiegend cholesterolhaltigen Membranen der Phagolysosomen.

Bisweilen enthalten die Makrophagen zusätzlich Bakterien. Neuere Untersuchungen von VAN KRUININGEN et al. (2005) zeigten mittels immunhistochemischer Färbungen mit einem polyklonalen Antikörper gegen Escherichia coli-Antigene positive Reaktionen in Gewebeschnitten aus dem Kolon von betroffenen Boxern. Darüber hinaus konnten SIMPSON et al. (2006) in einer weiteren Untersuchung mittels in situ Hybridisierung und Infektionsversuchen in der Zellkultur adhärente und invasive E. coli Erreger in Kolonbioptaten von an HUC erkrankten Boxern nachweisen. Der Erreger zeigte, den Autoren zufolge, Parallelen zu einem Escherichia coli (LF82) Stamm, der mit Morbus Crohn, einer der beiden IBD Formen des Menschen, in ätiologischen Zusammenhang gebracht wird. Bei der Katze ist eine derartige histiozytäre ulzerative Kolitis mit PAS positiven Makrophagen bisher nicht beschrieben worden.

2.2.2.6 Transmurale granulomatöse Enterokolitis (regionale Enteritis)

Die transmurale granulomatöse Enterokolitis (regionale Enteritis) ist eine seltene Erkrankung aus dem Formenkreis der IBD, die jedoch anscheinend häufiger bei der Katze als beim Hund vorkommt. Sie ist durch segmentale, transmurale, granulomatöse, nekrotisierende und ulzerierende Wandverdickungen des Ileums und Kolons gekennzeichnet (WILCOCK 1992).

Klinisch zeichnet sich die Erkrankung durch schweren Vomitus mit Hämatemesis, Gewichtsverlust und Obstipation durch Obstruktionen des Ileums, Kolons oder Rektums in Folge der granulomatösen Zubildungen aus. Palpatorisch können abdominal manchmal Umfangsvermehrungen in der Ileozäkalregion festgestellt werden. Bisweilen können bei rektaler Palpation Wandverdickungen oder Strikturen ertastet werden. Granulomatöse Entzündungen der Perianalregion können zu Fistelbildung führen. Im Rahmen einer Kolonoskopie werden häufig fokal oder multifokal Areale mit mukosaler Proliferation in Verbindung mit Ulzerationen und Einengungen des Lumens festgestellt. Zusätzlich zu den für die granulomatöse Enteritis genannten Differentialdiagnosen müssen Neoplasien, parasitäre

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Granulome und Campylobacter-assoziierte proliferative Enteritiden ausgeschlossen werden (GUILFORD 1996b).

2.2.2.7 Granulomatöse Enteritis, Kolitis und Enterokolitis

Eine weitere seltene Form der IBD ist die idiopathische granulomatöse Enteritis. Histologisch zeichnet sie sich durch eine Infiltration der Lamina propria mit Makrophagen aus, die allerdings, im Gegensatz zur histiozytären ulzerativen Kolitis beim Boxer, kein PAS positives Material enthalten (GUILFORD 1996b; BROWN et al. 2007). Die klinischen Symptome ähneln den zuvor für die anderen IBD-Formen genannten. Die wichtigste Differentialdiagnose bei der Katze ist die feline infektiöse Peritonitis (FIP), aber auch Phykomykose oder Tuberkulose sind, vor allem im Vorfeld einer immunsuppressiven Therapie, zu berücksichtigen (GUILFORD 1996b).

2.2.2.8 Immunproliferative Enteropathie des Basenjihundes

Bei der immunproliferativen Enteropathie des Basenjihundes handelt es sich um eine Erkrankung des Dünndarmes, die mit chronischer Diarrhoe einhergeht. Histopathologisch ist sie durch lymphoidzellige Infiltration und mukosale Hypertrophie vor allem im proximalen Bereich des Gastrointestinaltraktes gekennzeichnet. Darüber hinaus treten regelmäßig Zottenatrophie und -fusionen auf (GUILFORD 1996b; GERMAN et al. 2003). Von der LPE unterscheidet sie sich durch ihre Rasseprädisposition für den Basenji sowie durch meist schwerwiegende Entzündungserscheinungen mit progressivem oder rezidivierendem Verlauf.

Da die Erkrankung mit hoher Prävalenz und ausschließlich beim Basenji vorkommt, werden genetische Faktoren in Zusammenhang mit Umwelteinflüssen als ätiologische Auslöser diskutiert (GUILFORD 1996b).

2.2.2.9 Diarrhoe-Syndrom des norwegischen Lundehundes

Das Diarrhoesyndrom des Lundehundes ähnelt klinisch und histologisch der lymphoplasmazellulären Enteritis, verläuft im Unterschied zu dieser jedoch stets progressiv und zeigt eine starke genetische Prädisposition für diese Rasse (GUILFORD 1996b).